Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведены испытания 406 образцов вида Linum usitatissimum L. в полевых условиях, посев проведен по типу луночного питомника с площадью питания 1 растения для льна-долгунца 2,5 х 2,5 см и льна масличного - 2,5 х 5,0 см. В результате оценки репрезентативной выборки из мирового генофонда культуры, куда вошли отечественные и зарубежные сорта, селекционные линии прядильного и масличного льна, местные и кряжевые формы различного эколого-географического происхождения, установлен диапазон изменчивости основных морфологических признаков, определяющих продуктивность семян и волокна, что важно для создания специализированных сортов льна различного назначения. Впервые показано, что важнейшим источником по признакам «сбег» стебля и «длина элементарного волокна» являются кряжевые формы льна-долгунца из России. Установлено, что подавляющее большинство образцов масличного льна имеют низкий «сбег» стебля, следовательно, повышенные его значение у современных сортов льна-долгунца являются результатом искусственного отбора. Наибольшими значениями по данному признаку обладают преимущественно сорта льна-долгунца китайской селекции. Из генофонда масличного льна выявлены высокорослые образцы с повышенным содержанием волокна в стебле и повышенной длиной элементарных волокон, что позволяет рассматривать данную культуру, как дополнительный источник волокнистого сырья. Исследованы культуральные и вирулентные свойства штаммов гриба Fusarium oxysporum f. lini №№ 282, 283, 287, 324, 329 и моноизолята № 39.2.1 из «Коллекции микроорганизмов - возбудителей болезней льна». Установлено, что данные биообразцы различаются по культурально-морфологическим признакам и являются высоковирулентными. В результате оценки образцов мирового генофонда льна из 41 страны мира на устойчивость к фузариозному увяданию на инфекционном фоне с моноизолятом № 39.2.1 F. oxysporum f. lini выявлено: устойчивых - 148 образцов (36,5 %), слабовосприимчивых –25 (6,1 %), средневосприимчивых – 88 (21,7 %), сильновосприимчивых - 145 (35,7%). Из проанализированных 229 образцов льна-долгунца на долю высокоустойчивых генотипов приходится 38,9 %, а из 177 образцов льна масличного - 33,3 %. Это преимущественно сорта и селекционные линии льна-долгунца из России, Р.Беларусь, Польши, Чешской Республики, Японии и Китая, а также льна масличного - из Китая, Канады и США, что указывает на высокую результативность селекции прядильного и масличного льна на устойчивость к данному наиболее вредоносному заболеванию в этих странах. На территории Института льна (г. Торжок) в период с 25 по 26 июня 2019 года было собрано 406 образцов листьев льна (Linum usitatissimum L.). Из собранных образцов была выделена геномная ДНК. Целостность и чистота ДНК, а также концентрация и общий объем позволят провести генотипирование путем секвенирования для каждого образца и дополнительно сделать полногеномное секвенирование части образцов коллекции. Чистая геномная ДНК выделена из сильновирулентных штаммов Fusarium oxysporum f. lini №№ 282, 287, 324, 329 и моноизолята 39. ДНК моноизолята 39 была секвенирована в Университете штaта Орегон, Centre for Genome Research and Biocomputing по технологии PacBio, и ДНК из всех 5 штаммов была секвенированa по технологии Illumina компанией Novogene (Novogene Corporation Inc. ). Проведен анализ данных секвенирования патогенного штамма F391 Fusarium oxysporum f. sp. lini, секвенированного при помощи различных протоколов PacBio и Illumina , а также осуществлена сборка референсного генома гибридным методом. Анализ собранных фрагментов показал их высокое качество (уровень покрытия родственного генома, низкий уровень дупликаций и фрагментации) и применимость для дальнейших исследований по проекту. Oсуществлена сборка геномов 4 вирулентных штаммов Fusarium oxysporum f. sp. lini F329, F32, F282, F287, секвенированных по технологии Illumina. Получены последовательности высокого качества, которые будут в дальнейшем использованы для анализа организации генома гриба.