КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 19-15-00241
НазваниеРадиоуглеродный анализ клеток гиалинового хряща человека при возрастных изменениях и артрозе: регенеративный потенциал эндогенных стволовых клеток.
РуководительЧагин Андрей Станиславович, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2019 г. - 2021 г. |
Конкурс№35 - Конкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-405 - Регенеративная медицина
Ключевые словасуставы, хрящ, остеоартроз, регенерация, стволовые клетки
Код ГРНТИ76.29.14
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Актуальность проблемы: Остеоартроз (ОА) ̶ одно из наиболее распространенных и серьезных возрастных заболеваний ̶ характеризуется разрушением суставной ткани (хряща) и частичной, или полной, потерей мобильности. ОА является причиной потери функциональности суставов у более чем 50% населения старше 65 лет, при этом наблюдается эпидемиологическая тенденция к омоложению заболевания. Повсеместное распространение ОА среди различных слоёв населения вносит значительный вклад заболевания в снижение фактической трудоспособности населения. Единственным эффективным лечением на данный момент является эндопротезирование ̶ полная замена поврежденного сустава искусственным имплантатом. Подобное хирургическое вмешательство крайне травматично и требует длительного периода реабилитации, при этом в течении последующих 7-15 лет вероятность повторного протезирования сустава составляет 37 % и является гораздо более сложной операцией с повышенным риском осложнений.
Область регенеративной медицины стремительно развивается, однако многочисленные попытки разработать подходы к восстановлению поврежденных тканей суставного гиалинового хряща, к сожалению, пока не привели к успеху. Недостаточное понимание внутренних механизмов формирования структуры ткани, поддержания клеточного гомеостаза и процессов регенерации хряща ограничивают прогресс в этом направлении.
Научная новизна: Наши недавние исследования [Li L et al., The Faseb J 2017, 31:1067-1084], проведенные на генетически модифицированных мышах, демонстрируют способность клеток, располагающихся в поверхностной зоне артикулярного хряща, производить хондроциты и обновлять клеточный состав хрящевой ткани, полностью формируя зрелый суставной хрящ. В исследованиях in vivo на поверхности данной группы хондрогенных клеток были обнаружены маркеры, свойственные стволовым клеткам. Клетки поверхностной зоны артикулярного хряща в исследованиях in vivo демонстрируют способность к симметричному делению, поддерживая тем самым размер собственной популяции. Таким образом, мы впервые получили и опубликовали данные, характеризующие клетки поверхностной зоны гиалинового хряща в постнатальном возрасте как самообновляющиеся клетки-предшественники хондроцитов, что позволяет идентифицировать данную клеточную популяцию как группу эндогенных унипотентных стволовых клеток [Li L et al., The Faseb J 2017, 31:1067-1084].
На сегодняшний день обнаруженная группа эндогенных стволовых клеток хряща изучена незначительно, их роль в физиологических и регенеративных процессах хрящевой ткани у человека неизвестна. Предлагаемый проект даёт уникальную возможность не только расширить фундаментальные научные знания данной области, но и создать новый инструментарий для многочисленных исследовательских групп, решающих задачу восстановления хрящевой ткани при различных патологиях.
План работы и методические подходы:
1) Полученные нами в исследованиях на лабораторных животных данные позволяют предположить существование в поверхностной зоне артикулярного хряща человека схожей популяции прогениторных хондрогенных клеток, способных принимать участие в процессах обновления и регенерации тканей во взрослом организме. Для изучения обновления хрящевой ткани человека мы применим метод радиоуглеродного датирования ткани по ДНК. Метод основан на кратковременном (импульсном) увеличении содержания тяжелого изотопа углерода C14 в атмосфере вследствие испытаний ядерного оружия в середине ХХ века. Сравнение уровня содержания изотопа С14 в исследуемых тканях с уровнем, содержащимся в атмосфере в момент рождения индивида, позволит определить происходило ли клеточное деление в течение жизни или нет. Реализация данного метода изотопного анализа будет осуществляться в сотрудничестве с основоположником представленной исследовательской стратегии профессором Jonas Frisen (Karolinska Institute, Stockholm).
