Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе выполнения работ по проекту в 2016-2018 гг. нами были получены результаты, свидетельствующие о терапевтической эффективности эпидуральной электрической стимуляции в сочетании с клеточно-опосредованной генной терапии с помощью генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП), продуцирующих рекомбинантные молекулы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), глиального нейротрофического фактора (GDNF) и нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM), при контузионной травме спинного мозга у мини-свиньи. Принимая во внимание тот факт, что МККП не могут быть широко использованы в качестве клеточных носителей терапевтических генов, нами была предложена гипотеза использования лейкоконцентрата, полученного из периферической крови, для его генетической модификации и последующей аутоинфузии в лечебных целях. В 2019 г. в соответствии с общим планом проекта нами были выполнены конкретные работы, а именно: I. Создание и наработка в препаративных количествах генетических векторов на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов человека 5 серотипа (Ad5) с модифицированными фиберами (Ad5/35F), несущих репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (EGFP), ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), ген глиального нейротрофического фактора (GDNF) и ген нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM). В результате проведенных работ был получен препарат рекомбинантного репликативно-дефектного аденовируса человека 5 серотипа с модифицированным фибером (Ad5/35F), несущий репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (EGFP). Впервые получены плазмидные конструкции pAd5/35-out4-GDNF, pAd5/35-out4-hVEGF165 и pAd5/35-out4- NCAM1 с самовырезающейся бактериальной частью, несущие геном аденовируса 5-го серотипа с фибером аденовируса 35-го серотипа и целевые гены в составе экспрессионной кассеты. Путем трансфекции клеток линии HEK293 плазмидными конструкциями pAd5/35-out4-GDNF, pAd5/35-out4-hVEGF165 и pAd5/35-out4-NCAM1 были впервые получены рекомбинантные аденовирусы 5-го серотипа с фибером аденовируса 35-го серотипа ― Ad5/F35-GDNF, Ad5/F35-hVEGF165 и Ad5/F35-NCAM1, несущие экспрессионные кассеты с генами gdnf, vegf и ncam, соответственно. II. Разработка протокола получения генетически модифицированного лейкоконцентрата (ГМЛ) из периферической крови мини-свиньи. В асептических условиях из подключичной вены забирали 100 мл крови в стерильные закрытые контейнеры (гемакон) объёмом 250 мл с антикоагулянтом СРDА-1 (Green Cross, Корея) (объем консерванта в каждом пакете 35 мл) и переливали в контейнер для компонентов крови «Компласт-300» (ОАО «Синтез», Россия). Для осаждения эритроцитов в контейнер добавляли 6% раствор гидроксиэтилкрахмала (Стабизол ГЭК 6%, Берлин-Хеми АГ, Германия) в соотношении 1:1 и центрифугировали при 350 rpm на центрифуге Рresvac (DP-2065 R PLUS) 10 минут при 10°С. После удаления эритроцитов контейнер снова центрифугировали при 350 rpm на центрифуге Рresvac 10 минут при 10°С, а надосадочную жидкость, содержащую лейкоциты, плазму и стабизол из контейнера экстрагировали путем выдавливания с помощью фракционатора компонентов крови ФК-01 (ООО "Лидкор", Екатеринбург) в новый контейнер «Компласт-300». В этот контейнер с надосадочной жидкостью добавляли физиологический раствор в соотношении 1:9 и центрифугировали при 1300 rpm на центрифуге Рresvac 10 минут при 10°С. Полученную надосадочную жидкость из контейнера экстрагировали путем выдавливания с помощью фракционатора компонентов крови ФК-01 таким образом, чтобы в контейнере для крови осталось 30 мл физиологического раствора, содержащего клеточную суспензию (лейкоконцентрат). Трансдукцию полученного лейкоконцентрата проводили в контейнере. Для этого через порт с помощью стерильного шприца вводили необходимый объем аденовирусных векторов (Ad5/35F), несущих репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (egfp) или терапевтические гены vegf, gdnf, ncam в физиологическом растворе, где MOI (multiplicity of