КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-15-00132

НазваниеОценка возможности использования спектроскопии комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния тромбоцитов периферической крови для персонализации антиагрегантной терапии сердечно-сосудистых заболеваний

РуководительРафальский Владимир Витальевич, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта", Калининградская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 2019 г. - 2021 г. 

Конкурс№35 - Конкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-501 - Фармацевтическая химия, фармакология (в том числе клиническая фармакология)

Ключевые словаПерсонализированная медицина, фармакотерапия, профилактика, сердечно-сосудистые заболевания, антиагреганты, аспирин, клопидогрель, тромбоциты, спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния, золотые наночастицы, нанокомпозиты

Код ГРНТИ76.29.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире. По оценкам экспертов ВОЗ в 2016 году от ССЗ умерло 17,9 миллионов человек, что составило 31% от всех случаев смерти в мире. Активация тромбоцитов – ключевой момент в патогенезе ССЗ, поэтому ингибирование тромбоцитарной агрегации является в настоящее время ключевым терапевтическим подходом в лечении и профилактике ССЗ атеросклеротического генеза. Эффективность современной антиагрегантной терапии (АТ) в настоящее время недостаточно высока, в частности, прием одного антитромбоцитарного препарата (АП), например, аспирина снижает риск развития инфаркта миокарда только на 20-31%. Поэтому разработка новых, более эффективных методов прогнозирования ответа пациентов на АТ и последующую ее коррекцию, является важнейшей задачей современной медицины. Настоящий проект направлен на решение проблемы персонализации АП при ССЗ на основании результатов анализа спектров комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния и выявления потенциальных корреляций с функциональной активностью тромбоцитов периферической крови. Основным преимуществом выбранного в данном проекте метода изучения состояния тромбоцитов – КР и ГКР-спектрометрия – является неинвазивность и возможность собрать большой объем информации. В частности, с помощью КР-спектроскопии можно получить информацию о биохимическом составе клеток, конформациях молекул без разрушения клеток. Для КР-спектроскопии характерна относительная простота пробоподготовки и большой объем получаемой информации; получение как количественных, так и качественных характеристик образца. В ходе реализации проекта планируется решение следующих задач: 1) разработка оптимальных методик выделения тромбоцитов периферической крови для получения и идентификации спектров комбинационного рассеяния (КР) и гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) единичных клеток; 2) разработка методики синтеза абляционных наночастиц золота и наноструктурированных поверхностей для реализации эффекта ГКР как высокочувствительного метода детектирования функциональных особенностей единичного тромбоцита; 3) разработка методики химического синтеза многофункциональных биоконъюгированных композитных наноконструкций (НК) на основе золота, нагруженных лекарственными средствами (ЛС): ацетилсалициловой кислотой и активным метаболитом клопидогреля в целях детекции изменений структуры и функции единичного тромбоцита периферической крови; 4) отработка методов регистрации спектров КР и ГКР (включая картирование) тромбоцитов периферической крови, инкубированных с НК на базе золотых наночастиц in vitro; 5) изучение спектров КР и ГКР тромбоцитов периферической крови здоровых лиц и пациентов с ИБС, выделение типичные и атипичные спектры рассеяния; проведение спектральноного анализа структуры тромбоцита по результатам ГКР спектроскопии с выделением типичных и атипичных спектров рассеяния; 6) сопоставление КР и ГКР спектров единичных тромбоцитов периферической крови, полученных у пациентов с различными формами ишемической болезни сердца, с функциональным состоянием (агрегационной активностью) тромбоцитов периферической крови. Спектры КР тромбоцитов будут получены с использованием спектрометра Centaur со спектральным разрешением 2 см-1. Основными рабочими источниками для регистрации КР и ГКР спектров будет являться лазеры с длиной волны возбуждения 632 нм, 532 нм и 785 нм. Для обработки спектральных данных будет использована система BioRad-KnowItAll Informatics. Для выявления особенностей ГКР спектров тромбоцитов, коррелирующих с функциональным ответом на разные варианты антиагрегантной терапии, будут использованы синтезированные многофункциональные биоконъюгированные композитные наноконструкции (НК) на основе золота, нагруженных ацетилсалициловой кислотой и активным метаболитом клопидогреля. В качестве источника тромбоцитов будет использована периферическая венозная кровь, полученная у здоровых добровольцев и пациентов с разными формами ишемической болезни сердца. Функциональная активность тромбоцитов будет оценена по характеру изменений их агрегационной (спонтанной и индуцированной) активности. Для этого все образцы параллельно будут изучены на агрегометрах с различным принципом изучения активности тромбоцитов: 1) Chrono-log 490 - для изучения функции тромбоцитов методом оптической световой агрегометрии в обогащенной тромбоцитами плазме; 2) CHRONO-LOG 590 - для проведения исследования функции тромбоцитов с помощью импедансной модели на цельной крови; 3) потоковый анализатор активности тромбоцитов PFA-200 - для моделирования тромбоцитарного гемостаза в условиях приближенных к in vivo. Научная новизна проекта заключается в том, что впервые будут систематически изучены спектры КР и ГКР рассеяния тромбоцитов периферической крови, разработаны условия для их оптимальной регистрации. Впервые спектры КР и ГКР рассеяния тромбоцитов будут сопоставлены с функциональным состоянием тромбоцитов. Авторский коллектив впервые синтезирует, получит характеристики и использует на практике многофункциональные биоконъюгированные композитные наноконструкции на основе золота, нагруженные антиагрегантами - ацетилсалициловой кислотой и активным метаболитом клопидогреля для регистрации спектров ГКР рассеяния тромбоцитов. Впервые будут исследованы оптические свойства, синтезированных НК, проверена корректная работа ГКР-репортеров, установлено наличие плазмонного возбуждения, а также размеров НК методами спектроскопии поглощения и фотокорреляционной спектроскопии. Впервые будет выполнено исследование морфологии синтезированных частиц методом сканирующей электронной микроскопии, рассчитаны значения напряженности ЭМ поля в «горячих точках» в случае сферической частицы (для варьируемых размеров) и в плоском случае (поверхность), с применением FDTD метода.