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Мы показали, что геном F.oxysporum f. sp. lini подразделяется более чем на два компартмента с разными структурными характеристиками и эволюционной историей. В отличие от генов домашнего хозяйства, члены семейства генов SIX демонстрируют кластеризацию, связанную с хозяином, как показывает филогенетический анализ, что указывает на сильную адаптацию к хозяину. В этом контексте ген SIX7 представляет особый интерес, поскольку его копии расположены на разных хромосомах и он отсутствует в других 4 секвенированных штаммах FOLINI, что указывает на относительно недавнее происхождение и дупликацию этого гена. Функциональный анализ репертуара белков f.spp F. oxysporum показывает доминирующую роль вариабельного компартмента в диверсификации formae specialis. Примечательно, что основной вклад в дивергенцию протеома вносят домены PFAM, связанные со связыванием с ДНК и мобилизацией мобильных элементов, что, возможно, указывает на активную транскрипцию и текущую перетасовку генома в вариабельном компартменте. С использованием технологий PacBio и Illumina секвенированы геномы трех слабовирулентных штаммов F.xysporum f.sp. lini. Успешно отсеквенированы с различными уровнями покрытия 406 образцов льна из коллекции. Получены генетические варианты, позволяющие охарактеризовать генетическое разнообразие сортов а также разработаны системы конвейерной обработки данных для поиска генетических вариантов. Проведены испытания 405 образцов вида Linum usitatissimum L. в полевых условиях, посев проведен с площадью питания 1 растения для льна-долгунца 2,5 х 2,5 см и льна масличного - 2,5 х 5,0 см. В результате оценки репрезентативной выборки из мирового генофонда культуры, куда вошли отечественные и зарубежные сорта, селекционные линии прядильного и масличного льна, местные и кряжевые формы различного эколого-географического происхождения, установлен следующий диапазон изменчивости основных морфологических признаков, определяющих продуктивность семян и волокна: высота растений – 46,2…116 см, вес технической части 1 растения –128,7…976,7 мг., масса волокна – 32,6…225,2 мг., содержание волокна в стебле – 17,46…41,90 %, количество коробочек – 1,0…16,0 шт. и семян – 8,0…125,8 шт. на растении, масса 1000 семян – 3,60…8,00 г., содержание масла в семенах – 34,1…45,60 %. Впервые проведен скрининг мирового генофонда культуры по «нетрадиционным признакам», определяющим качество волокна, и выявлена их изменчивость в зависимости от генотипа: «сбег» – 0,20…0,81 мм и «мыклость» стебля – 181,3…861,8 ед, длина элементарного волокна – 9,52…17,26 мм, что важно для создания специализированных сортов льна различного назначения. Из генофонда масличного льна впервые выявлены высокорослые образцы – 81,3…93,5 см с повышенным содержанием волокна в стебле – 25,54…30,11 % и повышенной длиной элементарных волокон 14,20…15,59 мм, что позволяет рассматривать данную культуру, как дополнительный источник волокнистого сырья. В результате оценки образцов льна выделено: устойчивых (поражение фузариозным увяданием от 0 до 20 %) – 161 (39,8 %), слабовосприимчивых – 22 (5,4 %), средневосприимчивых – 55 (13,6 %), сильновосприимчивых – 167 (41,2%) образцов. Из проанализированных 232 образцов льна-долгунца на долю высокоустойчивых генотипов приходится 45,3 %, а из 173 образцов льна масличного – 45,1 %. Это преимущественно сорта и селекционные линии льна-долгунца из России, Р.