infection — множественность инфицирования) равен 3 (MOI=3). Через 12 часов инкубирования при комнатной температуре и постоянном покачивании на шейкере (ELMI) в контейнер, содержащий генетически модифицированный лейкоконцентрат, добавляля 200 мл стерильного физиологического раствора и центрифугировали при 1000 rpm и температуре 10°С в течение 10 минут с помощью центрифуги Рresvac. Надосадочную жидкость из контейнера экстрагировали путем выдавливания с помощью фракционатора таким образом, что в контейнере остается около 30 мл физиологического раствора, включающего клеточную суспензию (14.8 ± 2.07 × 109 кл/л) — генетически модифицированный лейкоконцентрат (ГМЛ). Для изучения экспрессии гена EGFP in vitro образцы ГМЛ-EGFP культивировали в течение 72 часов после трансдукции. Флуоресцентная микроскопия в цитоплазме трансдуцированных лейкоцитов показала интенсивную зеленую флуоресценцию. Анализ ГМЛ-GFP с помощью проточной цитометрии показал, что 0,6% лейкоцитов в ГМЛ-EGFP эффективно экспрессировали зеленый флуоресцентный белок. Таким образом, после трансдукции лейкоконцентрата с помощью Ad5/35F-EGFP (MOI=3), можно получить ГМЛ, содержащий 0,6% EGFP-позитивных клеток. На основании протокола создания ГМЛ-EGFP был получен лейкоконцентрат из крови мини-свиньи, трансдуцированный аденовирусными векторами, несущими рекомбинантные гены человека VEGF, GDNF и NCAM в равном соотношении (ГМЛ-1/3 VEGF+1/3 GDNF + 1/3 NCAM). III. Разработка протокола клеточно-опосредованной генной терапии с помощью генетически модифицированного лейкоконцентрата на мини-свиньях после моделирования дозированной контузионной травмы спинного мозга. 1. Забор крови и получение генетически модифицированного лейкоконцентрата по оригинальному протоколу выполняли за сутки до моделирования нейротравмы. В настоящем исследовании лейкоциты трансдуцированы аденовирусным вектором (Ad5/35F), несущим репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка. 2. Контузионную травму спинного мозга (КТСМ) у мини-свиньи моделировали через 2 недели после имплантации электродов и через сутки после забора крови. 3. Аутоинфузия генетически модифицированного лейкоконцентрата. Генетически модифицированный лейкоконцентрат (30 мл) вводили через v.auricularis через четыре часа после моделирования нейротравмы. 4. Экспрессию репортерного гена EGFP изучали в посттравматическом спинном мозге и селезенке через 7 дней после внутривенной аутоинфекции ГМЛ-EGFP мини-свиньям с контузионной травмой спинного мозга. С помощью флуоресцентной микроскопии в спинном мозге (в эпицентре, ростральном и каудальном сегментах) были обнаружены EGFP-положительные лейкоциты. В селезенке мини-свиней EGFP-позитивные клетки были выявлены в лимфатических фолликулах белой пульпы. Таким образом, генно-модифицированные лейкоциты могут циркулировать в крови по всему организму, мигрировать из кровотока в спинной мозг и эффективно продуцировать рекомбинантные молекулы. IV. Комплексный анализ морфо-функционального восстановления спинного мозга мини-свиней после контузионной травмы на фоне аутоинфузии ГМЛ. В исследовании были использованы самки мини-свиней (вьетнамская вислобрюхая) весом 20-25 кг. Протокол эксперимента, включающий анестезию, хирургические вмешательства, послеоперационный уход и эвтаназию на конечных точках эксперимента, был одобрен Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (номер разрешения 2.20.02.18 от 20 февраля 2018 года). На данном этапе исследования животные были разделены на две экспериментальные группы: (1) интактная группа ― здоровые животные (n=4); (2) опытная группа ― животным имплантировали провода для эпидуральной электростимуляции (ЭС), моделировали контузионную травму спинного мозга (КТСМ), внутривенно вводили генетически модифицированный лейкоконцентрат (ГМЛ-EGFP) (n=4). Морфо-функциональное исследование спинного мозга проводили через 2 месяца после моделирования КТСМ. 1. Оценка двигательной активности 1) Поведенческие тесты. Положительных изменений по оценке теста PTIBS у опытных животных после введения ГМЛ не выявлено. При этом масса большеберцовой и камбаловидной скелетных мышц на обеих конечностях у животных из опытной группы была меньше чем у интакных животных. 