Ожидаемые результаты
В ходе реализации проекта будут получены следующие результаты: 1. Выбран оптимальный метод выделения тромбоцитов периферической крови для их последующего изучения с помощью спектроскопии комбинационного (КР) и гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). 2. Отработаны экспериментальные методики и проведена регистрация сигнала КР-спектра тромбоцитов периферической крови. 3. Для регистрации ГКР спектров тромбоцитов периферической крови - будут получены золотые наночастицы различных размеров (20-100 нм) с помощью фемтосекундной и наносекундной лазерной абляции; будет проведено исследование их оптических и морфологических свойств (плазмонное возбуждение, размер частиц); - будет разработана методика и осуществлен синтез наноструктурированных поверхностей золота методом электрохимического осаждения золота, а также исследованы морфологические свойства синтезированных поверхностей (шероховатость, наличие кластерной структуры); рассчитана напряженность ЭМ поля в «горячих точках» в случае сферической частицы (для варьируемых размеров) и в плоском случае (поверхность) с применением FDTD метода. 3. Будут выполнены ГКР исследования (включая микрорамановское картирование) единичных тромбоцитов на наноструктурированных подложках золота и абляционных частицах. 4. Для выявления специфичных особенностей спектров КР и ГРК рассеяния тромбоцитов, возникающих при взаимодействии тромбоцитов и отдельных антиагрегантов: - будет разработан химический метод синтеза многофункциональных биоконъюгированных композитных наноконструкций (НК) на основе золота, нагруженных антиагрегантами - ацетилсалициловой кислотой и активным метаболитом клопидогреля; НК будут включать в свой состав: НЧ золота, ГКР-метку, биодеградируемый полимер, один из антиагрегантов; - будут выполнены исследования оптических свойств синтезированных НК, проверена корректная работа ГКР-репортеров, установлено наличие плазмонного возбуждения, и определение их размеров методами спектроскопии поглощения и фотокорреляционной спектроскопии; выполнено исследование морфологии частиц методом сканирующей электронной микроскопии; - будут рассчитаны значения напряженности ЭМ поля в «горячих точках» в случае сферической частицы (для варьируемых размеров) и в плоском случае (поверхность) с применением FDTD метода. 5. Будет выполнена регистрация и исследование ГКР единичных тромбоцитов периферической крови при использовании комплексов НК-антиагрегант. 6. Будет проведен спектральный анализ полученных КР и ГКР спектров у пациентов с различными формами ишемической болезни сердца (ИБС). 7. Будут получены данные, позволяющие выделить потенциальные корреляции между функциональной активностью тромбоцитов периферической крови здоровых добровольцев и пациентов с ишемической болезнью сердца, получающих и не получающих антиагрегационную терапию. 8. Результаты исследования позволят разработать оптимальнын методики выделения тромбоцитов периферической крови, регистрации их КР и ГКР спектров, а также определить наиболее подходящие характеристики КР и ГКР спетров тромбоцитов для использования при индивидуальном подборе наиболее эффективной антиагрегантной терапии. Научная ценность реализации проекта заключается в том, что впервые будут систематически изучены спектры КР и ГКР рассеяния тромбоцитов периферической крови, разработаны условия для их оптимальной регистрации. Впервые будут сопоставлены спектры КР и ГКР рассеяния тромбоцитов периферической крови здоровых лиц и пациентов с ишемической болезнью сердца с функциональным состоянием тромбоцитов. Авторский коллектив впервые синтезирует и получит характеристику, а также использует на практике многофункциональные биоконъюгированные композитные наноконструкции на основе золота, нагруженные антиагрегантами - ацетилсалициловой кислотой и активным метаболитом клопидогреля для регистрации спектров ГКР рассеяния. Впервые будут исследованы оптические свойства, синтезированных НК: проверена корректная работа ГКР-репортеров, установлено наличие плазмонного возбуждения, и их размеров методами спектроскопии поглощения и фотокорреляционной спектроскопии. Впервые будет выполнено исследование морфологии синтезированных частиц методом сканирующей электронной микроскопии, рассчитаны значения напряженности ЭМ поля в «горячих точках» в случае сферической частицы (для варьируемых размеров) и в плоском случае (поверхность) с применением FDTD метода. Практическая ценность полученных данных заключается в том, что будет создана методологическая база для активного использования метода КР и ГКР спектроскопии для характеристики тромбоцитов периферической крови. Одним из возможных путей использования этого нового научного направления является персонализированная медицина. Результаты реализации проекта позволят выделить параметры спектров КР и ГКР рассеяния тромбоцитов, коррелирующих с высокой функциональной активностью тромбоцитов периферической крови пациентов и сопоставить полученные данные с профилем антиагрегантной терапии. Совокупность полученных данных позволит предложить для дальнейшего клинического изучения и внедрения в клиническую практику методики пробоподготовки тромбоцитов, режимы регистрации КР и ГКР спектров, а также конкретные параметры спектров КР и КГР рассеяния тромбоцитов, которые могут быть предикторами плохого ответа на антиагрегантную терапию. Учитывая высокую социальную и клиническую значимость сердечно-сосудистых заболеваний, высокую смертность и инвалидизацию от их осложнений, а также недостаточную эффективность современной антиагрегантной терапии, полученные в ходе реализации проекта данные представляют высокую ценность для клинической практики и позволят корректировать антиагрегантную терапию у отдельных пациентов с индивидуальной реакции тромбоцитов на антиагреганты. Новое направление в использовании КР и ГКР спектроскопии имеет высокий приоритет для коммерциализации – полученные данные позволят определить направление для разработки анализаторов функции тромбоцитов нового поколения.