Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках изучения структуры лагены перелётных птиц биофизическими методами мы провели следующие исследования. С целью оптимизации процедуры препарирования и фиксации было испытано два варианта приготовления препаратов: выделение изолированной лагены с прилегающим участком улитки и выделение лагены внутри костного чехла. Под бинокулярным микроскопом вскрывали черепную коробку, удаляли мозг и вырезали костный лабиринт. Часть лаген была выделена вместе с костным футляром, часть – без него. Правые и левые лагены исследовали отдельно. Готовые препараты хранили в пробирках Эппендорфа в холодильнике и перевозили на льду. Для калибровки методики и определения физической природы наблюдавшихся в препаратах лаген сигналов нелинейного магнитного отклика были выполнены аналогичные измерения на суспензиях суперпарамагнитных частиц магнетита размером 5 и 20 нм в толуоле (Sigma Aldrich). Мы проверяли две альтернативные гипотезы: 1) сигналы связаны с нелинейным откликом индивидуальных магнитных наночастиц; 2) сигналы обусловлены коллективными эффектами в ансамбле наночастиц, связанных магнитодипольными взаимодействиями. В последнем случае сигналы с характерной зависимостью от постоянного магнитного поля должны были присутствовать в суспензиях с большой концентрацией наночастиц и исчезать при разбавлении. Было показано следующее: 1) отклик с компонентами второй гармоники того же знака, что получался на препаратах лаген птиц, не зависел от концентрации частиц в суспензии; 2) наблюдался зависящий от концентрации вклад в сигнал, имеющий противоположный знак. Этот сигнал, по всей видимости, обусловлен кластеризацией наночастиц и не имеет отношения к сигналом от препаратов лаген птиц; 3) сигналы «правильного» знака демонстрировали гораздо более плавную зависимость от магнитного поля, чем сигналы от препаратов лаген птиц, причём наклон зависимости возрастал с ростом размера частицы. Эти результаты приводят к следующим выводам: 1) наблюдавшиеся на препаратах лаген птиц характерные сигналы не связаны с коллективными эффетами в каплях ферроколлоидов, как мы предполагали ранее, а обусловлены индивидуальными свойствами магнитных наночастиц, присутствующих в препаратах; 2) резкая зависимость сигнала от постоянного поля свидетельствует о крупных (>20 нм) размерах частиц. Наши калибровочные эксперименты и расчёты приводят к выводу, что наблюдавшиеся на препаратах лаген птиц сигналы нелинейного магнитного отклика обусловлены крупными (на грани перехода к однодоменному состоянию) суперпарамагнитными частицами магнетита. В рамках электрофизиологических исследований ответов сетчатки птиц на магнитные стимулы (направление 2) мы проводили регистрация электроретинограммы (ЭРГ) от изолированных сетчаток мигрирующих воробьиных птиц (зарянок). Ранее были подобраны условия перфузии препаратов во время экспериментов с изменениями магнитного поля (МП). В начале эксперимента на каждом препарате записывались ответы на короткие (10 мс) световые стимулы возрастающей интенсивности, чтобы оценить чувствительность препарата сетчатки и подобрать интенсивность, которая вызывает примерно полунасыщенный ответ. После выяснения амплитуды насыщенного ответа и выбора интенсивности, которая вызывает приблизительно полунасыщающий ответ, мы переходили к тестированию эффекта инклинации МП на амплитуду отдельных компонентов полунасыщенных ответов на синие и красные вспышки. У ответов сетчатки зарянки на красные и синие полунасыщающие вспышки есть типичные для ЭРГ компоненты – положительная a-волна, следующая за ней быстрая отрицательная b-волна (совместно характеризующие функцию различных нейронов сетчатки), и затем медленная глиальная компонента. Мы оценивали влияние инклинации МП на амплитуду a-волны и b-волны по отдельности. Видимых глазом различий в амплитудах a- и b-волн между двумя инклинациями МП, как правило, не было. Однако статистический анализ, проведенный для всех препаратов сетчатки зарянки выявил небольшие статистически значимые различия для синих, но не для красных вспышек в амплитудах обеих волн. Стимуляцией синими вспышками два основных компонента ЭРГ демонстрируют различную реакцию на поворот вектора МП: a-волна увеличивается при переходе от инклинации 90° к 0° (одновыборочный t-критерий Стьюдента t=2,34, p=0,022), в то время как b-волна уменьшается (t=-2,10, p=0,039). Мы провели аналогичный анализ амплитуд a- и b-волн в зависимости от инклинации МП, разбив все препараты на группы по топографическому признаку. Для ответов на синие вспышки у препаратов темпорального и вентрального квадрантов показано статистически значимое отличие отношения амплитуды ответов, записанных при инклинации 0° к амплитуде ответов записанных при инклинации 90° от единицы. Два основных компонента ЭРГ в данных квадрантах сетчатки демонстрируют различную реакцию на поворот вектора МП: в темпоральном квадранте b-волна уменьшается при переходе от инклинации 90° к 0° (одновыборочный t-критерий Стьюдента t=-2,94, p=0,010), в то время как в вентральном квадранте a-волна увеличивается (t=3,64, p=0,002). Для