2) Кинематика суставов. Сравнительный анализ выявил значительное уменьшение объема движений в голеностопном и коленном суставах на 30 и 60 сутки после моделирования нейротравмы. 3) Электрофизиологическое исследование. Обнаруженные у опытных животных преобразования параметров вызванных моторных потенциалов (полифазная кривая М-ответа, увеличение длительности моторного потенциала и снижение максимальной амплитуды М-ответа) указывают на посттравматическую дисфункцию центральных структур нейромоторного аппарата, что может быть следствием дегенеративных изменений в части двигательных единиц, развивающихся к 8 неделе после нейротравмы. 2. Гистологическое исследование Морфометрический анализ сохранности серого и белого вещества обнаружил существенные патологические сдвиги у опытных животных через 2 месяца после моделирования нейротравмы, а именно: (1) кавитация в сером веществе рострального и каудального сегментов; (2) уменьшение количества и увеличение диаметра осевого цилиндра миелиновых волокон в латеральном кортикоспинальном тракте. Иммунофлуоресцентный анализ в спинном мозге мини-свиней на 60 сутки после контузионной травмы позволил установить: (1) усиление иммуноэкспрессии калий-хлорного котранспортера; (2) снижение уровня синаптических белков (синаптофизина и белка постсинаптической плотности); (3) продолжающийся апоптоз и усиление экспрессии белка теплового шока; (4) признаки астроглиоза и уменьшение количества миелинобразующих клеток. 3. Молекулярное исследование Впервые анализ экспрессии генов нейромедиаторных систем спинного мозга мини-свиньи через 60 суток после моделирования контузионной травмы выявил специфические изменения со стороны холинергической, глутаматергической, глицинергической, ГАМКергической и серотонинергической нейромедиаторных систем. Мультплексный анализ не выявил значимых различий в содержании эндогенных цитокинов, хемокинов и факторов роста у животных с контузионной травмой спинного мозга при сравнении с интактными мини-свиньями. Заключение В настоящем исследовании впервые разработан протокол получения генетически модифицированного лейкоконцентрата из периферической крови мини-свиньи для аутоинфузии. На основании полученного генетически модифицированного лейкоконцентрата впервые разработан протокол генной терапии контузионной травмы спинного мозга у мини-свиньи, основанный на аутоинфузии генетически модифицированного лейкоконцентрата. В соответствии с общим планом проекта на данном этапе работ с помощью поведенческих тестов, электрофизиологических, молекулярных и гистологических методов исследования получены данные о влиянии генетически модифицированного лейкоконцентрата, экспрессирующего рекомбинантный зеленый флуоресцирующий белок, на морфо-функциональное восстановление спинного мозга мини-свиньи с контузионной травмой в сравнении с интактными животными. Установлено, что патологические сдвиги в нервно-мышечной системе мини-свиней с контузионной травмой спинного мозга через 60 суток после аутоинфузии генетически модифицированного лейкоконцентрата, продуцирующего рекомбинантный зеленый флуоресцирующий белок, сохраняются. Другими словами, внутривенная аутоинфузия лейкоконцентрата, трансдуцированного Ad5/35F-EGFP, не имеет терапевтического эффекта, а полученные данные являются основой для оценки терапевтической эффективности генетически модифицированного лейкоконцентрата, экспрессирующего рекомбинантные молекулы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), глиального нейротрофического фактора (GDNF) и нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM), в сочетании с эпидуральной стимуляцией на морфо-функциональное восстановление спинного мозга после контузионной травмы у мини-свиньи на следующем этапе выполнения проекта. Таким образом, заявленный конечный результат на данном этапе исследования получен.