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Одним из основных результатов полученных в ходе реализации первого года проекта является выявление изменений в спектральных сдвигах и интенсивностей для исследуемых групп пациентов. В частности, выявлены различия в спектрах области дисульфидных мостов (S=S связи) низкочастотной области, группах тирозина, триптофана и амидных группах. Было показано отличие спектров здоровых пациентов от спектров здоровых пациентов находящихся на терапии, пациентов с ССД, находящихся на терапии. В результате выполнения работ были показаны спектральные различия для S-S колебаний цистеина 517 и 544 см−1 для C–C колебаний для фениниланина и тирозина на 614 см−1 и 643 см-1 соответственно; колебаний триптофана на 757 см-1 и 829 см−1; для колебаний ароматических групп в тирозине и фосфатных группах на 851 см−1; ν(Cβ–methyl) в протеинах на 1130 см-1; колебаний Tyr на 1206 см-1 в плазме; колебаний ароматических групп в триптофане на 1341см-1; тирозиновых ароматических групп на 1614 см-1, C=C колебаний в группе Амида I на 1666 см-1. В результате реализации проекта в течение первого года были достигнуты следующие научные результаты. Подобрана и отработана оптимальная методика выделения тромбоцитов из периферической крови. Отработана оптимальная методика для получения разрешенных спектров тромбоцитов периферической крови человека, для чего использовался спектрометр комбинационного рассеяния Centaur U HR с решеткой выбранной решеткой монохроматора 1200 шт/мм, обеспечивающей спектральное разрешение 2,5 см-1. Оптимальным источником возбуждения для регистрации спектров тромбоцитов являлся лазер DPSS с длиной волны 532 нм (совпадающий с максимумами плазмонных резонансов титана и золота). Была проведена теоретическая оценка плазмонных возмущений на поверхности шероховатого титана и меди с нанесенными наночастицами золота размером 50 нм, отстоящими друг от друга на 2 нм. Был применен метод конечных разностей во временной области (FTDT-метод). Моделирование было осуществлено в программной среде для расчетов электромагнитных возмущений Lumerical FTDT Solution. Было осуществлено облучение поверхностей p-поляризованной электромагнитной волной, после чего рассчитывалась напряженность электромагнитного поля, а затем его амплитуда. Средняя расчетная амплитуда электромагнитного поля в «горячих точках» поверхности для меди составила 23,42 раза, для титана 40,65 раз. Было продемонстрировано, что титановая шероховатая поверхность с нанесенными частицами абляционного золота является более перспективной для использования в качестве усиливающей рассеяние среды для экспериментов с тромбоцитами, чем медная. Разработана методика синтеза абляционных наночастиц золота, диаметром до 100 нм, успешно примененных для регистрации ГКР-спектров. Были синтезированы сферические наночастицы золота методом фемтосекундной лазерной абляции золотой пластины в дистиллированной воде на установке TETA-X, (AVESTA, Россия). Оптимальная длительность импульсов составляла 280 фс, частота падающего излучения составляла 25 кГц. Энергия подаваемого на пластину лазерного излучения варьировалась в диапазоне диапазоне Е=10-25 мкДж. Другим подходом к синтезу наночастиц золота являлся синтез наночастиц золота с помощью наносекундной лазерной абляции. Такой синтез выполнялся на установке LQ629 (SOLAR LS, Беларусь) в режиме Q-switch (длительность импульсов 10 нс, частота 12 Гц) в дистиллированной воде. Таким образом, была успешно отработана методика получения наночастиц различного радиуса в зависимости от энергии наносекундного лазера. Было показано, что в процессе фемтосекундной лазерной абляции при энергии лазерного излучения E=20 мкДж были синтезированы наночастицы двух различных радиусов 8 нм (10%) и 80 нм (90%). При энергии лазерного излучения E=15 мкДж синтезированы наночастицы радиусом 60 нм (95%). При энергии лазерного излучения E=10 мкДж радиусы наночастиц составляют 40 нм. Также, было установлено, что для частиц, полученных с использованием наносекундного лазера LQ 629 преобладала сферическая форма и размер 8-100 нм. Размер частиц зависел от энергии наносекундного импульса, подаваемого на образец. Было установлено, что при энергии лазерного излучения E=20 мДж синтезированы наночастицы двух различных радиусов 15нм (12%) и 100 нм (88%). При энергии лазерного излучения E=15 мкДж синтезированы наночастицы радиусом 52 нм (83%). При энергии лазерного излучения E=10 мкДж радиусы наночастиц средний радиус частиц составляет 45 нм (70%). АСМ-изображения размером 10х10 микрон были сняты для чистых титановых поверхностей, поверхностей при анодировании для напряжения 10 В , 40 В, а также поверхностей с наночастицами золота. Было продемонстрировано наличие шероховатостей поверхности после анодирования и наличия золотых наночастиц на поверхности, способных усиливать сигнал КРС. По результатам применения методик исследования морфологии и оптических свойств было показано, что, максимум плазмонного резонанса как золотых частиц, так и титановых поверхностей располагается в диапазоне длин волн 510-530 нм (Рис 9. А-Б). Данный факт был использован для создания ГКР-усиливающих сред, путем реализованного осаждения абляционных наночастиц золота на титановые шероховатые поверхности. Была также отработана методика создания шероховатого титана для чего проводили анодирование при различных режимах плотности тока j= 1; 2; 4; 7 mA/cm2 и различном времени анодирования. Поверхность титана после анодирования принимала желтый, темно-синий, синий и голубой цвета в результате формирования оксидной пленки нанометровой толщины. На данные поверхности далее были нанесены наночастицы абляционного золота. Такая схема позволила реализовать эффект ГКР и получить разрешенный спектр рассеяния от тромбоцитов, помещенных на такие подложки. Были успешно отработаны методики как инкубации тромбоцитарной взвеси с наночастицами золота, так и спектральной съемки тромбоцитов на наноструктурированных титановых поверхностях модифицированных абляционными частицами золота. В случае инкубации тромбоцитов с наночастицами золота, коллоидное золото, полученное с помощью метода фемтосекундной лазерной абляции добавлялось в количестве 5 мкл к 5 мкл тромбоцитарной взвеси. Съемка проводилась как в капле жидкости, так и на высушенной поверхности. Было показано, что ГКР-спектроскопия тромбоцитов с помощью инкубации с наночастицами оказалось низкоэффективной. В тоже время, съемка на шероховатой поверхности позволила успешно снять ГКР-спектры тромбоцитов с усилением КР-сигнала до 102 раз.

