Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект направлен на изучение в экспериментах на лабораторных животных (крысах) фенотипических модификаций, возникающих в сердечно-сосудистой системе во время внутриутробного развития организма и сохраняющихся в постнатальном онтогенезе. Для проведения таких исследований в 2019 г. были разработаны две экспериментальные модели: физической тренировки и такой патологии беременности как преэклампсия. Отработаны экспериментальные подходы к произвольной (не сопряженной со стрессированием) беговой тренировке беременных самок в колесе и получена комплексная оценка состояния организма самок, регулярно выполнявших физическую нагрузку с первого дня беременности до родов. Беременные самки охотно бегали в колесе, причем в первой половине беременности показатели их беговой активности были сопоставимы с таковыми у небеременных самок. В результате физической тренировки в организме беременных самок наблюдались гормональные и биохимические сдвиги, характерные для нормально протекающей беременности, а по изменению ряда показателей (повышение содержания трийодтиронина, эстрадиола и прогестерона в крови) можно говорить о благотворном влиянии регулярной физической нагрузки на организм беременных самок, что также проявлялось в благоприятным исходе беременности (увеличении размера помета без уменьшения массы тела крысят). С учетом полученных результатов разработан протокол тренировочного эксперимента в 2020 г. Поскольку ключевым патогенетическим механизмом преэклампсии является снижение биодоступности NO, для моделирования этого состояния самки крыс потребляли водный раствор L-NAME с 10 дня беременности до родов (суточная доза L-NAMЕ - 39 мг/кг). Это воздействие сопровождалось у беременных крыс выраженным снижением содержания метаболитов NO в крови и развитием ключевых симптомов преэклампсии (повышение артериального давления и нарушение фильтрационной способности почек), но не изменяло длительность беременности и численность потомства, хотя масса тела крысят у самок, потреблявших L-NAME, была уменьшена по сравнению с нормально протекавщей беременностью. С использованием модели создания дефицита NO в организме беременной самки получен ряд новых данных. Впервые показано, что снижение продукции NO в организме матери замедляет дифференцировку гладкомышечных клеток плода в сократительный фенотип, что проявляется в снижении содержания мРНК маркеров зрелых гладкомышечных клеток - α-актина, гладкомышечной изоформы тяжелых цепей миозина, белка SM22 и потенциал-управляемых кальциевых каналов L-типа. В возрасте 2 недель у потомства самок с преэклампсией выявлены изменения регуляции тонуса сосудов кожи и почки, хотя содержание метаболитов NO в крови таких крысят не было изменено по сравнению с 2-недельным потомством здоровых беременных самок. Изменения вазорегуляции у потомства самок с преэклампсией различались в двух исследованных сосудистых регионах. Для подкожной артерии потомства самок с преэклампсией были характерны повышение чувствительности к агонисту α1-адренорецепторов, но вместе с тем – снижение максимальной силы сокращения, увеличение антиконстрикторного влияния NO и калиевых каналов Kv7, а также уровня экспрессии мРНК порообразующей субъединицы этих каналов в артериях. Напротив, в артериях почки наблюдалось уменьшение эффектов NO (его вклада в эндотелий-зависимое расслабление), несмотря на повышение NO-чувствительности гладкой мышцы. Изменений адренореактивности артерий почки нами не выявлено, но показано повышение регуляторной роли калиевых каналов TASK-1. Мы полагаем, что изменения механизмов регуляции тонуса сосудов при преэклампсии являются результатом взаимодействия прямых эффектов дефицита NO во время развития и компенсаторных изменений клеток сосудистой стенки в ответ на это воздействие. В обеих артериях, особенно в подкожной, выявлено уменьшение констрикторного влияния АФК, продуцируемых НАДФН-оксидазами. Такие функциональные изменения коррелировали с повышением экспрессии/активности ферментов антиоксидантной защиты (SOD-2 в подкожной артерии, SOD-1/SOD-2 в артериях почки). Вместе с тем в артериях почки потомства самок с преэклампсией выявлено повышение экспрессии NOX4, так что вопрос о роли НАДФН-оксидаз в регуляции тонуса сосудов 2-недельного потомства при экспериментальной преэклампсии пока не закрыт. В сердце 2-недельного потомства самок с преэклампсией не выявлено изменений частоты синусового ритма, а также временных характеристик потенциала действия клеток предсердного и желудочкового миокарда в базальных условиях. Однако мы впервые показали ослабление эффектов ацетилхолина на длительность потенциала действия (на уровне 90% реполяризации), а также