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В соответствии с общим планом проекта в текущем году были выполнены следующие конкретные работы: (I) наработка в препаративных количествах химерных аденовирусных векторов Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1 для получения генетически модифицированного лейкоконцентрата (ГМЛ); (II) молекулярный анализ экспрессии терапевтических генов в ГМЛ in vitro; (III) комплексный анализ морфо-функционального восстановления спинного мозга мини-свиней после контузионной травмы на фоне: (1) аутоинфузии ГМЛ ‒ лейкоконцентрата, трансдуцированного Ad5/F35-VEGF165 + Ad5/F35-GDNF + Ad5/F35-NCAM1; (2) сочетанной эпидуральной электростимуляции выше эпицентра травмы (Th5) и ниже ‒ на уровне L2 позвонков и ведения ГМЛ-GFP; (3) комбинированной терапии: аутоинфузии ГМЛ ‒ лейкоконцентрата, трансдуцированного Ad5/F35-VEGF165 + Ad5/F35-GDNF + Ad5/F35-NCAM1, в сочетании с двухуровневой эпидуральной электростимуляцией. I. Получение в препаративных количествах генетических векторов на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов человека 5 серотипа (Ad5) с модифицированными фиберами (Ad5/35F), несущих кДНК, кодирующую VEGF165, GDNF и NCAM1 В результате выполнения работ были получены и проанализированы опытные образцы рекомбинантных репликативно-дефектных вирусных векторов на базе аденовируса человека 5 серотипа (Ad5) с фибером аденовируса 35 серотипа (Ad5/F35), несущих целевые трансгены для клеточно-опосредованной генной терапии травмы спинного мозга, а именно Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1. II. Молекулярный анализ экспрессии терапевтических генов in vitro Методом ПЦР-РВ установлено, что уровень содержания мРНК генов vegf165, gdnf и ncam1 в ГМЛ при одновременной трансдукции тремя аденовирусными векторами (MOI=10) был в 324,2 [55,5-1895,6] для vegf16 (P=0,0002), 217,9 [61,1-777,0] для gdnf (P=0,0001) и в 190,5 [23,4-1549,7] для ncam1 (P=0,0009) раз выше по сравнению с уровнем мРНК генов-мишеней в не трансдуцированных лейкоцитах. Продукцию рекомбинантных молекул (VEGF, GDNF, NCAM) анализировали с помощью иммуноферментного метода в надосадочной жидкости через 72 часа инкубации генетически модифицированных лейкоцитов in vitro. Достоверное увеличение рекомбинантного GDNF (23,8 пг/мл) в 43 раза, VEGF (2620,9 пг/мл) в 163 раза и NCAM (1523,9 пг/мл) в 2,2 раза было установлено в надосадочной жидкости после инкубации генетически модифицированных лейкоцитов, при сравнении с супернатантом, полученного после инкубации не трансдуцированных лейкоцитов (0,55; 15,68 и 687,0 соответственно). Иммунофлуоресцентное окрашивание генетически модифицированных лейкоцитов через 72 часа инкубации in vitro с помощью АТ к VEGF, GDNF, NCAM выявило иммунопозитивные лейкоциты, что свидетельствует об эффективной экспрессии трансгенов в генетически модифицированных клетках. III. Оценка двигательной активности у мини-свиней с контузионной травмой спинного мозга Предварительный анализ теста PTIBS позволил установить, что у подопытных животных после имплантации электродов значения теста составили 9,5 баллов, что соответствует нормальной двигательной активности по 10-бальной шкале. Через 4 недели после нейротравмы у контрольных животных значение теста оценивали в 1,8 балла, у мини-свиней из терапевтических групп ‒ от 2 до 2,5 баллов. Через 8 недель эксперимента перед выведением животных из опыта двигательную активность у контрольных мини-свиней оценивали в 2,0 балла, у животных после комбинированной терапии ‒ в 2,5 балла. Оценка кинематики суставов является одним из эффективных методов анализа функционального восстановления проводящих путей после контузионной травмы спинного мозга. Предварительный анализ кинематики суставов у контрольных животных обнаружил значительное уменьшение объема движений в голеностопном и коленном суставах на 60 сутки после моделирования нейротравмы. При этом объем движения в тазобедренном суставе у контрольных мини-свиней приближался к значению до моделирования нейротравмы. В терапевтических группах значения объема движений в голеностопном суставе через 8 недель после нейротравмы были выше, чем у контрольных мини-свиней. При этом у животных с