Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Боковой амиотрофический склероз (БАС) – прогрессирующее неизлечимое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся поражением мотонейронов головного и спинного мозга. Несмотря на очевидный прогресс, достигнутый за последние десятилетия в изучении клеточных и молекулярных процессов, лежащих в основе патогенеза БАС, отсутствует единая гипотеза, объединяющая различные патогенетические механизмы, что затрудняет разработку эффективной нейропротекторной терапии. Целью проекта РНФ № 19-15-00329, реализуемого под руководством академика РАН А.Л. Зефирова, является изучение и анализ самых ранних патогенетических механизмов, инициирующих развитие БАС. В рамках проекта в 2019 году было проведено комплексное исследование механизмов дисфункции нервно-мышечных синапсов на ранних стадиях развития патологии в модели бокового амиотрофического склероза (БАС) на трансгенных мышах. В качестве модели БАС использовались трансгенные мыши генотипа B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J (далее – mSOD1-мыши), экспрессирующие мутантный человеческий ген, кодирующий цитозольный фермент Cu/Zn-супероксиддисмутазу SOD1. В частности, было выявлено, что у mSOD1-мышей на ранней досимптомной стадии патологии (возраст 1,5-2 месяца) наблюдаются следующие изменения: (а) усиление спонтанной нейросекреции и зависящей от предшествующей активности депрессии вызванной нейросекреции, изменение холинорецепторных процессов постсинаптической мембраны; (б) ускорение спада внутритерминальной кальциевой концентрации после одиночного потенциала действия двигательного нервного окончания; (в) повышение интенсивности формирования и разборки липидных микродоменов (рафтов) мембран нервных окончаний и мышечных волокон; (г) снижение экспрессии пресинаптического белка SNAP-25 (компонент SNARE комплекса, участвующий в экзоцитозе синаптических везикул). На поздней досимптомной стадии (возраст 2,5-4 месяца) у mSOD1-мышей было выявлено увеличение вариабельности нервно-мышечных синапсов по уровню интенсивности процессов экзо-эндоцитоза, наблюдалось снижение экспрессии как SNAP-25, так и синапсина-I (пресинаптический белок, участвующий в регуляции рециклирования синаптических везикул). На обоих исследованных стадиях патологии у mSOD1-мышей было выявлено снижение площади поперечного сечения спинного мозга за счет снижения площадей как серого, так и белого вещества. Таким образом, на досимптомной стадии патологии у mSOD1-мышей были выявлены пре- и постсинаптические нарушения нервно-мышечной синаптической передачи, которые характеризуются изменением параметров спонтанной и вызванной высокочастотной активностью нейросекреции, динамики внутритерминальной кальциевой концентрации, снижением экспрессии ключевых пресинаптических белков SNAP-25 и синапсина-I, изменением интенсивности сборки/разборки липидных микродоменов клеточных мембран, повышением вариабельности синапсов по уровню интенсивности процессов экзо- и эндоцитоза синаптических везикул; данные изменения сопровождаются дегенеративными изменениями на уровне спинного мозга. Полученные результаты расширяют наши представления о молекулярных механизмах развития и инициации БАС, а сведения об идентифицированных молекулярных мишенях патологического процесса могут быть использованы в исследованиях по разработке терапевтических стратегий при БАС.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году в ходе выполнения проекта РНФ было проведено исследование по изучению дисфункций нервно-мышечной системы у трансгенных FUS-мышей с моделью бокового амиотрофического склероза на ранней досимптомной стадии заболевания. Эксперименты проводились на трансгенных мышах FUS1-513 с эктопной нейроспецифической экспрессией укороченного гена FUS человека на генетическом фоне CD1 (FUS-мыши) в возрасте 40-60 дней. В качестве контроля использовались мыши дикого типа (WT-мыши) такого же возраста. В электрофизиологических экспериментах установлено, что у FUS-мышей на ранней досимптомной стадии развития заболевания наблюдается снижение амплитуды токов концевой пластинки (ТКП) и миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП), уменьшение времени нарастания и времени полуспада МТКП, усиление депрессии амплитуды ТКП при высокочастотной стимуляции синапса (20 Гц, 3 минуты) и снижение выраженности восстановления амплитуды ТКП после высокочастотной активности, в сравнении с мышами дикого типа. Полученные результаты свидетельствуют о наличии пре- и постсинаптических