Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Разработана новая методика изучения неестественных (антропогенных) событий в эволюции вирусов с использованием дополнительной обработки результатов методов статистической (Байесовой) филогенетики. При помощи анализа расчетной скорости накопления нуклеотидных замен на отдельных ветвях филогенетического дерева, выполнено молекулярное расследование антропогенного внесения в циркуляцию архивного штамма энтеровируса 71 типа в Китае в 2008 году. Более подробно результаты представлены по ссылке: https://www.mdpi.com/1999-4915/11/10/895 . В серии модельных экспериментов изучена чувствительность новой методики для анализа неестественных (антропогенных) эволюционных событий у энтеровирусов. Показано, что нуклеотидные последовательности вирусов с ошибками секвенирования около 0,5% или неправильными датами выделения, сдвинутыми всего на пять лет, могут быть обнаружены различными подходами, но эффективность идентификации зависит от положения последовательности в филогенетическом дереве. Даже одна ошибочная последовательность может глубоко дестабилизировать весь анализ, увеличивая дисперсию предполагаемых эволюционных параметров у всех исследуемых вирусов. Более подробно результаты представлены по ссылке: https://www.mdpi.com/1999-4915/11/11/1032. Проведен углубленный анализ нуклеотидных последовательностей клещевых флебовирусов. На основании дополнительных экспериментов, а также сравнения уровня гетерогенности вирусного и клещевого генома, доказано, что выявленные нуклеотидные последовательности являются вирусными, а не интегрированными в геном, что является важным этапом для проведения последующих исследований. Изучена рекомбинация у гепаднавирусов, заражающих различных хозяев, выявлены важные закономерности, которые в перспективе могут стать одним из критериев вида для гепаднавирусов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году в рамках гранта был выполнен ряд работ, объединенных общей целью изучения фундаментальных основ экологии и эволюции возникающих вирусов в биосфере. В рамках международного консорциума из 15 научных организаций было выполнено изучение биологического разнообразия, генетики и эволюционных закономерностей ротавирусов летучих мышей. Было идентифицировано, по крайней мере, 7 различных группировок генотипов ротавирусов летучих мышей, и получены свидетельства реассортации между ними. Некоторые из этих группировок распространены по всему миру, в то время как другие выделяются в ограниченных географических ареалах. Анализ также выявил свидетельство нескольких случаев передачи ротавирусов летучих мышей другим видам и передачи ротавирусов летучих мышей на большие расстояния. Ротавирус летучей мыши из Коста-Рики обладал тремя ранее не описанными генными сегментами и тесно группировался с человеческим штаммом, что может указывать на недавний межвидовой переход. Также получены новые данные о происхождении прототипного штамма ротавируса SA11. Хотя SA11 является одним из наиболее широко используемых эталонных штаммов для исследований ротавирусов и составляет основу системы обратной генетики, его происхождение оставалось загадочным. Примечательно, что большинство сегментов генома SA11 были тесно связаны с ротавирусами габонских летучих мышей, что указывает на возможное происхождение от летучих мышей. В целом, результаты свидетельствуют о недостаточно изученном генетическом разнообразии ротавирусов у летучих мышей и о высокой экологической мобильности ротавирусов животных. Результаты исследования приняты к публикации в журнале Mbio (Simsek et al.). Для анализа результатов исследования метавирома была отработана методическая база для предсказания хозяина РНК-вируса на основании нуклеотидной последовательности (нуклеотидного, динуклеотидного и тринуклеотидного состава). При сравнении набора алгоритмов машинного обучения наилучший результат классификации показал алгоритм градиентного бустинга, который смог в 89% случаев определить вирусы растений, животных или насекомых. Наиболее информативные маркеры, позволяющие разделять вирусы, не соответствовали широко известным признакам вирусов разных классов хозяев. В 2021 году предполагается продолжить изучение выявленных закономерностей, отличающих вирусы растений, животных или насекомых. В рамках гранта РНФ в 2020 году также была поставлена задача попытки культивирования флебо- и фазивирусов, обнаруженных в клещах в ходе выполнения предыдущего этапа (Klimentov et al., Infection, Genetics and Evolution, 2020, 85, 104524, IF=2.8). На первом этапе для контроля кинетики накопления вирусной РНК были разработаны вирус-специфические real-time PCR тест-системы для представителей семейства Phenuiviridae, детектированных в клещах вирусов Ставрополь, Андропов и Педасельга, и детектированного в комарах вируса Линдаламба. В различных