комбинированной терапией они не отличались при тренировке на беговой дорожке, как во время электростимуляции, так и без электростимуляции. Результаты взвешивания скелетных мышц (большеберцовой и камбаловидной) с обеих конечностей интактных и подопытных животных позволили установить, что мышечная масса большеберцовой и камбаловидной мышц на обеих конечностях у животных из контрольной группы была меньше чем у интакных животных. При этом мышечная масса обеих мышц у животных из всех терапевтических групп не отличалась от интактных значений, что может служить прогностическим признаком морфо-функционального восстановления спинного мозга у мини свиней с нейротравмой на фоне проводимого лечения. IV. Электрофизиологическое исследование камбаловидной мышцы экспериментальных животных При электромиографическом тестировании до травмы спинного мозга при стимуляции седалищного нерва регистрировали моторный (М) ответ стандартной формы, включающий негативный и позитивный пики. При увеличении интенсивности раздражения амплитуда М-ответа увеличивалась, достигая максимума и в дальнейшем не изменялась. После травмы спинного мозга параметры вызванных мышечных потенциалов изменялись в зависимости от срока исследования. Так, через 2 недели кривая М-ответа у контрольных животных имела несколько фаз и такая полифазность сохранялась на последующих этапах исследования: через 4, 6 и 8 недель. При этом амплитуда М ответа возрастала, начиная со 2 недели после нанесения травмы, и снижалась к 8 неделе эксперимента. Форма М-ответа у животных на фоне комбинированной терапии имела тенденцию к восстановлению, начиная с 4 недели после моделирования нейротравмы. Максимальная амплитуда М-ответа у этих животных увеличивалась на всех сроках исследования, достигая максимального значения на 8 неделе. Длительность мышечного ответа у контрольных животных возрастала с первых недель после контузионной травмы, достигнув максимума на 8 неделе. Длительность ответа у животных с комбинированной терапией оставалась без значительных колебаний на протяжении всего эксперимента и приближалась к показателям интактных животных. Латентный период не отличался у интактных и подопытных животных на всех сроках исследования. Предварительный анализ данных Н-ответа обнаружил его отсутствие на электромиограмме у контрольных животных на всех сроках исследования. У животных на фоне комбинированной терапии Н-ответ появлялся на 2 неделе после нейротравмы. V. Гистологическое исследование спинного мозга экспериментальных животных В сером веществе у мини-свиньи через 60 суток после моделирования контузионной травмы спинного мозга морфометрический анализ патологических полостей обнаружил, уменьшение площади сохранившейся ткани в ростральном и каудальном сегментах. У мини-свиней после комбинированной терапии значения в ростральном сегменте не отличались от интактных животных. В латеральном кортикоспинальном тракте у всех животных, кроме мини-свиней после комбинированной терапии, выявлено значительное уменьшение количества миелиновых волокон в каудальном и ростральном сегментах спинного мозга, при сравнении и интактными животными. Диаметр осевого цилиндра у интактных мини-свиней был меньше, чем у подопытных животных, как в ростральном, так и каудальном сегменте. Толщина миелиновой оболочки у интактных животных в ростральном и каудальном сегментах была меньше, при сравнении со всеми подопытными животными. Иммунофлуоресцентное окрашивание спинного мозга опытных животных АТ против белка эффектора апоптоза в ростральном и каудальном сегментах обнаружило Caspase3-позитивные клетки в передних и задних рогах подопытных животных. Предварительный анализ данных свидетельствует, что у контрольных животных клеток, вступивших в апоптоз, было больше, чем у животных после комбинированной терапии. Уровень иммуноэкспресии Hsp27 и KCC2 во всех экспериментальных группах не выявил значимых отличий в соответствующих зонах спинного мозга подопытных животных, относительно интактных мини-свиней. Однако более высокие значения интенсивности флуоресценции Hsp27 и KCC2 были выявлены в