 

Публикации

1. Зюбин А.Ю., Рафальский В.В., Цибульникова А.В., Матвеева К.И., Моисеева Е.М., Колосова В.В., Мицюк В.О., Цапкова А.А., Самусев И.Г. Single human platelet study using surface-enhanced Raman spectroscopy as a perspective tool for antiplatelet therapy effectiveness prediction Progress in Biomedical Optics and Imaging - Proceedings of SPIE, Proc. SPIE 11190, Optics in Health Care and Biomedical Optics IX, 111900K (20 November 2019) (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2536384

2. Рафальский В.В., Зюбин А.Ю., Моисеева Е.М., Самусев И.Г. Перспективы применения метода спектроскопии комбинационного рассеяния света (рамановской спектроскопии) в кардиологии Кардиоваскулярная терапия и профилактика, Кардиоваскулярная терапия и профилактика.- 2020.- т.19, №1 (год публикации - 2020)

3. Рафальский В.В., Зюбин А.Ю., Моисеева Е.М., Цапкова А.А. Raman spectroscopy and surface enhanced Raman spectroscopy as a promising approach for assessment of platelet function European Journal of Molecular & Clinical Medicine, 6(1), pp. 1–21, European Journal of Molecular & Clinical Medicine, 6(1), pp. 1–21. DOI: https://doi.org/10.5334/ejmcm.262 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.5334/ejmcm.262

4. - Физик БФУ им. И. Канта представил результаты исследования структуры тромбоцита с помощью спектроскопии на международном симпозиуме в Китае Портал БФУ им Канта www.kantiana.ru, - (год публикации - )

5. - Российский научный фонд поддержал несколько проектов научных коллективов БФУ им. И. Канта Портал БФУ им Канта www.kantiana.ru, https://old.kantiana.ru/news/143/245738/?sphrase_id=4659908 (год публикации - )