2) Реакция хондроцитов на повреждение и прогрессирование остеоартроза в тканях хряща человека мало изучена. Однако в литературе описано формирование кластеров хондроцитов в тканях пациентов с остеоартрозом, что позволяет предположить компенсаторную клеточную пролиферацию. Метод радиоуглеродного датирования ДНК позволит нам оценить пролиферативную активность хондроцитов в хряще человека в условиях прогрессирования остеоартроза. Хондроциты хрящевой ткани, пораженной остеоартрозом, будут отделены от клеток фиброзной ткани методом проточной цитометрии. Сравнение будет проводиться с хондроцитами здоровой ткани контрольной группы.
3) Охарактеризованные нами прогениторные клетки поверхностной зоны артикулярного хряща человека изучены слабо. Мы планируем детально изучить клетки поверхностной зоны хрящевой ткани человека на представленность клеточных маркеров на их поверхности, включая маркеры стволовых клеток. Нами уже были обнаружены специфические белки Prg4, CD73 и HMG2A, свойственные данной клеточной популяции у человека. Данная группа клеток будет выделена из хрящевой ткани человека в культуру с использованием метода проточной цитометрии и будет изучено наличие у клеток стволовых характеристик, таких как способность к неограниченной пролиферации, клональности, а также дифференцировке в клеточные типы мезенхимального происхождения: остеобласты, адипоциты и хондроциты. Также будет рассмотрена способность полученной культуры формировать хрящевую ткань in vitro.
В совокупности результаты, полученные по завершении проекта, позволят качественно усовершенствовать современные подходы хирургической и регенеративной медицины хрящевой ткани.
Данный проект планируется к осуществлению силами нашей лаборатории (Лаборатория регенерации скелетных тканей), созданной в Институте Регенеративной Медицины (первый МГМУ им. Сеченова) в начале 2017 года. Несмотря на то, что наша лаборатория очень юная, коллектив уже установил успешное междисциплинарное и межинститутское сотрудничество и опубликовали следующие совместные работы (заглавным шрифтом выделены сотрудники нашей лаборатории):
CHAGIN AS & MEDVEDEVA EV Regenerative medicine: Cartilage stem cells identified, but can they heal? (Nature Reviews Rheumatology 2017, 13(9):522-524)
MEDVEDEVA EV, Grebenik EA, GORNOSTAEVA SN, TELPUHOV VI, Lychagin AV, Timashev PS, CHAGIN AS. Repair of Damaged Articular Cartilage: Current Approaches and Future Directions. (Int J Mol Sci., 2018 Aug 11;19(8))
Phillip T Newton, Meng Xie, MEDVEDEVA EV, Lars Sävendahl, Andrei S CHAGIN Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. (Bone Reports, 2018, 8:64-71)
и следующие манускрипты в данный момент находятся на рассмотрении в редакциях рецензируемых журналов:
AFANASEYVSKAYA EV, MEDVEDEVA EV, GAZIMIEVA B, Istranov LP, Istranova EV, Shehter AB, CHAGIN AS, TELPUHOV VI Healing of cartilage defects covered by Chondro-Gide is comparable with locally-constructed collagen patches (в редакции "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины").
Meng Xie, Pavel Gol’din, Anna Nele Herdina, Jordi Estefa, Lei Li, Phillip T Newton, EKATERINA V MEDVEDEVA, Svetlana Kotova, Anastasia Akovantseva, Irene Linares Arregui, Kaj Fried, Mattias Carlström, Andras Simon, Christian Gasser, Peter Timashev, Sophie Sanchez, Igor Adameyko, Anders Eriksson, ADREI S CHAGIN Evolutionary separation of epiphyseal and articular cartilage allows bone growth on land (в редакции Science Advances).
Phillip T Newton, Lei Li, Xiaoyan Sun, Meng Xie, Simon Suter, Vyacheslav Dyachuk, Amel Gritli-Linde, Evgeny Ivashkin, ARTEM V ARTEMOV, Kaj Fried, Maria Kasper, Igor Adameyko, Lars Sävendahl, ANDREI S CHAGIN Radical switch in local cell dynamics provides for the formation of a stem cell niche in the epiphyseal growth plate (в редакции Nature)
Представленный перечень научных работ демонстрирует наличие у коллектива лаборатории знаний и опыта, необходимого для реализации представленного проекта, а также наличие высокого уровня профессионализма.
Ожидаемые результаты
Данные, полученные в рамках проекта, позволят:
1. расширить фундаментальные научные знания в биологии стволовых клеток и, в частности, в области регенерации хрящевой ткани человека.