ростральном отделе у контрольных животных. Анализ иммуноэкспрессии белка постсинаптической плотности 95 кДа в нейронах передних и задних рогов спинного мозга в ростральном и каудальном сегментах относительно эпицентра травмы выявил незначительные различия между интактными и подопытными животными. Однако у мини-свиней из контрольной группы обнаружен более низкий уровень иммуноэкспрессии PSD95 во всех исследованных зонах при сравнении с интактными и животными из терапевтических групп. Уровень иммуноэкспрессии синаптофизина в передних и задних рогах спинного мозга в каудальном и ростральном сегментах, также не отличался у подопытных и интактных животных. При этом более низкие значения во всех исследованных зонах были у контрольных животных и более высокие у мини-свиней после комбинированной терапии. Иммунофлуоресцентное окрашивание спинного мозга АТ против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) обнаружило увеличение GFAP-позитивной площади в задних рогах, как в ростральном, так и каудальном сегментах у контрольных животных, относительно интакных мини-свиней. У животных после комбинированной терапии значения не отличались от интактных. Анализ маркера клеток микроглии (Iba1) выявил увеличение Iba1-позитивных клеток в передних и задних рогах в ростральном и каудальном сегментах контрольных животных, относительно интактных. Меньший рост Iba1-позитивных клеток установлен у мини-свиней после комбинированной терапии. Анализ иммуноэкспрессии маркера миелинобразующих клеток (Olig2) в передних и задних рогах и кортикоспинальном тракте выявил уменьшение количества Olig2-позитивных клеток во всех исследованных зонах, как в ростральном, так и каудальном сегментах спинного мозга у контрольных мини-свиней при сравнении с интакными животными. У мини-свиней после комбинированной терапии количество Olig2-позитивных клеток не отличалось от значений у интактных животных. VI. Молекулярно-генетический анализ спинного мозга экспериментальных животных Предварительный анализ экспрессии генов, кодирующих пресинаптические и постсинаптические белки нейромедиаторных систем, позволяет заключить, что в ростральном сегменте спинного мозга, происходят менее выраженные изменения в экспрессии генов-мишеней у животных из терапевтических групп, относительно контрольных. В каудальном сегменте наблюдается снижение экспрессии всех генов-мишеней у мини-свиней на фоне генной и комбинированной терапии, при сравнении с контрольными животными. Результаты позволяют предположить о возможном влиянии терапевтических рекомбинантных молекул (VEGF, GDNF, NCAM) на пластичность возбуждающих (холинергическая, глутаматергическая), тормозных (глицинергическая и ГАМКергическая) и серотонинергических нейромедиаторных систем спинного мозга ниже эпицентра нейротравмы. Полученные данные могут служить прогностическим признаком функционального восстановления спинного мозга у мини свиней с нейротравмой на фоне проводимого лечения. Заключение В настоящем исследовании впервые проведены доклинические испытания аутологичного генетически модифицированного лейкоконцентрата для терапии травмы спинного мозга в сочетании с двухуровневой эпидуральной электростимуляцией выше и ниже эпицентра нейротравмы у мини-свиньи. Аутологичный генетически модифицированный лейкоконцентрат готовили из периферической крови мини-свиньи и смеси их трех аденовирусных векторов Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1 в равной пропорции. Молекулярно-генетический анализ подтвердил эффективность экспрессии трансгенов лейкоцитами в ГМЛ in vitro. В соответствии с общим планом проекта на данном этапе работ с помощью поведенческих тестов, электрофизиологических, молекулярных и гистологических методов исследования получены данные о более выраженном положительном действии комбинированной терапии на морфо-функциональное восстановление спинного мозга мини-свиньи с контузионной травмой, в сравнении с контрольными животными и мини-свиньями на фоне только генной или электротерапии. Таким образом, заявленный конечный результат на данном этапе исследования получен.