Беларусь, Польши, Чешской Республики, Японии и Китая, а также льна масличного – из Китая, Канады и США, что указывает на высокую результативность селекции прядильного и масличного льна на устойчивость к данному наиболее вредоносному заболеванию в этих льносеющих странах. Проведен статистический анализ фенотипических признаков образцов мировой коллекции льна (Linum usitatissimum L) по результатам оценки в 2019 году . После обработки фенотипических данных алгоритмом уменьшения размерности tSNE установлено, что все образцы мировой коллекции льна по степени фенотипической схожести образуют три группы: к первой относятся лен-кудряш, межеумки, крупносемянные формы и стелющийся лен; вторая представлена, преимущественно, современными сортами и культурными линиями льнов долгунцов; третья – кряжевыми и местными формами льнов долгунцов. С целью индуцирования генотипической изменчивости проведено выращивание различных сортов льна-долгунца (опыт 1 – Liral Prince, Северная Ирландия; Д-1444-66, Украина; Nike, Польша; Атлант, Г-1071/7, Россия; опыт 2 – Liral Prince, Д-1444-66 и Nike) на селективных фонах, различающихся по минеральному питанию: 1 вариант – контроль (без внесения удобрений), 2 вариант – внесение в почву 1,5 % раствора тройного суперфосфата и 3 вариант – 1,5 % раствора сульфата аммония. Получен семенной материал для проведения дальнейших исследований по выявлению генотрофов льна. Отработана методика получения корней зараженных сильновирулентным штаммом Fusarium oxysporum f. sp. lini растений льна культурного (Linum usitatissimum L.) in vitro. Зараженные корни были успешно использованы для анализа уровней экспрессии генов интереса в системе «растение-патоген». Методом ПЦР продемонстрирована специфическая экспрессия генов гриба в растении, что позволяет говорить об эффективности подобранных праймеров и избранного метода заражения растений.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Выполнены секвенирование и сборка 3 геномов слабо вирулентных штаммов Fusarium oxysporum f.sp. lini. Для обеспечения согласованности в анализе, геномы ранее собранных 4 штаммов, отсеквенированных только с использованием коротких прочтений, были собраны заново с использованием обновлённого программного обеспечения RagTag. Новые алгоритмы предсказания кодирующих последовательностей, реализованные в программе BUSCO (алгоритм metaEUK как альтернатива Augustus, использовавшегося в предыдущих версиях) позволили существенно повысить качество аннотации геномов и кодирующих участков. Используя однонуклеотидные полиморфизмы, мы охарактеризовали генетическое разнообразие в коллекции из 306 образцов льна из Федерального научного центра лубяных культур. Коллекция включает сорта льна из Евразии с большой долей унаследованных русских местных форм, что отличает ее от коллекций, используемых в предыдущих генетических исследованиях. Мы наблюдали значительную дифференциацию популяций масличного льна и льна‒долгунца. Образцы льна-долгунца имеют сильное родство друг с другом, что особенно заметно для кряжевых форм. Неравновесное сцепление у льна убывает значительно быстрее, чем у сои и риса, что означает, что процесс скрининга генов‒кандидатов, контролирующих важные агрономические признаки, будет упрощен, что важно для селекционных программ. Области генома, маркированные сигналами недавней селекции, заметно отличаются у долгунцов и масличных форм, что особенно заметно для хромосом 6 и 15. В этом исследовании мы впервые попытались всесторонне охарактеризовать кряжи, староместные сорта русского происхождения, чтобы пролить свет на их селекционную историю и их связь с современными сортами льна-долгунца. Наши результаты предоставляют убедительные доказательства интрогрессии генетического материала азиатских, русских и, что важно, европейских местных форм в кряжи, подтверждая гипотезу о смешанном происхождении кряжей как из Индо-афганского центра разнообразия, так и из Плодородного полумесяца. Предки современных сортов льна-долгунца также включают местные формы разного происхождения, но вклад русских местных форм и кряжей является наиболее значительным. В качестве первого шага к выявлению генетических факторов, связанных с устойчивостью к фузариозному увяданию, мы