2. оценить способность тканей гиалинового хряща человека обновляться в период после рождения индивида;
3. охарактеризовать новую популяцию взрослых стволовых клеток человека и оценить их регенеративный потенциал;
4. сформировать методы и протоколы работы с новой группой унипотентных стволовых клеток человека применительно к области регенерации хрящевой ткани;
5. определить клеточные механизмы, регулирующие процессы дегенерации, восстановления и обновления зрелого гиалинового хряща у человека;
6. усовершенствовать имеющиеся и разработать новые хирургические и терапевтические методы восстановления хрящевой ткани, включая персонифицированные подходы к решению данной проблемы.
Представленный проект нацелен на создание прочной научно-подкрепленной базы в области регенеративной медицины и тканевой инженерии хрящевой ткани, многочисленные попытки которых в достижении главной цели - восстановления гиалинового хряща - пока остаются безуспешными. Мы считаем, что глубокое понимание фундаментальных механизмов гомеостаза гиалинового хряща будет способствовать разработке успешных стратегий к регенерации хрящевой ткани. Планирование экспериментов, подходы и модели представленные в данной заявке, соответствуют самому современному международному уровню ведения исследований в данной научной области.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Благодаря финансовой поддержке РНФ в 2019 году наша исследовательская группа опубликовала две научные статьи, одну методологическую статью и обзор. Одним из наиболее интересных достижений в этом году, поддержанных грантом от РНФ, является сделанное нами научное наблюдение о том, что мутации в GP130, белке рецепторного комплекса IL6-семейства цитокинов, не оказывает воздействие на развитие артикулярного хряща сустава человека. Это открытие крайне любопытно, поскольку известно, что иммунная система и цитокины, в частности, негативно влияют на гомеостаз хрящевой ткани. В составе интернациональной команды мы получили доступ к образцам скелетных тканей пациентов с мутациями в гене GP130. Данный тип мутаций летален в эмбриональном либо раннем постнатальном периодах. Пациенты с этой мутацией были всесторонне изучены и охарактеризованы исследовательской группой, в состав которой вошли и мы. Наша узкоспециализированная часть работы заключалась в изучении влияния мутации на скелетные ткани. Нами было обнаружено, что сигнальный белок GP130 вовлечен в процессы, отвечающие за правильное формирование и минерализацию костных тканей, тогда как развитие хрящевой ткани суставов проходило вне зависимости от наличия или отсутствия функционально полноценного белка GP130. Полученные данные приняты в печать авторитетным медицинским журналом Journal of Experimental Medicine (impact factor 10.9).
Также среди наших достижений за 2019 год следует отметить разработку относительно простого, но весьма действенного протокола, позволяющего анализировать клональные клеточные структуры в минерализованных тканях. Разработанный нами протокол позволяет преодолеть ряд проблем возникающих при анализе тканей с высокой механической прочностью, таких как сложности в изготовлении срезов при микротомировании, нарушение узнаваемости антигенов иммуногистохимическими антителами после процедуры декальцификации, потеря флуоресцентного сигнала при обработке тканевых образцов и т.п. Протокол опубликован в научном журнале Journal of Visual Experiments, единственном журнале, представляющем видеозаписи всей методологической работы с крайне подробным описанием всех этапов публикуемых методик. Журнал высоко ценится научным сообществом и, в частности, исследователями, занимающимися практической экспериментальной работой и часто сталкивающихся с методологическими сложностями в своей научной деятельности. В предстоящем году нами запланированы исследования, нацеленные на решение фундаментального вопроса о роли клеток синовиальной мембраны в регенерации тканей артикулярного хряща. Удивительно, но в научном сообществе имеют место совершенно противоположные взгляды на роль синовиальных клеток в процессах восстановления поврежденных тканей сустава. Исследователи проблем ревматоидного артрита настаивают на деструктивной роли данного типа клеток при дефектах артикулярного хряща суставов. В тоже время исследователи, работающие в области регенеративной медицины, уверены, что клетки синовиальной мембраны участвуют в регенерации поврежденной хрящевой ткани. В предстоящем году мы планируем внести ясность в эту проблематику и разрешить противостояние точек зрения в пользу одной из сторон используя, в частности, методику, разработанную для оценки клональных структур в минерализованных тканях.