ответов на красные вспышки ни для одного квадранта различий обнаружено не было. Таким образом, изменение внешнего МП может модулировать амплитуду ЭРГ в ответ на синие, но не красные вспышки. Данные результаты согласуются с поведенческими данными по ориентации птиц и нашими данными, полученными в аналогичных электрофизиологических экспериментах на голубях (Rotov et al. in review). Разные топографические части сетчатки зарянки демонстрируют разную реакцию на изменения МП, что наводит на мысль о существовании специфических магниточувствительных областей в глазу птиц данного вида. Чтобы идентифицировать конкретные типы клеток, которые отвечают на изменение МП, требуется более детальный анализ соотношения изменений a- и b-волны. В рамках поведенческих экспериментов по локализации местоположения компасного магниторецептора в организме птицы (направление 3) были проведены следующие исследования. Обнаруженная нами ранее величина порога дезориентации славок в переменных магнитных полях (Pakhomov et al., 2017) позволила поставить эксперименты по локализации местоположения компасного магниторецептора в организме птицы. Ранее нами было спроектировано и разработано устройство, состоящее из минигенератора и миникатушки, с помощью которых можно генерировать и прикладывать слабое переменное магнитное поле амплитудой выше пороговой локально к тем областям, где с наибольшей вероятностью может располагаться магниторецептор (сетчатка глаз, надклювье, внутреннее ухо), не превышая порога чувствительности в остальной части головы птицы. В ходе выполнения Проекта 2016 были выполнены такие эксперименты с локальным приложении МП к верхней части черепа с захватом обоих глаз. Мы обнаружили, что сверхчувствительность магнитного компаса птиц к высокочастотным МП не связана с их непосредственным воздействием на магниторецепцию в сетчатке глаз. В 2019 году были проведены аналогичные эксперименты по изучению ориентации садовых славок с переменным МП, приложенным к задней части черепа с захватом области внутреннего уха (лагены). Для проведение экспериментов по изучению ориентации садовых славок с переменным МП, приложенным к лагене, была рассчитана и изготовлена новая модель микрокатушки, состоящей из двух эксцентрических колец, направления тока в которых были противоположны. При пропускании переменного тока в 0.55 мА от микрогенератора такая микрокатушка должна была создавать поле с амплитудой менее 2.5 нТ на сетчатке глаз и более 5 нТ на всех отделах внутреннего уха. Методика проведения поведенческих экспериментов была такой же, как в 2018 г. Тестирование птиц проводили в первую половину ночи, через 1,5–2,5 часа после захода солнца в помещении с искусственным ночным освещением (0.25 ± 0.05 mW/m²). Используя систему видеонаблюдения, мы отбирали для тестирования только тех птиц, которые в данную ночь проявляли ночную миграционную активность. Чтобы исключить возможность использования птицами других ориентиров, кроме магнитного поля, тестирование проводили под молочно-белым стеклом. Всего в эксперименте использовали 24 садовые славки с микрогенераторами. В течение 19 ночей было проведено 128 тестов. В результате проведения экспериментов удалось выяснить, что птицы с миникатушками, прикрепленными к задней части черепа, привыкают к данному устройству и проявляют спонтанное ночное миграционное беспокойство. Однако в контрольном эксперименте (птицы до прикрепления миникатушек) не было выявлено значимого миграционного направления (критерий Рейли: α = 106°, n = 18, r = 0.10, P = 0.84). Отсутствие значимого направления в контрольном эксперименте не дало возможности оценить результаты последующих тестов, которые были проведены как со включёнными, так и с выключенными минигенераторами. Результаты последующих тестов были следующие: без генераторов в осциллирующем магнитном поле (ОМП): α = 132°, n = 15, r = 0.32, P = 0.22; с минигенератором в положении выключен: α = 76°, n = 8, r = 0.24, P = 0.62; с генератором в положении включен (локальное приложение ОМП к области лагены): α = 318°, n = 11, r = 0.46, P = 0.09.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения проекта нами была разработана теория, позволяющая рассчитать ожидаемую форму сигналов нелинейного высокочастотного магнитного отклика кутикулосом. Кутикулосомы – это железосодержащие органеллы, которые, по литературным данным, находятся в кутикулярных пластинах волосковых клеток внутреннего уха птиц. Кутикулосома представляет собой сферический метакристалл размером 0.5 микрона, образованный молекулами ферритина. Нами получено универсальное выражение для высокочастотного магнитного отклика метакристалла, позволяющее, в частности, рассчитать экспериментально измеряемые зависимости синус- и косинус- компонент второй гармоники от постоянного магнитного поля. Сравнение расчётных зависимостей с экспериментом позволит, в частности, определить магнитный момент отдельной наночастицы из числа образующих метакристалл кутикулосомы, что необходимо для выяснения возможной роли кутикулосом в магниторецепции. Нами также была разработана методика подготовки