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
По результатам работы было продолжено формирование основных исследуемых групп пациентов. Группа 1 - здоровые добровольцы. Здоровые добровольцы были обследованы как до, так и после получения антитромбоцитарной терапии (аспирин, клопидогрель). Добровольцам было проведено физикальное обследование и оценка жизненно важных функций (АД, ЧСС, ЧДД, T тела), Выполнен общий анализ крови, СОЭ, коагулограмма с оценкой протромбинового времени АЧТВ, МНО. Группа 3 – пациенты со стабильными проявлениями атеротромбоза. В 2020 году были введены в эксплуатацию приобретенные агрегометры и отработаны методики работы на них. В рамках проведенных работ были отработаны методики пробоподготовки и методики получения данных функциональной активности тромбоцитов периферической крови добровольцев, как в спонтанном варианте, так и при использовании различных активаторов. Было проведено сопоставление спектров гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) изолированных тромбоцитов периферической крови с их функциональной активностью для выявления особенностей ГКР спектров, позволяющих характеризовать изменения в тромбоцитах, характеризующих агрегационную активность тромбоцитов у здоровых добровольцев. Функциональная активность тромбоцитов оценивалась по характеру изменений их агрегационной (спонтанной и индуцированной) активности. По результатам выполненной работы были модифицированы среды усиления ГКРС на основе титана и синтезированы коллоидные структуры на основе золота различных форм. Физическими методами был подтвержден эффект плазмонной генерации на поверхности таких структур. Были исследованы оптические свойства ГКРС структур на основе титана. Из этих свойств следует, что оптическая проводимость, а следовательно и поляризуемость, титановой структурированной поверхности с абляционными наночастицами превышает значение оптической проводимости для титановой структурированной поверхности с электрохимически-осажденными частицами золота. Следовательно, усиление процессов свечения и других оптических процессов более эффективно на поверхности с абляционными наночастицами. По результатам коллоидного синтеза был получен набор наносфер и наностержней в различных оболочках, имеющих варьируемые спектральные максимумы и подходящие для использования в длинноволновой области спектра. Для получения данных картирования использовался спектрометр Centaur U HR со спектральным разрешением 2,5 см-1, установленный в режим спектрального картирования. Для обеспечения спектрального картирования использовался прецизионный пьезостолик Ratis. В процессе реализации выработанной методики съемки образцы тромбоцитов помещались на модифицированные титановые поверхности с вышеописанными условиями, характерными для съемки спектров в точке. Размер лазерного пятна был установлен на минимальное значение 1 × 10 мкм. Область картирования выбиралась равной 160х160 мкм, 50х50 мкм, 10х10 мкм, 1х1 мкм. Время экспозиции регистрации сигнала составляло 30-80 секунд. Для каждого образца снималось три повтора, после чего спектр арифметически усреднялся. Спектры комбинационного рассеяния регистрировали в диапазоне волновых чисел «отпечатка пальца» в диапазоне от 400 см-1 до 1800 см-1. По итогам анализа области дисульфидных мостов были выявлены спектральные различия в интенсивности для цистеиновых составляющих дисульфидных мостов при 517 см–1 и 544 см–1; Также были выявлены спектральные различия в скелетных колебаниях фенинилаланина и тирозина при 614 см-1 и 643 см-1 соответственно; были выявлены различия для интенсивностей колебательных полос ароматических аминокислот – тирозина и триптофана как в низкочастотной 643 см-1, 829 см-1, 1341 см-1 (наличие колебания только в случае с ССЗ). Данный факт спектральных различий является важным результатом спектральных исследований, поскольку аминокислоты тирозин, триптофан и фенилаланин являются флуоресцентными и могут быть исследованы другими методами флуоресцентной и колебательной спектроскопии в дальнейшем. Также были обнаружены спектральные полосы для аминокислоты цистеин в зоне дисульфидных мостов S - S: cys6-cys127 при 507 (509) см-1; cys76-cys94 при 519 см-1; cys6-cys127 при 570 см-1. Были выявлены спектральные максимумы 545 см-1 и 531 см-1, которые также принадлежат мостикам S-S, Были зарегистрированы спектры комбинационного рассеяния тромбоцитов в спектральном диапазоне дисульфидных мостиков 450-575 см-1 для здоровых людей и лиц с сердечно-сосудистой патологией. Было обнаружено отсутствие максимума Cys6-cys127 при 570 см-1 у пациентов с ССЗ на антитромбоцитарной терапии, а также общее снижение интенсивности комбинационного рассеяния для всех полос. Было установлено, что максимумы Амид III для спектров здоровых тромбоцитов и тромбоцитов от пациентов сердечно-сосудистыми заболеваниями демонстрируют преимущественно α-спираль и вторичную структуру белка произвольной спирали. Для здоровых образцов основные характеристические полосы сосредоточены при 1244 см-1, 1265 см-1, 1272 см-1 и принадлежат случайной ориентации структуры (random coil) (при 1244 см-1) и α-спирали (при 1265 см-1 и 1272 см-1). Для образцов c ССД наблюдалась только одна полоса при 1282 см-1, которая также была сдвинута в красную область и связана с α-спиралью. Было установлено, что полоса Амид I для спектров здоровых тромбоцитов и тромбоцитов с сердечно-сосудистыми заболеваниями соответствует вторичной структуре белка α-спирали, β-витка и антипараллельного β-листа. Для здоровых образцов основные характеристические полосы сосредоточены при 1657 см-1, 1666 см-1, 1679 см-1 и соответствовали α-спирали, β-листу и антипараллельному β-слою соответственно. Для образцов от пациентов с ССЗ наблюдалась только одна полоса при 1673 см-1 (β-лист). Полоса 1614 см-1 для здоровых образцов соответствует моде колебания кольца ароматической аминокислоты Tyr. Было отмечено отсутствие полосы колебаний Tyr, что может быть результатом необратимого ингибирования циклооксигеназы аспирином, как описано выше. Также обнаружено снижение общей интенсивности в β-витке и антипараллельном β-листе. Полученные результаты могут быть использованы для разработки передовых методов оптической диагностики в клинической кардиологии. В частности, очень сложно обнаружить молекулярные изменения в тромбоцитах с помощью традиционного биохимического анализа и оптической микроскопии из-за снижения способности идентифицировать небольшие количества тромбоцитов. Более того, традиционные методы не могут обеспечить быстрый и точный диагностический инструмент для определения, как ингибирования агрегации единичных тромбоцитов, так и конформации их структуры, что важно для эффективности терапии быстрой диагностики, которая определяет дальнейший выбор терапии. Этот факт открывает определенные перспективы как для фундаментальных, так и для прикладных исследовательских целей SERS.