нарушений в нервно-мышечных синапсах FUS-мышей; возможными причинами выявленных феноменов могут являться изменение функционирования постсинаптических н-холинорецепторов и нарушение параметров рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях FUS-мышей. В экспериментах с применением флуоресцентного красителя FM 1-43 у FUS-мышей было выявлено снижение интенсивности «загрузки» красителя в нервные терминали в сравнении с WT-мышами, при этом отличия в динамике «выгрузки» красителя отсутствовали. Полученные данные свидетельствуют о нарушении процессов рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях FUS-мышей, вероятно, связанные с изменением эндоцитоза везикул. В оптических экспериментах с применением кальциевого красителя Oregon Green 488 BAPTA-1 Hexapotassium Salt было установлено, что параметры кальциевого транзиента двигательных нервных окончаний FUS-мышей, вызванного одиночным раздражением нерва, достоверно не отличаются от таковых у WT-мышей, что свидетельствует об отсутствии у FUS-мышей нарушений динамики входа ионов Са, их диффузии в нервном окончании, скорости буферизации и откачки ионов Са из клетки в использованных экспериментальных условиях. В экспериментах с применением флуоресцентных красителей было установлено, что у FUS-мышей на ранней досимптомной стадии наблюдаются патологические мембранные изменения в скелетных мышцах, которые сильнее выражены в синаптических областях - в частности, происходит снижение стабильности липидных рафтов, перекисное окисление липидов и нарушение транспорта церамида. Эти явления могут быть взаимосвязаны, поскольку накопление эндогенного церамида может дестабилизировать липидные рафты, что в свою очередь может способствовать окислительному стрессу, ведущему к перекисному окислению липидов. В иммунофлуоресцентных экспериментах было установлено, что у FUS-мышей наблюдается умеренное увеличение интенсивности иммуноэкспрессии пресинаптических белков SNAP-25 и синапсина-I, что может являться компенсаторной реакцией на развитие патологических процессов. При этом отсутствие достоверных изменений показателей иммуноэкспрессии н-холинорецепторов говорит об отсутствии грубого поражения рецепторного аппарата постсинаптической мембраны в изученных препаратах. Было проведено исследование экспрессии пре- (синаптофизин) и постсинаптического (PSD-95) белков в мотонейронах спинного мозга в двух моделях БАС – на FUS-мышах и mSOD1-мышах. В флуоресцентных экспериментах на срезах спинного мозга у FUS-мышей и mSOD1-мышей наблюдались разнонаправленные изменения интенсивности иммуноэкспрессии синаптофизина и PSD-95 на ранней досимптомной стадии патологии, кроме того, в каждой модели изменения экспрессии синаптофизина и PSD-95 имели разнонаправленный характер. Полученные результаты свидетельствуют о том, что иммуноэкспрессия синаптофизина и PSD-95 в мотонейронах спинного мозга трансгенных мышей с моделями БАС на ранней досимптомной стадии в значительной степени зависит от особенностей модельной патологии. В целом, в рамках реализации проекта РНФ в 2020 году были получены приоритетные научные данные о характере и механизмах дисфункций нервно-мышечной системы на ранней досимптомной стадии патологии у FUS-мышей. В частности, в нервно-мышечных синапсах было выявлено снижение амплитуды постсинаптических токов, усиление депрессии амплитуды токов концевой пластинки при высокочастотной активности синапса, нарушение процессов рециклирования синаптических везикул, что сопровождалось мембранными нарушениями (снижение стабильности липидных рафтов, усиление перекисного окисление липидов и нарушение транспорта церамида) и умеренным повышением иммуноэкспрессии пресинаптических белков SNAP-25 и синапсина-I в сравнении с мышами дикого типа. Кроме того, были выявлены изменения иммуноэкспрессии синаптических белков (синаптофизин и PSD-95) в мотонейронах спинного мозга FUS в сравнении с мышами дикого типа. Можно сделать вывод, что у FUS-мышей уже на ранней досимптомной стадии заболевания наблюдается снижение функциональных характеристик нервно-мышечной синаптической передачи, связанное с комплексными пре- и постсинаптическими клеточно-молекулярными нарушениями.