Аннотация результатов, полученных в 2019 году
С развитием высокоразрешающих полногеномных технологий продолжает активно накапливаться информация о новых структурных хромосомных аберрациях, лежащих в основе, так называемых хромосомных, болезней, проявляющихся разнообразными симптомами и сопровождающихся интеллектуальными расстройствами. Терапия таких заболеваний крайне сложна и заключается, прежде всего, в компенсации симптомов, но не окончательном излечении. Коррекция хромосомных дефектов с помощью генно-инженерных методов может представлять собой существенный прорыв в оказании помощи пациентам с хромосомными болезнями. В основу «хромосомной терапии» подобных заболеваний лег феномен потери кольцевой хромосомы при культивировании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), полученных из фибробластов пациентов с кольцевыми хромосомами. Последующее удвоение оставшегося нормального гомолога может привести к нормализации числа и структуры хромосом в кариотипе, а направленная дифференцировка ИПСК с редактированным кариотипом в заданный тип клеток может составить основу заместительной клеточной терапии (Kim et al., 2014; 2017). Данная идея инициировала настоящее исследование, направленное на разработку подходов к коррекции кариотипа. В ходе предыдущих этапов выполнения исследования нами апробированы несколько подходов к конструированию, созданию и внедрению генно-инженерных конструкций (трансгенов) в геном ИПСК человека. На конец 2018 года нами получены необходимые трансгены и проведено их последовательное встраивание в p- и q-плечи хромосомы 3 с дупликацией гена CNTN6. Вследствие возможной клеточной гетерогенности трансфецированных линий ИПСК и/или перестройки участка встройки 1 последовательная встройка генетических конструкций оказалась не эффективной, в связи с чем, в текущем периоде проведено внедрение в ИПСК одновременно обоих трансгенов. Получено 89 клонов. Материал части из них собран для анализа ДНК, с целью определения наличия, места и целостности интеграции. Оставшиеся клоны в процессе наращивания. Другой подход, развиваемый в нашей работе, заключался в элиминации хромосомы, несущей аберрацию, путем встраивания в нее генетической конструкции, несущей тимидинкиназу вируса герпеса. Проведена селекция клеток на среде с ганцикловиром. Массовая клеточная гибель не наблюдалась. Мы предположили, что место встраивания генетической конструкции (в частности, неактивный хроматин) влияет на замолкание трансгена и выживание клеток при селекции. Для локализации места встройки мы изучили целостность трансгена, содержащего тимидинкиназу вируса герпеса, с помощью ПЦР. Ни в одном случае продукт не получен, то есть, место встройки трансгенов данным методом определить не удалось. Установлено ранее и в нашей работе показано, что кольцевые хромосомы являются нестабильными и их продолжительное культивирование проявляется образованием дериватов (удвоенные кольца, фрагменты) и/или потерей кольца с возникновением моносомии по данной хромосоме. Поскольку, согласно Bershteyn с соавторами (2014), коррекция кариотипа ИПСК может происходить путем потери кольцевой хромосомы с образованием моносомии и последующей амплификации нормального гомолога, мы субклонировали ИПСК, полученные из фибробластов с кольцевой хромосомой 22. Ожидалось, что единичные ИПСК с моносомией по хромосоме 22 могут дать колонии с амплификацией нормального гомолога хромосомы 22. Установлена нулевая выживаемость при 1- и 3-клеточной посадке, при посадке шести клеток положительный результат получен в одной из 8 лунок. Это свидетельствует о значительно более низкой способности ИПСК iTAF5-29 к выживанию при одноклеточной пересадке, по сравнению с исходной линией фибробластов. Две линии ИПСК с r(22) были исследованы с помощью микрочипов SurePrint G3 Human CGH+SNP 4×180K с целью изучения структурной стабильности кольцевой хромосомы 22. Микроделеции области 22q13.32-q13.33, обнаруженные в обеих линиях, соответствуют ранее выявленным в лимфоцитах и фибробластах. Таким образом, для кольцевой хромосомы 22 в нашем случае характерна нестабильность в виде потери кольца, но не его фрагментации, в отличие от кольцевой хромосомы 13, для которой ранее с помощью цитогенетических и молекулярно-генетических методов нами показана структурная нестабильность. В двух из четырех линий ИПСК с r(13) выявлена выраженная клеточная гетерогенность с накоплением делеций длинного плеча хромосомы 13 различного размера. В одной из линий была детектирована нормокопийная область. Предварительный анализ области нормокопийности в делетированном регионе кольцевой хромосомы 13 с помощью нанопорового секвенирования на платформе MinION (Oxford Nanopore Technologies, UK) позволяет уверенно говорить о наличии минимум двух регионов, длиной 6871 п.