Публикации
1. Зоу Б., Каука М., Чагин А.С., Ньютон Ф.Т. Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues Journal of Vizualized Experiments, 152:e60424 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3791/60424
2. Иравани М., Лагерквист М.К., Кармиан Э., Чагин А.С., Олсон К., Савендал Л. Effect of the selective GPER1 agonist G1 on bone growth Endocrine Connections, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1530/EC-19-0274
3. Чен И.Х., Григелиониене Г., Ньютон П.Т., ...., Чагин А.С., ...., Ухлиг Х.Х. Absence of GP130 cytokine receptor signaling causes extended Stüve-Wiedemann syndrome Journal of Experimental Medicine, принята к печати (год публикации - 2020)
4. Чагин А.С., Ньютон Ф.Т. Postnatal skeletal growth is driven by the epiphyseal stem cell niche: potential implications to paediatrics Springer Nature, - (год публикации - 2020)
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Благодаря финансовой поддержке РНФ в 2020 году наша исследовательская группа продолжила исследования эндогенных взрослых стволовых клеток сустава, включая хондрогенных прогениторные клетки, обнаруженные несколько лет назад в поверхностной зоне артикулярного хряща (Kozhemyakina et.al. Arthritis Rheumatol 2015; Li et al., FASEB J. 2017), и клетки стволовой ниши, открытой нами в эпифизарной пластинке (Newton et.al., Nature 2019). В завершающемся году мы продолжили исследования регенеративного потенциала эндогенных хондрогенных клеточных популяций сустава в экспериментах in vivo, а также расширили спектр работ in vitro.
Одновременно с активной научной работой мы опубликовали исследовательскую статью и два научных обзора. Все статьи опубликованы в журналах первого квартиля. Наиболее интересное открытие, сделанное нами в этом году при финансовой поддержке РНФ, раскрывает роль вторичного центра оссификации (ВЦО) в процессах формирования сустава и роста скелета. ВЦО развиваются практически во всех длинных костях скелета растущего организма (за исключением черепа и частично лопатки) и, формируясь, разделяют изначально хрящевой эпифиз на две структурные функциональные единицы – артикулярный хрящ и хрящевую пластинку роста. ВЦО присутствует у различных видов животных, включая человека, тем не менее функция ВЦО в скелетных элементах прояснилась лишь с публикацией нашей работы. В составе интернациональной группы, объединившей специалистов разных дисциплин, мы провели масштабное исследование, включающее эволюционные аспекты появления ВЦО, его формирование у животных со уникально-адаптированными конечностями, таких как киты, тушканчики и летучие мыши, а также математическое моделирование и многочисленные функциональные эксперименты на лабораторных животных. Совместными усилиями мы выяснили, что популяция гипертрофированных хондроцитов, ответственных за рост костей в длину, крайне чувствительна к различным механическим воздействиям. Мы показали, что ВЦО необходимы в первую очередь для защиты гипертрофированных хондроцитов пластинки роста от механических нагрузок, возникающих при необходимости перемещать вес тела. Появление ВЦО снижает механическое напряжение в пластинке роста почти в 25 раз, а при его отсутствии гипертрофированные хондроциты гибнут, не выдерживая механических напряжений, и как следствие кость теряет способность расти. Интересно, что ВЦО образовался миллионы лет назад как эволюционное приспособление видов при переходе к полноценному наземному образу жизни, когда возникла необходимость совмещать рост скелета и перемещаться, поддерживая тело над землей во время движения. Нами было показано, что у китов наблюдается редуцирование ВЦО в процессе их эволюционного перехода от наземного образа жизни к обитанию в воде, произошедшего около 50-ти млн лет назад. На основании наших данных можно утверждать, что повышенная физическая нагрузка, оказываемая на скелет растущих детей (например, спортивная гимнастика или тяжелая атлетика), может негативно влиять на их рост. Результаты работы опубликованы в престижном научном журнале eLife (IF 7.1).
При поддержке РНФ в уходящем году нами также были опубликованы две значимые обзорные статьи в журналах высокого уровня. Первая была написана по заказу редакции журнала Frontiers in Cell and Developmental Biology (IF 5.4). В этой работе мы обсудили последние исследования по крайне актуальной теме, касающейся стволовых ниш и их роли в поддержании обновления и целостности скелетных тканей, включая ткани суставов. В последние несколько лет были сделаны прорывные работы в этой области (включая наши), которые стоило обсудить в контексте предыдущих исследований и дальнейших перспектив. Вторая обзорная статья была опубликована в журнале Bone (IF 4.5). Журнал запросил обзорную статью на тему наших данных по ВЦО, упомянутых выше. Оба журнала являются значимыми в своих научных областях.