на амплитуду и временные характеристики кальциевых волн в предсердном миокарде потомства самок с преэклампсией. Такие функциональные изменения были сопряжены со снижением уровня экспрессии мРНК калиевых TASK-1 каналов и повышением уровня экспрессии обменника NCX1, влияние которых на потенциал действия проявляется именно на заключительном этапе фазы реполяризации. Желудочковый миокард оказался устойчивым к влиянию материнской преэклампсии, как на функциональном уровне, так и на уровне генной экспрессии. Эффекты норадреналина на биоэлектрическую активность миокарда в результате материнской преэклампсии не изменялись. При регистрации показателей гемодинамики под наркозом частота синусового ритма также не различалась у потомства самок с преэклампсией и здоровых самок ни в базальных условиях, ни после выключения кардиотропных нервных влияний ганглиоблокадой. Изменения ЧСС при блокаде β1-адренорецепторов, основной мишени нейрогенного норадреналина в сердце, также были сходными у двух групп крысят, что находится в соответствии с отсутствием различий в эффектах норадреналина на изолированные препараты миокарда. Тонические парасимпатические влияния на сердце у крысят в 2-недельном возрасте еще не были выражены. Таким образом, материнская преэклампсия не оказывает выраженных эффектов на частоту сердечных сокращений и ее нервную регуляцию у 2-недельного потомства. Нами впервые установлен факт, что на системном уровне следствием материнской преэклампсии может быть снижение базального уровня АД в период раннего постнатального онтогенеза. Межгрупповые различия в уровне АД сглаживались после ганглиоблокады, что говорит об их связи с величиной нейрогенного тонуса сосудов и предполагает его снижение у потомства самок с преэклампсией. Для проверки этого предположения мы оценили плотность симпатической иннервации сердца и сосудов у потомства двух групп самок. Было показано, что у 2-недельного потомства самок с преэклампсией уменьшена плотность симпатической иннервации артерий (подкожной артерии) и предсердного миокарда по сравнению с потомством здоровых самок. Таким образом, дефицит NO может задерживать функциональное созревание как клеток сосудистой стенки, так и их симпатической иннервации, в связи с чем в сердечно-сосудистой системе потомства самок с преэклампсией дольше сохраняются черты «неонатального фенотипа». Полученные результаты важны для понимания механизмов пластичности сердечно-сосудистой системы при воздействиях различного характера в период ее структурного и функционального созревания.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект направлен на изучение в экспериментах на лабораторных животных (крысах) фенотипических модификаций, которые возникают в сердечно-сосудистой системе во время внутриутробного развития организма при экспериментальной преэклампсии (дефиците регуляторного влияния NO в период пренатального онтогенеза) или физической тренировки матери во время беременности, и могут сохраняться в течение последующей жизни. Главным достижением нашей работы в 2020 г. стало выявление ряда регуляторных сдвигов в организме взрослого потомства (возраст 16-18 недель), рожденного от самок крыс с экспериментальной преэклампсией, которую моделировали путем потребления самками раствора ингибитора NO-синтаз L-NAME (250 мг/л) с 10 дня беременности до родов. Наши результаты позволяют ответить не неизученный ранее вопрос: какие регуляторные механизмы в сердечно-сосудистой системе взрослого потомства наиболее подвержены патологическим изменениям вследствие материнской преэклампсии. Следует отметить, что такие изменения являются следствием дефицита регуляторного влияния NO на организм в период внутриутробного и первые дни постнатального развития, поскольку уже к 2-недельному возрасту содержание метаболитов NO в крови потомства самок с преэклампсией восстанавливается до контрольного уровня В целом использованная нами экспериментальная модель преэклампсии не была сопряжена с развитием катастрофических, угрожающих жизни изменений в организме взрослого потомства. Несмотря на небольшое уменьшение массы тела, масса органов и большинство гормональных и биохимических показателей крови, а также показатели, характеризующих функционирование почек, у крыс экспериментальной группы не были изменены по сравнению с контролем. Однако у таких животных наблюдались выраженные изменения в регуляции сердечно-сосудистой системы. Механизмы регуляции тонуса сосудов и экспрессию в их ткани генов и белков исследовали в сосудистом русле кожи, почки и сердца потомства. Оказалось, что отставленные эффекты преэклампсии на сосудистую систему обладают яркой регионарной специфичностью. Так, нами не было обнаружено сильно выраженных