провели полногеномный поиск ассоциаций (GWAS) с использованием 297 образцов из коллекции Федерального научного центра лубяных культур, Торжок, Россия. Эти генотипы были инфицированы высоко патогенным штаммом MI39 Fusarium oxysporum f. sp. lini; симптомы заражения регистрировались в течение трех лет подряд. Шесть различных однолокусных моделей, реализованных в пакете GAPIT3 R, были применены к выбранному подмножеству из 72 526 SNP. Всего 15 QTN (нуклеотидов количественных признаков), было обнаружено в течение как минимум двух лет наблюдений, а 8 QTN стабильно обнаруживались при анализе по трем годам. Из них десять QTN занимали область размером 640 т.п.н. в начале хромосомы 1, в то время как остальные QTN локализовались на хромосомах 8, 11 и 13. Все стабильные QTN демонстрируют статистически значимый аллельный эффект по всем 3 годам эксперимента. Важно отметить, что несколько QTN попадают в области, в которых находятся гены, участвующие в распознавании патогенов и иммунном ответе растений, включая KIP1-подобный белок (Lus10025717) и белок NBS-LRR (Lus10025852). Наши результаты позволяют по-новому взглянуть на генетическую архитектуру устойчивости льна к фузариозному увяданию и выявить потенциальные гены-кандидаты для дальнейших углубленных исследований. Анализ ассоциаций был проведен для всех 11 признаков, связанных с качеством волокна льна (Linum usitatissimum L.). Результаты GWAS с использованием шести разных однолокусных моделей выявили 206 значимо ассоциированных QTN, 21 из которых ассоциирован с несколькими признаками. Большинство QTN связаны с технической длиной (69 QTN), длиной элементарного волокна (49 QTN) и количеством волокна (33 QTN). При анализе генов в окрестностях QTN было обнаружено 9 потенциальных генов-кандидатов, ассоциированных с качеством волокна. Результы GWAS с использованием многопризнаковой модели GEMMA выявили 354 QTN. Анализ генов в окрестностях QTN c учетом значения LD для каждой хромосомы позволил обнаружить 30 потенциальных генов-кандидатов, ассоциированных с качеством волокна. Проведены испытания 405 образцов вида Linum usitatissimum L. в полевых условиях, посев проведен с площадью питания 1 растения для льна-долгунца 2,5 х 2,5 см и льна масличного - 2,5 х 5,0 см. В результате оценки репрезентативной выборки из мирового генофонда культуры, куда вошли отечественные и зарубежные сорта, селекционные линии прядильного и масличного льна, местные и кряжевые формы различного эколого-географического происхождения, установлен следующий диапазон изменчивости основных морфологических признаков, определяющих продуктивность семян и волокна: высота растений – 45,9…104,8 см, вес технической части 1 растения –112…995 мг., масса волокна – 19,4…173,2 мг., содержание волокна в стебле – 14,4…31,8%, количество коробочек – 1,4…22,6 шт. и семян – 8,0…156,1 шт. на растении. Впервые проведен скрининг мирового генофонда культуры по «нетрадиционным признакам», определяющим качество волокна, и выявлена их изменчивость в зависимости от генотипа: «сбег» – 0,20…0,81 мм и «мыклость» стебля – 160,1…637,1 ед, длина элементарного волокна – 8,0…16,5 мм, что важно для создания специализированных сортов льна различного назначения. Из генофонда масличного льна впервые выявлены образцы, не уступающие стандарту – сорту льна-долгунца Цезарь по признакам «высота растений», «техническая длина стебля» и «масса волокна», что позволяет рассматривать данную культуру, как дополнительный источник волокнистого сырья. При этом особую ценность представляют образцы Modares (Румыния) и к-2784 (Грузия), обладающие улучшенными прядильными свойствами за счет повышенной длины элементарных волокон и «мыклости» стебля. В результате оценки образцов льна на устойчивость к фузариозному увяданию выделено: устойчивых (поражение от 0 до 20 %) – 190 (46,9 %), слабовосприимчивых – 20 (4,9 %), средневосприимчивых – 63 (15,6 %), сильновосприимчивых – 132 (32,6 %) образца. Из проанализированных 233 образцов льна-долгунца на долю высокоустойчивых генотипов приходится 44,7%, а из 172 образцов льна масличного – 50,0 %. Это преимущественно сорта и селекционные линии льна-долгунца из России, Р. Беларусь, Польши, Франции, Японии и Китая, а также льна масличного – из Канады и США, что указывает на высокую результативность селекции прядильного и масличного льна на устойчивость к данному наиболее вредоносному заболеванию в этих льносеющих странах. Выявлено индуцирование генотипической изменчивости у селекционных линий и сортов льна-долгунца, выращенных при различном диапазоне температур на селективных фонах, различающихся по минеральному питанию: 1 вариант – контроль (без внесения удобрений), 2 вариант – внесение в почву 1,5 % раствора тройного суперфосфата и 3 вариант – 1,5 % раствора сульфата аммония, где основным контролем служил вариант, где посев осуществлялся семенами полученными при репродуцировании этих сортов в оптимальных агроклиматических условиях. При выращивании потомства исследуемых генотипов на оптимальном агрохимическом фоне, в варианте 2 по сравнению с основным контролем отмечалось существенное снижение высоты растений и веса технической части у селекционных форм Liral Prince (Великобритания), Д-1444-66 (Украина), Nike, (Польша) и Г-1071/7 (Россия), которое в зависимости от генотипа составило 13,2…26,4 и 30,7…49,6 % соответственно. У генотипов Liral Prince и Д-1444-66 в варианте 3 наблюдалось увеличение по сравнению с основным контролем вегетационного периода – на 3 и 6 суток, высоты растений – на 4,9 и 6,8 %, а также веса технической части стебля – на 19,7 и 25,6 %, соответственно. При этом сорт льна-долгунца Атлант проявил генетическую стабильность, отклонения от контроля в вариантах 2 и 3 были не значительными. Проанализированы транскроптомы двух сортов масличного льна, устойчивого Atalante и восприимчивого ЛМ 98, а также гриба Fusarium oxysporum f. sp. lini на 3 и 5 сутки заражения высоко вирулентным штаммом MI39. Установлено, что ответ на инфекцию у устойчивого сорта Atalante начинается раньше, чем у чувствительного сорта ЛМ 98. Существенную часть растительных генов с дифференциальной экспрессией при заражении патогеном составляют различные ферменты, по-видимому, принимающие участие в нейтрализации инфекции (например, хитиназа), а также общие факторы реакции на стресс. Аналогично, гены гриба начинают дифференциально экспрессироваться в чувствительном растении позднее, нежели чем в устойчивом. Оценка экспрессии 13 генов, намеченных по результатам полногеномного поиска ассоциаций в качестве кандидатов, потенциально вовлеченных в различные процессы, связанные с реакцией на патоген, показала, что все эти гены, за исключением одного, дифференциально экспрессируются при сравнении растений, зараженных штаммом MI39 и контрольных растений. Этот результат подтверждает функциональную значимость намеченных генов‒кандидатов и позволяет расставить приоритеты при их последующем детальном функциональном анализе. У 100 хорошо секвенированных геномов льна было проанализировано два типа структурной вариации: вариация присутствия/отсутствия генов (PAV) и вариация числа копий (CNV). Показано, что в геномах рассматриваемых образцов льна в сравнении с референсным геномом наблюдаются (1) делеции последовательностей (участков ДНК), (2) вставки новых последовательностей, (3) увеличение числа копий последовательностей. Функциональная аннотация соответствующих районов в референсном геноме и новых последовательностей показала, что они кодируют белки, участвующие в ответе растения на биотический и абиотический стрессы, в энергетическом обмене, вирусной и транспозонной активности, а также в формировании клеточных мембран. Выявленные функции могут свидетельствовать об адаптации сортов к региональным условиям выращивания посредством структурной изменчивости.