 

Публикации

1. Зюбин А.Ю., Рафальский В.В., Матвеева К.И., Моисеева Е.М., Цапкова А.А., Демишкевич Е.А., Самусев И.Г., Брюханов В.В. Photophysical properties of nanoparticle-dye-protein complexes for fluorescent labeling purposes PROCEEDINGS OF SPIE, Proc. SPIE 11557, Plasmonics V, 115570F (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1117/12.2575386

2. Зюбин А.Ю., Рафальский В.В., Цибульникова А.В., Моисеева Е.М., Цапкова А.А., Лятун И.И., Медведская П.Н., Самусев И.Г., Демин М.В. Surface-enhanced Raman spectroscopy for antiplatelet therapy effectiveness assessment Laser Physics Letters, №4, Т.17, p.045601 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1088/1612-202X/ab7be5

3. Зюбин А.Ю., Рафальский В.В., Цибульникова А.В., Моисеева Е.М., Цапкова А.А., Самусев И.Г., Брюханов В.В., Демин М.В. Dataset of human platelets in healthy andindividuals with cardiovascular pathology obtained by surface-enhanced Ramanspectroscopy Data in Brief, Т. 29, p.105145. (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.dib.2020.105145


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В течение 2021 года было для целей выполнения проекта было выполнено окончательное формирование популяции здоровых добровольцев и пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Общее количество обследованных субъектов составило 136. Субъекты были разделены на 5 групп: Группа 1 - Здоровые добровольцы без сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) без приема каких-либо антиагрегантных препаратов и любых НПВС в течение предыдущих 7 дней. Группа 2 здоровые добровольцы без сердечно-сосудистых заболеваний, подучающие до забора крови ацетилсалициловую кислоту (АСК) в дозировке 100-300 мг в сутки в течение 1-3 дней. Группа пациенты с ишемической болезнью сердца с с риском по шкале SCORE >5, не получающие терапию какими-либо антиагрегантными препаратами и любыми НПВС в течение предыдущих 7 дней. Группа 4 аналогичные критериям группы 3, получающие стабильную терапию АСК в дозировке 75-100 мг. Группа 5 – пациенты в остром периоде инфаркта миокарда. У всех субъектов кроме общеклинических обследований проводили оценку реактивности тромбоцитов и исследование тромбоцитов с помощью ГКР спектроскопии. В качестве источника тромбоцитов будет использована периферическая венозная кровь. Важным результатом, полученным на данном этапе проекта являлись эксперименты по оценке степени спектральной гомогенности тромбоцитов. Все спектры были статистически обработаны с применением метода главных компонент (PCA), а также с помощью статистического алгоритма, разработанного на базе лаборатории. По результатам исследования гомогенности спектров тромбоцитов была выдвинута и подтверждена гипотеза о спектральном подобии тромбоцитарных спектров, показана хорошая спектральная однородность. Совокупная дисперсия (CV) набора данных показала, что главные компоненты PC1-PC3 ответственны за 97% всех спектральных вариаций: PC1 = 81,8%; PC2 = 93,4%; ПК3 = 97,2%. С другой стороны, значение процентной дисперсии (PV) составляло 3,5% для спектральных вариаций: PC1 = 81,27%; PC2 = 12,09% PC3 = 3,29%. Было использовано расстояние Махаланобиса как специфический параметр внутри спектров для определения подобия рамановских спектров. Расчетное расстояние Махаланобиса было вычислено для 91 спектра и составляло не более 5, а для трех спектров - 14, 32 и 91. Оно показало минимальное отклонение для 97% спектрального набора. Сделан вывод, что спектры тромбоцитов очень однородны. Для дополнительного изучения спектральной гомогенности тромбоцитов был реализован второй подход, в результате которой были сравнены спектры 1) снятые с разных точек одной капли и 2) спектры разных капель, взятых у одного добровольца. Установлено, что экспериментальные спектры тромбоцитов содержат аналогичный фон, и нет необходимости сравнивать их со спектрами без него (например, с теоретическими спектрами, как в задаче обнаружения вещества). Полученные данные позволяют утверждать, что спектры одного образца однородны, в том числе они воспроизводятся даже после перезагрузки оборудования. В результате была выявлена спектральная однородность тромбоцитов человека, взятых у здорового добровольца. Основываясь на результатах спектральной однородности для здоровых добровольцев, выборки пациентов были проанализированы с применением PCA анализа. Для всех групп, для определения сходства выборок были также рассчитаны дистанции Махаланобиса. Была отмечена значимая вариация выборок для группы 1 и группы 3, т.е. установлены достоверные различия в характеристиках КР/ГКР спектров между здоровыми лицами и пациентами с ССЗ. В тоже время, в случае сравнения групп 1 и 2 (здоровые не принимавшие и принимавшие АСК) не выявлено подобных различий, установлено, что различия массивов спектров по выборкам достаточно малы, поскольку спектры имеют достаточно малую дистанцию Махаланобиса и перекрывающиеся между собой спектральные выборки. Важным результатом является выявления различий при сравнении КР/ГКР спектров, полученных у пациентов групп 3 и 4, также групп 1 vs группа 3 и группа 2 vs группа 4. Таким образом, полученные данные подтверждают применимость КР/ГКР спектроскопии для выявления, с одной стороны, измененной реактивности тромбоцитов у пациентов с ССЗ, с другой стороны, выявления разных вариантов ответа тромбоцитов на примем антитромбоцитарных препаратов. Тот факт, что общий разброс значений спектральной выборки в группе 4 значительно выше, чем в группе 2, вероятно, свидетельствует о более высокой гетерогенности ответа тромбоцитов на антитромбоцитарную терапию именно у пациентов с ССЗ по сравнению со здоровыми лицами. Одной из основных задач исследования являлось выявление частот спектров ГКР тромбоцитов периферической крови у здоровых добровольцев и пациентов, которые были бы связаны с наличием или отсутствием ССЗ и(или) приёмом лекарственных средств. Для анализа были использованы 897 спектров комбинационного рассеяния, размеченные согласно группам. В результате Байесовского поиска были определены следующие различия между