изменений в механизмах регуляции тонуса сосудов в подкожной артерии и в коронарном русле. Однако мы впервые показали, что сосудистое русло почки взрослого потомства подвержено глубоким изменениям вследствие материнской преэклампсии. Артерии почки таких животных демонстрировали увеличенную адренореактивность и уменьшенные реакции эндотелий-зависимого расслабления, что в обоих случаях было связано со снижением активности эндотелиального NO-пути. Согласно нашим данным, снижение активности NO-пути вследствие материнской преэклампсии происходит как на уровне гладкой мышцы артерий, что проявляется в уменьшении ее чувствительности к NO, так и на уровне регуляции синтеза NO в эндотелии. Мы показали, что в результате преэклампсии именно в эндотелии, а не в гладкой мышце, почечных артерий взрослого потомства повышается активность Rho-киназы, которая ингибирует eNOS путем фосфорилирования по сайту Thr495. Подобные изменения в сосудистом русле почки можно охарактеризовать как неблагоприятные, поскольку они повышают риск развития почечной дисфункции. Далее мы исследовали биоэлектрическую активность миокарда правого предсердия и впервые показали, что у взрослого потомства самок с преэклампсией наблюдается снижение эффектов ацетилхолина на длительность потенциала действия. С учетом представлений о протекторном влиянии ацетилхолина в сердце такие отставленные последствия преэклампсии также можно трактовать как негативные. При регистрации артериального давления и частоты сердечных сокращений в бодрствующем состоянии не было обнаружено различий между потомством самок с преэклампсией и контрольными животными. Однако при ганглиоблокаде у взрослого потомства самок с преэклампсией наблюдалось менее выраженное уменьшение артериального давления по сравнению с контрольными животными, что вкупе с нашими данными об уменьшении плотности симпатической иннервации некоторых регионов сосудистого русла предполагает снижение нейрогенного тонуса периферических сосудов. Еще одним ярким изменением в организме взрослого потомства самок с преэклампсией было выраженное снижение как парасимпатических, так и симпатических влияний на пейсмекер сердца, а также подавление барорефлекторной модуляции сердечного ритма. Хотя сократимость миокарда у таких животных не была изменена по сравнению с контролем, нарушение нервной регуляции сердечного ритма, несомненно, является негативным последствием материнской преэклампсии. Вторым достижением нашей работы в 2020 году стала комплексная оценка состояния сердечно-сосудистой системы потомства крыс, выполнявших в течение всей беременности регулярную физическую нагрузку (произвольный бег в колесе), включая изучение возрастной динамики потенциальных эффектов. Мы впервые показали, что в раннем постнатальном периоде (возраст 2 недели) физическая тренировка матери может приводить к увеличению плотности симпатической иннервации артерий, что предполагает ускорение процессов развития сердечно-сосудистой системы потомства и механизмов ее регуляции. Адренореактивность артерий почек и кожи у 2-недельного потомства самок, выполнявших в течение беременности регулярную физическую нагрузку, была увеличена по сравнению с контролем, а изменения механизмов регуляции тонуса сосудов в ряде случаев были разнонаправленными в разных органах. Поскольку антиконстрикторное влияние NO было увеличено в артериях кожи, но уменьшено в артериях почки крысят экспериментальной группы по сравнению с контрольными животными, повышение системного артериального давления в ответ на блокаду синтеза NO закономерно не различалось между группами. У 2-недельного потомства самок, тренированных к физической нагрузке, не наблюдалось изменений базального уровня артериального давления и снижения давления при ганглиоблокаде. Также физическая тренировка беременной самки не вызывала изменений в сердце крысят: частоты сердечных сокращений в базальных условиях и после ганглиоблокады или блокады β1-адренорецепторов, а также реактивности предсердного миокарда на ацетилхолин. Взрослое потомство самок, выполнявших в течение беременности регулярную физическую нагрузку, не отличалось от потомства самок контрольной группы по массе тела и органов, а также большинству гормональных и биохимических показателей крови. Эффекты физической тренировки матери на сосудистое русло взрослого потомства характеризовались регионарной специфичностью, как и в 2-недельном возрасте. Тренировка матери не изменяла сократительные ответы подкожной и коронарных артерий и антиконстрикторное влияние NO в этих артериях. Однако сократительные ответы артерий почки у потомства самок, тренированных к физической нагрузке, были уменьшены по сравнению с контролем, в противоположность