о. и 4042 п.о., для которых характерна полная гомозиготность. Известно, что зачастую замыкание хромосомы в кольцо обусловлено сочетанием терминальной делеции, ассоциированной с инвертированной дупликацией. Для моделирования такого процесса были получены ИПСК из фибробластов пациентки с терминальной делецией 2p25.3 и инвертированной дупликацией 2p25.3-р23.3. Однако по данным стандартного цитогенетического анализа для всех трех линий iTAF9 описан кариотип 46,ХХ,(der2). Клетки с кольцевыми хромосомами пока не зарегистрированы. С помощью матричной сравнительной геномной гибридизации на микрочипах Agilent 180K линия ИПСК была исследована на пассажах 11 и 21. На хромосоме 2 на пассаже 11 выявлены del2p25.3 и dup2p25.3-p23.3 размером 2,658 кб и 21,695 кб, соответственно, на пассаже 21 - del2p25.3 и dup2p25.3-p23.3 размером 2,710 кб и 21,720 кб, соответственно. Таким образом, спонтанного замыкания в кольцо хромосомы 2, несущей перестройки, в ИПСК линии iTAF9 либо не происходит, либо такие клетки имеют сниженный пролиферативный потенциал и не выявляются. В текущем году в проект дополнительно были включены пациенты с задержкой развития и дизморфиями, у которых при стандартном кариотипировании в лимфоцитах выявлены кольцевые хромосомы 8 и 18. По результатам стандартного метафазного анализа кариотип лимфоцитов периферической крови пациента 1 - 46,XY,r(8)(p23;q24.3)[27]/45,XY,-8[3]. С помощью микрочипов Agilent 180K + SNP выявлены микроделеция 8p23.3-p23.1 и микродупликация 8p23.1-8p11.22 размером 382 кб и 2.024 Мб, соответственно. При проведении стандартного метафазного анализа в лимфоцитах периферической крови пациента 2 выявлена кольцевая хромосома 18 и ее дериват: 46,XY,r(18)(p11.1q23)[47]/46,XY,der(18)r(18;18) (p11.1q23;q23p11.1)[3]. С помощью aCGH на микрочипах Agilent 180K обнаружены терминальные делеции обоих плеч хромосомы 18: arr[hg19] 18p11.32p11.21(14316_13530125)×1, 18q23(76744252_77982126)×1 размером 13,52 Мб и 1,238 Мб, соответственно, обусловившие образование кольца. Обе делеции возникли de novo. От обоих детей получены фибробласты кожи предплечья, которые далее были репрограммированы в ИПСК. Данные о стабильности разных кольцевых хромосом (r(8), r(13), r(18), r(22)) в различных типах клеток (лимфоциты, фибробласты, ИПСК) будут обобщены в зарубежной публикации. Таким образом, замыкание хромосомы в кольцо является сложной генно-инженерной задачей, требующей больших финансовых и интеллектуальных вложений. Феномен потери кольцевой хромосомы в ИПСК с амплификацией нормального гомолога был описан в литературе единожды (Bershteyn et al., 2014); в нашей работе на примере кольцевых хромосом 13 и 22 его воспроизвести пока не удалось.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Коррекция хромосомных дефектов с помощью генно-инженерных методов кажется крайне привлекательной в оказании помощи пациентам с хромосомными болезнями. В основу «хромосомной терапии» подобных заболеваний мог бы лечь феномен потери кольцевой хромосомы и дупликации нормального гомолога, описанные при культивировании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), полученных из фибробластов пациентов с кольцевыми хромосомами (Bershteyn et al., 2014). Направленная дифференцировка ИПСК с редактированным кариотипом в заданный тип клеток могла бы составить основу заместительной клеточной терапии (Kim et al., 2014; 2017). Данная идея инициировала настоящее исследование, направленное на разработку подходов к коррекции кариотипа. В ходе пяти лет выполнения исследования нами апробированы несколько подходов к конструированию, созданию и внедрению генно-инженерных конструкций (трансгенов) в геном ИПСК человека. Нами получены необходимые трансгены и проведено их