популяциями обследованных: здоровые (группа 1+группа2) vs пациенты с ССЗ (группа 3+группа4), группа 1 vs группа 3, группа 2 vs группа 4. В результате Байесовского поиска наиболее часто встречаемые согласно алгоритму Борута оказались частоты 990, 1470, 960, 970, 985, 1000, 1055, 1390, 1395, 1410, 1535, 1540, 965, 980, 1005, 1045, 1050, 1210, 1530, 1600 см. Таким образом, проведение анализа частот спектров ГКР тромбоцитов периферической крови у здоровых добровольцев и пациентов с помощью алгоритмов машинного обучения позволило выделить конкретные частоты ГКР спектров которые отличают здоровых лиц и пациентов с ССЗ. В результате выполнения проекта были разработана методология синтеза многофункциональных биоконъюгированных композитных наноконструкций на основе золотых наночастиц, нагруженных ацетилсалициловой кислотой. Авторы проекта использовали именно ацетилсалициловую кислоту, а не ее метаболиты для того, поскольку именно ацетилсалициловая кислота оказывает действие на ингибируемый рецептор тромбоцита – циоклоксигеназу. В рамках работы данного этапа, были осуществлены: синтез золотых наностержней и нанозвезд и нанесение на них ингибитора циклооксигеназы тромбоцита – аспирина. По результатам синтеза, были исследованы оптические и морфологические свойства полученных наночастиц. Показано, что синтезированные наностержни в кремнеземной оболочке не монодисперсны. Наличие маленьких наночастиц (23,5 процента наночастиц с радиусом 6,232 нм) можно объяснить остаточным наличием зародышевых частиц, которые покрылись кремнеземом, или наличием отдельных кремнеземных наночастиц. Средний гидродинамический радиус полученных наностержней составляет 44,53 ± 11,90 нм. Средний размер синтезированных нанозвезд около 50 нм. Большинство из представленных нанозвезд обладают пятью лучами. По данным фотонной корреляционной спектроскопии средний размер нанозвезд в оболочке (85,3 процента частиц) составляет 33,460 ± 9,842 нм. Это больше, чем до покрытия кремнеземом (24,73 ± 6,47 нм), что говорит об успешном синтезе. Наличие 13,3 процентов наночастиц с радиусом 5,448 можно объяснить наличием отдельных кремнеземных наночастиц. Реализована адсорбция лекарственного средства в поры кремнезема, с которого предварительно удаляли ПАВ. Проведено исследование оптических свойств синтезированных нанокомплексов, включавшее в себя оценку свойств поглощения, рассеяния и размеров методами спектроскопии поглощения, спектрофлуорометрии и фотон-корреляционной спектроскопии. Контроль нанесения лекарственных средств методами сканирующей электронной микроскопии и/или с помощью измерения дзета-потенциала частиц. При сопоставлении КР спектров, выявили смещение максимумов в длинноволновую область для комплекса с меньшей молярной концентрацией АСК (М=10-7 моль/л). максимумы 748 см-1,997 см-1,1202 см-1,1443 см-1, 1604 см-1, 1655 см-1 смещены от 3 см-1 до 10 см-1 относительно спектра комплекса с концентрацией АСК 10-3 моль/л. Были проведены исследования двух комплексов АСК-обогащённая тромбоцитами масса и НК-ацетилсалициловая кислота-богатая тромбоцитами плазма. Исследования проводились методом спектроскопии комбинационного рассеяния света. При сравнении КР спектров тромбоцитарной массы в комплексе с ацетилсалициловой кислотой без наночастиц платины и спектр ГКР света тромбоцитарной массы в комплексе с ацетилсалициловой кислотой с наночастицами платины наблюдается, что практически во всём диапазоне от 890 см-1 до 1700 см-1 интенсивность сигнала рассеянного излучения комплекса «НЧ-тромбоциты-АСК» выше, чем в случае комплекса «тромбоциты-АСК». Данное явление связано с эффектом плазмонного резонанса, который возможен благодаря наночастицам. Максимальное усиление интенсивности рассеяния света было установлено для пика 1144 см-1. Значение коэффициента усиления составило EF=4,5 [3]. Несмотря на то, что спектр плазмонного поглощения платины находится в ультрафиолетовой области, он достаточно широкий спектр плазмонного поглощения, который был использован для реализации эффекта ГКРС/услиенного КР. Изучены спектры усиленного КР света для комплексов «Au NS-АСК-тромбоциты» инкубированных на кварцевом стекле и в пробирках. Детектируемый рассеянный свет от исследуемых комплексов имеет низкую интенсивность в представленных случаях. Максимальная интенсивность наблюдается для пика в области 1655 см-1. Данный максимум принадлежит комплексу «Au NS-АСК-тромбоциты», который был инкубирован в пробирках. В то же время в районе пика 1580 см-1 наблюдается преимущество в интенсивности у комплекса, инкубированного на кварце. По результатам выполнения этапа проекта, были опубликованы статьи 2 статьи, опубликованные WoS/Scopus, одна из них в журнале Q1. Результаты работы были представлены в виде докладов и тезисов на всероссийских и международных мероприятиях. Полученные результаты могут быть использованы для разработки передовых методов оптической диагностики в клинической кардиологии. В частности, очень сложно обнаружить молекулярные изменения в тромбоцитах с помощью традиционного биохимического анализа и оптической микроскопии из-за снижения способности идентифицировать небольшие количества тромбоцитов. Более того, традиционные методы не могут обеспечить быстрый и точный диагностический инструмент для определения, как ингибирования агрегации единичных тромбоцитов, так и конформации их структуры, что важно для эффективности терапии быстрой диагностики, которая определяет дальнейший выбор терапии. Этот факт открывает определенные перспективы как для фундаментальных, так и для прикладных исследовательских целей SERS. Публикации о проекте в средствах массовой информации и в сети интернет: 1) «Нужно предлагать что-то, что в перспективе могло бы спасти мир». https://indicator.ru/physics/nuzhno-predlagat-chto-to-chto-v-perspektive-moglo-by-spasti-mir.htm. 2) «В России создают быстрый метод диагностики болезней сосудов». РИА Новости, МОСКВА, 27 сен — РИА Новости. https://ria.ru/20210927/bfu-1751586164.html. 3) «Ученые создают быстрый метод диагностики болезней сосудов» https://xn--80afdrjqf7b.xn--p1ai/news/8055/