изменениям у взрослого потомства самок с экспериментальной преэклампсией. Механизмы регуляции артериального давления и частоты сердечных сокращений, а также сократимость миокарда и ее изменения при действии медиаторов автономной нервной системы также не различались у взрослого потомства тренированных к физической нагрузке и контрольных самок. Таким образом, в период раннего постнатального онтогенеза изменения в сердечно-сосудистой системе потомства, обусловленные физической тренировкой матери во время беременности, носят сложный характер и далеко не всегда противоположны изменениям, выявленным нами ранее у потомства самок с преэклампсией. Однако во взрослом возрасте физическая тренировка матери и экспериментальная преэклампсия оказывают разнонаправленное влияние на ряд показателей, таких как регуляция тонуса артерий почки и формирование симпатической иннервации сосудов. Это предполагает, что сочетанное применение двух воздействий может обеспечить взаимную компенсацию вызываемых изменений и тем самым коррекцию долговременных и потенциально негативных изменений в сердечно-сосудистой системе взрослого потомства самок с преэклампсией. Еще одной потенциальной мишенью физической тренировки матери может служить развивающееся вследствие материнской преэклампсии глубокое нарушение нервной регуляции сердечного ритма, с большой вероятностью снижающее адаптивные возможности сердца и организма в целом. Следует отметить, что поскольку риск развития заболеваний сердечно-сосудистой системы повышается с возрастом, отставленные последствия преэклампсии матери у взрослого потомства, а также возможность их коррекции с помощью произвольной физической тренировки матери во время беременности представляют наибольший интерес.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Важным результатом работы по проекту в 2021 г. является экспериментальная проверка гипотезы о коррекции сердечно-сосудистых патологий в организме взрослого потомства самок с преэклампсией с использованием физической тренировки матери во время беременности. Преэкламсию моделировали с использованием ингибитора синтеза оксида азота L-NAME (потребление с питьевой водой в концентрации 250 мг/л с 10 дня беременности до родов). В работе использовали разработанную нами методику физической тренировки в произвольном режиме нагрузки (бег в колесе), которая обеспечивает естественный и комфортный для крыс паттерн двигательной активности и не вызывает их стрессирования. Кроме того, эта методика обеспечивает соответствие интенсивности нагрузки функциональному состоянию организма (ухудшение состояния сопровождается снижением беговой активности и наоборот). Это ярко проявлялось в нашем эксперименте: в первой половине беременности самки демонстрировали достаточно высокий уровень беговой активности, но при потреблении L-NAME их суточный пробег снижался, что, по всей видимости, было связано c развитием артериальной гипертензии и брадикардии. Однако самки продолжали бегать в колесе и в период потребления L-NAME, в связи с чем физическая активность матери могла оказывать влияние на внутриутробное развитие будущего потомства в течение всего периода пренатального онтогенеза. Физическая активность самок, потреблявших L-NAME, не оказывала влияния на прирост массы тела во время беременности, биохимические и гормональные показатели крови, а также длительность беременности, количество и массу тела крысят в помете. Тренировка не затронула ключевые характеристики индуцированной L-NAME экспериментальной преэклампсии, такие как развитие артериальной гипертензии и снижение содержания метаболитов NO в крови, что можно объяснить сравнительно небольшой длительностью воздействия (беременность у крыс длится всего три недели), а также локализацией изменений не во всех, а лишь в определенных регионах сосудистого русла. Также надо отметить, что эти показатели были измерены у самок в спокойном состоянии и могут не вполне отражать регуляторные сдвиги в организме, возникающие во время бега в колесе. Важно, что ряд негативных последствий материнской преэклампсии был менее выраженным в сердечно-сосудистой системе потомства тренированных самок, что говорит о высокой чувствительности плода к условиям внутриутробного развития. Произвольная физическая тренировка способствовала нормализации нервной регуляции тонуса сосудов и работы сердца, которые были нарушены у потомства вследствие преэклампсии матери. Во-первых, тренировка предотвращала снижение уровня системного АД, которое было характерным для потомства неактивных самок с преэклампсией. Снижение АД у потомства самок с преэклампсией коррелировало со снижением мощности низкочастотных колебаний АД (в диапазоне 0.25-0.75 Гц) и устранялось