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках реализации проекта РНФ в 2021 году было проведено изучение дисфункций нервно-мышечной системы в двух моделях бокового амиотрофического склероза(БАС) на трансгенных мышах. Эксперименты проводились на трансгенных мышах FUS1-513 с эктопной нейроспецифической экспрессией укороченного гена FUS человека на генетическом фоне CD1 (FUS-мыши), а также на трансгенных мышах генотипа B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J, экспрессирующих мутантный человеческий ген, кодирующий цитозольный фермент Cu/Zn-супероксиддисмутазу SOD1 (mSOD1-мыши). Было установлено, что в нервно-мышечных синапсах FUS-мышей на ранней досимптомной стадии патологии в условиях сниженного квантового выброса нейромедиатора отсутствуют выраженные изменения показателей временного хода нейросекреции в сравнении с WT-мышами, вместе с тем отмечалось достоверное снижение количества сигналов в позднем периоде синхронного выделения нейромедиатора. У FUS-мышей на симптомной стадии патологии выявлялось повышение квантового состава ТКП и синхронизация вызванной нейросекреции. В двигательных нервных окончаниях FUS-мышей на ранней досимптомной стадии было установлено снижение амплитуды кальциевого транзиента, вызванного ритмическим раздражением двигательного нерва с частотой 50 имп/с, в сравнении с WT-мышами; при стимуляции нерва с частотами 10 и 20 имп/с такое отличие не выявлялось. Обнаруженный феномен может быть связан с изменением работы внутриклеточных буферных кальциевых систем у FUS-мышей, в частности, эндоплазматического ретикулума, митохондрий и др. У FUS-мышей на симптомной стадии изменений амплитуды кальциевого транзиента при высокочастотной стимуляции с частотами 10, 20 и 50 имп/с в сравнении с WT-мышами не выявлялось. На нервно-мышечных препаратах mSOD1-мышей на ранней досимптомной стадии выявлено снижение целостности (стабильности) липидных рафтов, сопровождаемое снижением упорядоченности упаковки и увеличением текучести липидов мембран; данные изменения особенно заметны в синаптических областях мышечных волокон. Возможными причинами выявленных нарушений могут быть процессы перекисного окисления липидов мембран и накопление церамида. Нарушения липидных рафтов могут вызвать раннюю синаптическую дисфункцию, признаком которой является увеличенная неквантовая секреция, выявленная у mSOD1-мышей на ранней досимптомной стадии. На срезах поясничного утолщения спинного мозга FUS-мышей и mSOD1-мышей на ранней досимптомной стадии выявлен умеренный астроглиоз (активация астроцитов), что является признаком нейровоспаления. В спинном мозге mSOD1-мышей на ранней досимптомной стадии также снижалась экспрессия маркера олигодендроцитов, что может быть связано с нарушением миелинизации аксонов. В спинном мозге FUS-мышей и mSOD1-мышей на симптомной стадии наблюдались значительный астроглиоз и микроглиоз, что свидетельствует о выраженном нейровоспалении; кроме того, у данных мышей наблюдалось снижение экспрессии маркера олигодендроцитов, что может быть связано с нарушением миелинизации аксонов, сопровождающей нейродегенерацию. Установлено, что в поясничном утолщении спинного мозга FUS-мышей на ранней досимптомной стадии наблюдается снижение площади белого вещества в сравнении с WT-мышами. Морфологические изменения в поясничном утолщении спинного мозга FUS-мышей на симптомной стадии патологии характеризуются уменьшением его объема за счет уменьшения как серого, так и белого веществ. В флуоресцентных экспериментах на нервно-мышечных синапсах mSOD1-мышей на поздней досимптомной стадии выявлено отсутствие значимого участия тубулина и работы микротрубочек в механизмах экзо- эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул. Установлено, что в нервно-мышечных синапсах FUS-мышей на ранней досимптомной стадии отсутствуют достоверные отличия в выраженности облечения (фасилитации) в парных импульсах в сравнении с WT-мышами. В целом, в рамках реализации проекта РНФ в 2021 году были получены приоритетные научные данные о характере и механизмах дисфункций нервно-мышечной системы на ранней досимптомной стадии патологии в моделях БАС на трансгенных мышах. В частности, были выявлены следующие ранние изменения на уровне нервно-мышечной системы: снижение уровня внутриклеточного кальция в двигательных нервных терминалях при высокочастотной ритмической стимуляции (50 имп/с), снижение уровня вызванной нейросекреции в позднем периоде синхронного выделения нейромедиатора, снижение целостности (стабильности) липидных рафтов мембран мышечных волокон, повышенная неквантовая секреция ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах, умеренный астроглиоз в спинном мозге. Вероятно, выявленные нарушения имеют важное значение в инициации/развитии патогенетических механизмов бокового амиотрофического склероза в исследованных моделях патологии.