образцов и схема измерений для исследования фрагментов головы птиц на наличие биогенных магнитных включений. Анализ полученных нами ранее экспериментальных данных позволил установить ряд факторов, влияющих на возможность модуляции амплитуды компонент электроретинограммы (ЭРГ) при изменении инклинации внешнего магнитного поля (МП). Типичная ЭРГ включает два основных компонента – направленную вверх a-волну и следующую за ней быструю, направленную вниз b-волну. Известно, что a-волна формируется ответом фоторецепторов, а b-волна главным образом ответом биполярных клеток. Хотя эти волны обусловлены работой разных клеток, они также имеют взаимное влияние друг на друга, поэтому требуется учитывать не изменения только амплитуды, но и кинетики этих компонентов. Поскольку мы показали, что на изменения МП реагирует только а-волна изменением амплитуды, в то время как амплитуда b-волны и общая кинетика ответа не изменяются, возникают основания полагать, что магниточувствительными клетками сетчатки является некий тип фоторецепторов. Следует отметить, что вопрос об источнике наблюдаемого нами электрического отклика все еще остается открытым, поскольку он может происходить как из самих фоторецепторов, так и от суммации их сигналов биполярными клетками. Эти выводы согласуется с текущими представлениями о локализации потенциальных кандидатов на роль магниторецепторных молекул (криптохромов) в колбочках птиц. Разные топографические части сетчатки зарянки демонстрируют разную реакцию на изменения МП, что наводит на мысль о существовании специфических магниточувствительных областей в глазу птиц данного вида. Однако, проведенный нами с помощью световой микроскопии анализ нескольких препаратов сетчатки зарянки не позволил выявить явных различий в фоторецепторном составе различных квадрантов. В целом, сетчатка зарянки характеризуется преобладанием колбочек, чувствительных к коротковолновому свету (синих и ультрафиолетовых) и меньшей долей зеленых и красных колбочек. Было показано, что изменение направления внешнего МП может модулировать амплитуду ЭРГ в ответ на синие (470 нм), но не красные (630 нм) вспышки. Данные результаты согласуются с поведенческими данными по ориентации птиц и нашими данными, полученными в аналогичных электрофизиологических экспериментах на голубях. Увеличение яркости вспышек приводит к исчезновению эффекта изменения МП, что также согласуется с поведенческими данными других авторов и позволяет выдвинуть гипотезу о наличии конкретного рабочего диапазона интенсивностей коротковолнового света для магниторецепторных структур сетчатки, при выходе за пределы которого они утрачивают функциональность. Наличие реакции на магнитный стимул для ответов на красные вспышки при синем фоне, вероятно, связано с достаточной активацией магниточувствительных молекул фоновой засветкой. Отсутствие наблюдаемого эффекта переменного МП для ответов на синие вспышки при красном фоне является неожиданным результатом, поскольку синие вспышки без фона ранее вызывали магнитосенсорный отклик. Для объяснения этого результата необходимо проанализировать чувствительность разных типов фоторецепторов к прилагаемым стимулам и сопоставить с использованными в экспериментах интенсивностями. Известно, что у птиц спектры зрительных пигментов и масляных капель в колбочках весьма консервативны и мало варьируют среди изученных видов, поэтому для оценки чувствительности мы использовали опубликованные данные по фоторецепторорам другой воробьиной птицы – зебровой амадины. Расчеты показали, что обе использованные нами умеренные фоновые засветки способны насыщать палочки. Ответ на синие вспышки может содержать ответы синих и двойных колбочек, и незначительный вклад от ультрафиолетовых, зеленых и красных колбочек. Красные вспышки способны возбуждать красные и двойные колбочки, а также незначительно – зеленые. Вероятнее всего, магниторецепция обуславливается красными и/или двойными колбочками, поскольку они вносят вклад в ответы как на синие вспышки без фона, так и на красные вспышки с синим фоном. Низкая плотность красночувствительных колбочек в сетчатке зарянки согласуется с малой величиной наблюдаемого эффекта. Отсутствие же модуляции ЭРГ в переменном МП для ответов на синие вспышки при красном фоне, по всей видимости, связано с высокой интенсивностью использованных в этом режиме стимулов – как мы показали ранее, высокие интенсивности синего света подавляют магнитную чувствительность. С другой стороны, умеренная постоянная засветка не приводит к такому эффекту, следовательно, для магниторецепции ключевую роль играет не общее число фотонов, попадающих на сетчатку, а плотность их потока. Поведенческие эксперименты по локализации местоположения компасного магниторецептора в организме птицы, проведённые в 2020 г., как и эксперименты 2019 г., не привели к получению значимого миграционного направления в контрольных условиях. Эта ситуация (отсутствие значимого направления в контрольных условиях) сделала невозможным проведение дальнейших работ по изучению влияния локального приложения осциллирующих магнитных полей к области лагены.