блокадой ганглионарной передачи, что указывает на его связь со снижением нейрогенного тонуса сосудов. Во-вторых, физическая тренировка матери ослабляла негативное влияние преэклампсии на парасимпатическую регуляцию сердца, что проявлялось в нормализации сниженных вследствие преэклампсии реакций ЧСС при блокаде и активации периферических М-холинорецепторов. Эффекты агониста холинорецепторов на биоэлектрическую активность рабочего миокарда правого предсердия не различались у потомства, полученного от трех групп самок, также не было выявлено межгрупповых различий генной экспрессии в предсердии. Это говорит о том, что рабочий миокард предсердий менее подвержен изменениям вагусной регуляции вследствие преэклампсии и физической тренировки матери, чем пейсмекерная область сердца. Вопрос о влиянии преэклампсии и тренировки на центральные механизмы регуляции ЧСС требует дальнейшего исследования. Поскольку вагусные влияния играют кардиопротекторную роль, коррекция нарушений вагусной регуляции сердца, возникающих при неблагоприятных воздействиях на плод, с помощью физической тренировки матери представляет не только фундаментальный, но и прикладной интерес. В 2020 г. мы показали, что сосудистое русло почки взрослого потомства подвергается глубоким изменениям вследствие материнской преэклампсии. Междолевые артерии почки таких животных демонстрировали увеличенную адренореактивность и уменьшенные реакции эндотелий-зависимого расслабления, что было связано со снижением активности eNOS вследствие ингибиторного фосфорилирования Rho-киназой. Напротив, адренореактивность артерий почек у потомства тренированных самок с нормально протекающей беременностью была снижена по сравнению с контролем. Поэтому мы ожидали, что изменения в сосудистом русле почки вследствие тренировки матери смогут скомпенсировать нарушения регуляции, вызванные преэклампсией. Однако физическая тренировка не оказала влияния на адренореактивность артерий почки, активность в них регуляторных путей NO и Rho-киназы и экспрессию белков-участников этих путей. Поскольку NO является ключевым регулятором развития почки плода, даже сравнительно небольшое снижение биодоступности NO во время внутриутробного развития может вызывать необратимые изменения функционирования почки в постнатальном онтогенезе, которые не поддаются репрограммированию под влиянием специфических условий, которым подвергается плод во время выполнения самкой физической нагрузки. В заключительной части работы мы изучали роль метилирования ДНК в долговременных изменениях экспрессии генов, обусловленный дефицитом NO в период пренатального онтогенеза. Объектом исследования служили артерии почки, для которых нами было показано изменение экспресcии SOD1, а также более выраженное влияние ингибитора SOD на реакции эндотелий-зависимого расслабления взрослого потомства самок с преэклампсией по сравнению с артериями потомства контрольных самок. Исследовали метилирование промоторного участка гена Sod1, а также генов Sod2 и Sod3. Мы провели биоинформатический анализ и показали, что промоторы этих генов содержат CpG-островки, которыми особенно богаты гены Sod1 и Sod3: в пределах 400 п.н. перед точкой начала транскрипции находится 34 и 30 CpG-последовательностей соответственно, причём начало транскрибируемой области (после старта транскрипции) этих генов тоже содержит большое число CpG-островков. В промоторной области гена Sod3 были обнаружены четыре CpG-островка. Исследование метилирования промоторных областей генов было выполнено с помощью бисульфитной конверсии ДНК и ПЦР «в реальном времени» с праймерами, специфичными к метилированным сайтам. О корректности использованной методики говорят результаты определения уровня метилирования гена eNOS (Nos3, содержит восемь CpG-островков в промоторной области). Известно, что специфическая экспрессия eNOS в эндотелии сосудов определяется метилированием промотора гена Nos3 в гладкомышечных клетках. В промоторе гена Nos3 уровень метилирования в артериях обеих групп крыс составил приблизительно 80%, что вполне оправданно, так как медия мелких артерий состоит из 5-6 слоев гладкомышечных клеток, объем каждой из которых больше, чем объем клетки эндотелиального монослоя. Уровни метилирования генов, кодирующих SOD, в артериях почки были очень низкими: Sod1 – 2.4%, Sod2 – 0.8%, Sod3 – 7%. Мы не выявили статистически значимых различий метилирования генов Sod1, Sod2 и Sod3 в образцах артерий почки взрослого потомства, полученного от самок контрольной группы и группы, потреблявшей L-NAME. Таким образом, метилирование ДНК не является механизмом, посредством которого дефицит оксида азота вызывает долговременные изменения экспрессии и активности SOD в артериях почки.