Публикации
1. Сие М., Гольдин П., Хердина А.Н., Эстефа Й., Медведева Е.В., Ли Л., Ньютон Ф.Т., Котова С., Шавкута Б, […] Акованцева А., Усанова А.П., Куренкова А.Д., […] Тимашев П., Санчез С., Адамейко И., Эрикссон А., Чагин А.С. Secondary ossification center induces and protects growth plate structure eLife, eLife 2020;9:e55212 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.7554/eLife.55212
2. Cие М., Чагин А.С. The epiphyseal secondary ossification center: Evolution, development and function. Bone, Bone 142 (2021) 115701 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.bone.2020.115701
3. Куренкова А.Д., Медведева Е.В., Ньютон Ф.Т., Чагин А.С. Niches for Skeletal Stem Cells of Mesenchymal Origin Front. Cell Dev. Biol., Front. Cell Dev. Biol. 8:592 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00592
Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Часть собранного клинического материала (ткани артикулярного хряща человека, а также образцы костного мозга в качестве контрольных образцов) прошла ряд процедур отсева по качеству материала. После чего на базе Сеченовского Университета по специально разработанному протоколу была выделена ДНК. Финальная очистка образцов проводилась в помещении со специализированным оснащением на базе Каролинского Института (Стокгольм, Швеция). Радиоуглеродный анализ полученных образцов проводили на кафедре физики Университета Уппсалы. В соответствии с предварительными данным представляется возможным обновление хрящевой ткани сустава человека в постнатальный период в течение первых двух-трёх десятков лет после рождения. Получаемые данные концептуально меняют общепринятые представления о развитии тканей гиалинового хряща человека в постнатальный период и период становления организма.
В экспериментах in vitro было установлено, что экспансия клеток суставного хряща мыши с ингибитором сигнального пути Notch DAPT сохраняет потенциал клеток при дальнейшей хондрогенной дифференцировке. Нам удалось идентифицировать маркер клеток поверхностного слоя суставного хряща человека, предположительно являющихся прогениторными клетками. Культивирование с DAPT способствовало сохранению хондрогенного потенциала как этих клеток, так и нижележащих хондроцитов.
С применением генетически модифицированных линий лабораторных животных мы смогли пометить клетки, расположенные в синовиальной мембране, и отследить их распределение и их миграцию, последовавшую за моделированием полнослойного дефекта артикулярного хряща коленного сустава методом генетического трейсинга. На основе полученных данных можно заключить, что синовиальные клетки принимают участие в заживлении дефекта артикулярного хряща сустава, однако, ведущая роль в этом процессе принадлежит не им.
Публикации
1. Дмитрий Каменев, Казунори Сонадоме, Максим Широков, Андрей С. Чагин, Аеет Сингх, Уве Ирион, Игорь Адамейко, Кай Фред, Вячеслав Дьячук Schwann cell precursors generate sympathoadrenal system during zebrafish development Journal of Neuroscience research, Volume 99, Issue 10, In Focus issue: Neural substrates of cognitive change in humans, Pages 2540-2557 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/jnr.24909
2. Ибрагимова Ш.И. , Медведева Е.В. , Романова И.А. , Истранов, Л. , Истранова Э.В. , Лычагин, А. , Недорубов А.А. , Тимашев П.С. , Тельпухов В.И. , Чагин А.С. Implantation of various cell-free matrixes does not contribute to the restoration of hyaline cartilage within full-thickness focal defects International Journal of Medical Sciences, - (год публикации - 2022)
3. Полина Каменева, Артем В. Артемов, Мария Элени Кастрити, Луи Фор, Тале К. Олсен, Йорг Отте, Алек Эриксон, Беттина Семш, Майкл Ратц и др., Наталья Аккуратова, Мария Воронцова, Олег Гусев, Ниниб Баряно, Петр В. Харченко, Игорь Адамейко Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin Nature Genetics, Nature Genetics 53, 694–706 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1038/s41588-021-00818-x
Возможность практического использования результатов
Полученные результаты могут использоваться для улучшения методов восстановления артикулярной хрящевой ткани. По нашим сведениям, первые клинические исследования с использованием MACI подхода для восстановления повреждения суставов были запущены компанией Генериум в этом году в Москве. При этом Генериум закупил готовую технологию у немецкой компании Cod.On. Мы считаем, что полученные нами данные могут использоваться для улучшения и оптимизации имеющейся технологии как в России так и в мире.