последовательное встраивание в p- и q-плечи хромосомы 3 с дупликацией гена CNTN6, которое, однако, не дало результатов. Далее была предпринята попытка одновременного встраивания обеих конструкций, что тоже не позволило получить клоны с обоими трансгенами в хромосоме 3. Нужно отметить, что одна из конструкций включает в себя ген тимидинкиназы (ТК) вируса герпеса. В 2019 году была опубликована работа, показывающая, что конститутивная экспрессия тимидинкиназы приводит к нарушению баланса нуклеотидов, что, в свою очередь, приводит к гибели клеток или к отбору клеток с замолканием трансгена (Iwasawa et al., 2019). ИПСК, экспрессирующие ТК, склонны гибнуть при культивировании, что, по-видимому, и вызвало проблемы с получением встройки конструкции в p-плечо. Таким образом, редактирование генома путем введения трансгенов в заданные области является крайне непростой и трудоемкой задачей, эффективная реализация которой зависит от многих факторов. Установлено ранее и в нашей работе показано, что кольцевые хромосомы являются нестабильными, и их продолжительное культивирование проявляется образованием дериватов (удвоенные кольца, фрагменты) и/или потерей кольца с возникновением моносомии. В прошлом году в проект дополнительно были включены пациенты с задержкой развития и дизморфиями, у которых при стандартном кариотипировании в лимфоцитах выявлены кольцевые хромосомы 8 и 18. От обоих детей получены фибробласты кожи предплечья, которые далее были репрограммированы в ИПСК. В культурах фибробластов r(8) обнаруживалась в 67% клеток, при этом 33% фибробластов на пассаже 2 были моносомными, однако позже возник клон клеток с транслокацией t(7; 8). Данная транслокация, по-видимому, ликвидировала проблему прохождения кольцевой хромосомы 8 через митоз, и такие клетки получили пролиферативное преимущество (более 80% метафаз на пассажах 6, 12, 17 и 24). r(18) при культивировании фибробластов стабильно сохранялась; 100% метафаз на пассажах 4 и 11 имели кариотип 46,XY,r(18). Во всех шести проанализированных линиях ИПСК, полученных от пациента с кольцевой хромосомой 8, после примерно десятого пассажа культивирования была обнаружена самопроизвольная нормализация кариотипа. Распределение SNP-генотипов в линиях с нормализованным кариотипом позволяет сделать вывод о том, что такая коррекция происходит через потерю кольцевой хромосомы и удвоение оставшегося нормального гомолога, с образованием однородительской изодисомии по хромосоме 8 отцовского происхождения (isoUPD(8)pat). Среди ИПСК с r(18) только одна из трех линий оставалась стабильной до пассажа 20; в двух других линиях aCGH-анализ на пассаже 13 показал потерю значительной части генетического материала хромосомы 18, что указывает на ее множественные перестройки. Данные о стабильности разных кольцевых хромосом (r(8), r(13), r(18), r(22)) в различных типах клеток (лимфоциты, фибробласты, ИПСК) обобщены в зарубежной публикации (Nikitina et al., Scientific Reports). Важные дополнительные исследования инициировал результат спонтанной нормализации кариотипа ИПСК, которые были репрограммированы из фибробластов пациента с кольцевой хромосомой 8. На хромосоме 8 расположен импринтированный ген KCNK9, экспрессирующийся с материнского гомолога и неактивный на отцовском. Мутации в данном гене ассоциированы с синдромом Бирка-Барела (OMIM 612292). Экспрессия данного гена была нами показана в кортикальных нейронах, дифференцированных из ИПСК, полученных из фибробластов двух доноров с нормальными хромосомами 8. Затем была проведена направленная дифференцировка в кортикальные нейроны двух линий ИПСК с isoUPD(8)pat. Несмотря на то, что в норме данный ген не экспрессируется с отцовского гомолога, в нейронах с isoUPD(8)pat, полученных in vitro, экспрессия наблюдалась с обоих отцовских гомологов, что может быть связано с нарушением поддержания импринтированного статуса гена KCNK9 в ИПСК. Таким образом, замыкание хромосомы в кольцо является сложной генно-инженерной задачей, требующей больших финансовых и интеллектуальных вложений. Феномен потери кольцевой хромосомы в ИПСК с амплификацией нормального гомолога был описан в литературе единожды (Bershteyn et al., 2014); в нашей работе его удалось воспроизвести только для кольцевой хромосомы 8.