 

Публикации

1. Матвеева К.И., Зюбин А.Ю., Демишкевич Е.А., Рафальский В.В., Моисеева Е.М., Кон И.И., Кундалевич А.А., Бутова В.С., Самусев И.Г. Spectral and time-resolved photoluminescence of human platelets doped with platinum nanoparticles PLOS ONE, номер 9, том 16, стр. e0256621. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256621

2. Матвеева К.И., Зюбин А.Ю., Демишкевич Е.А., Рафальский В.В., Моисеева Е.М., Кон И.И., Кундалевич А.А., Бутова В.С., Самусев И.Г. Application of the spectrofluorimetric research method to study the complexes «Pt NPs -platelets» Proceedings of SPIE, Proc. SPIE 11900, Optics in Health Care and Biomedical Optics XI, 119003I (9 October 2021) (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1117/12.2602524

3. - https://indicator.ru/ «Нужно предлагать что-то, что в перспективе могло бы спасти мир», Онлайн публикация (год публикации - )

4. - В России создают быстрый метод диагностики болезней сосудов РИА Новости, МОСКВА, 27 сен — РИА Новости. (год публикации - )

5. - Ученые создают быстрый метод диагностики болезней сосудов Сайт Минобрнауки РФ, 27 сентября 2021. Новости сайта Минобрнауки РФ (год публикации - )


Возможность практического использования результатов
Высокая реактивность тромбоцитов у пациентов, получающих антитромбоцитарную терапию, является доказанным фактором повышения риска неблагоприятных сердечно-сосудистых событий. Тестирование функции тромбоцитов может быть рекомендовано пациентам, при высоком риске тромбоза стента, при высоком риске развития кровотечении, при подозрении на резистентность к одному из компонентов антиагрегантной терапии, подозрение на наличие проблем с приверженностью к лечению, при подготовке к проведению АКШ и других ситуациях. При этом, оптимальным представляется подход, основанный на тестировании « у кровати пациента», отвечающий задачам, стоящим перед клиницистами, и всем требованиям современной агрегометрии. Из существующих на сегодняшний день методов агрегатометрии нет методов в полной мере отвечающих всем предъявляемым требованиям. Полученные нами ранее результаты могут быть использованы для разработки передовых методов оптической диагностики в клинической кардиологии. В частности, очень сложно обнаружить молекулярные изменения в тромбоцитах с помощью традиционного биохимического анализа и оптической микроскопии из-за снижения способности идентифицировать небольшие количества тромбоцитов. Более того, традиционные методы не могут обеспечить быстрый и точный диагностический инструмент для определения, как ингибирования агрегации единичных тромбоцитов, так и конформации их структуры, что важно для эффективности терапии быстрой диагностики, которая определяет дальнейший выбор терапии. Этот факт открывает определенные перспективы как для фундаментальных, так и для прикладных исследовательских целей SERS. Таким образом, создание промышленных приборов, основанных на методах оценки реактивности тромбоцитов с использованием методов спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния может быть востребовано широким кругом врачей. Использование подобных приборов приведет к снижения риска фатальных осложнений – тромбозов и кровотечений, выявления случаев резистентности и проблем с комплаентностью, что существенно улучшит качество оказываемой медицинской помощи, позволит персонализировать проводимую антитромбоцитарную терапию, снизить затраты на лечение, количество и продолжительность госпитализаций.