культурах клеток насекомых, клещей и млекопитающих удалось выявить накопление РНК вирусов Ставрополь, Педасельга и Линдаламба. Необходимы дальнейшие исследования для изучения кинетики и закономерностей репликации вирусов. Анализ антропогенных событий в эволюции вируса бешенства показал, что яркие антропогенные события, подобные описанному нами ранее переносу вируса из средней России на Дальний Восток, являются достаточно редким событием. Нам удалось выявить только один настолько же яркий пример, связанный с переездом зараженного в Бразилии человека в США. Были получены указания на дополнительные антропогенные события в распространении вируса в 20 веке, однако в рамках доступного биоинформатического инструментария и плана работы на 2020 год не удалось получить статистически значимых доказательств. Поэтому в 2021 году предполагается продолжить работы по этой задаче с проведением более подробного анализа антропогенного распространения только для отдельных генотипов вируса.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году основными результатами проекта стало изучение естественной рекомбинации у +РНК вирусов, изучение роли вируса Коксаки А2 в этиологии острых вялых параличей и изучение роли антропогенных событий в эволюции вируса бешенства. Рекомбинационные события у норовирусов и саповирусов наиболее часто происходили в области стыка генов полимеразы и капсидного белка VP1, что согласуется с данными из литературы. Также была выявлена рекомбинация внутри неструктурных генов и генов, кодирующих белки капсида, но только между вирусами, принадлежащими к одноименной геногруппе. У саповирусов недавние рекомбинационные события между участками генома, кодирующими неструктурные и структурные белки, часто происходили внутри геногрупп GII и GIII, вирусы которых заражают человека и свиней, соответственно. Также были выявлены рекомбинационные события между вирусами разных геногрупп, заражающих одного хозяина – GII и GIV (человек), GVII и GXI (свинья). Как и для калицивирусов, для астровирусов была характерна частая недавняя рекомбинация между регионами генома, кодирующими неструктурные и структурные белки, причем рекомбинационные события происходили, как правило, либо между вирусами одного и того же вида, либо между вирусами разных видов, заражающих одного и того же хозяина. Недавние рекомбинационные события между вирусами, схожими до 5% в одном участке генома и около 20% в другом, наблюдались как внутри рамок ORF1A, ORF1B, так и внутри ORF2, однако были в целом гораздо менее распространены, чем рекомбинация между неструктурными и структурными регионами генома. Закономерности рекомбинации отличались у вирусов разных родов внутри семейства. В целом, отмечены различия профиля естественной рекомбинации у пикорна-подобных вирусов разных семейств. У норовирусов и астровирусов, в отличие от саповирусов, недавние рекомбинационные события происходили внутри неструктурных участков генома, реже – внутри структурных. Это также отличает астровирусы и калицивирусы от энтеровирусов, у которых рекомбинация внутри структурных генов практически не происходит. Анализ клинических характеристик случаев острого вялого паралича (ОВП) выявил, что по крайней мере три из пяти случаев, связанных с CVA2, были клинически совместимы с полиомиелитом (стойким поражением мотонейронов передних рогов спинного мозга, как правило, вирусного генеза). Это наблюдение является косвенным доказательством роли вируса в этиологии этих случаев. Филогенетический анализ показал, что глобальное распространение генетических вариантов CVA2 в целом было связано с местом выделения, но не с возможностью вызывать ОВП. Следует полагать, что индивидуальные особенности пациента, а не генетические свойства вируса определяют возможность развития ОВП при заражении энтеровирусами. Это предположение дополнительно подтверждается тем, что у двух из трех детей с ОВП, вызванным CVA2, наблюдались сопутствующие заболевания. Анализ антропогенных событий в распространении вируса бешенства был выполнен двумя методами - генно-географические графики и филогеографический анализ методом байесовой филогении. Результаты как для арктической, так и для степной групп были совместимы с неоднократными недавними переносами вирусов на большие расстояния со скоростью более 500 км / год в обеих группах RABV. Таким образом, изучена применимость разных методов для изучения неестественных переносов вируса и показана значительная роль антропогенного распространения для степной и арктик-подобной групп вируса бешенства. Интерактивная карта с помеченными точками сбора вирусов доступна по адресу https://rpubs.com/andreideviatkin/RABVdistribution. Исходный код для среды R для анализа соответствия генетических и географических расстояний (генно-географические графики) доступен по адресу https://github.com/AndreiDeviatkin/gene_geo.