КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-14-00387

НазваниеРазработка биотехнологических подходов получения инновационных препаратов на основе культур клеток высших растений для профилактики и лечения нарушений жирового и углеводного обмена

РуководительНосов Александр Михайлович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2019 г. - 2021 г.  , продлен на 2022 - 2023. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№35 - Конкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словакультура растительных клеток in vitro, суспензионная культура клеток, вторичный метаболизм, тритерпеновые гликозиды, биореакторы, лекарственные растения, социально-значимые заболевания, инновационные лекарственные препараты, нарушения липидного и углеводного обмена, сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания

Код ГРНТИ62.09.37


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Направленность проекта по заявленной тематике входит в научно-технологические российские и мировые приоритеты, о чем свидетельствуют: президентская программа «Здоровье нации», государственная программа «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности» на 2013 2020 годы. Кроме того, необходимость реализации данного проекта продиктована поручением Президента РФ В.В. Путина в своем послании Федеральному собранию об увеличении продолжительности жизни граждан РФ (http://lenta.ru/news/2014/12/04/age74/). Одной из проблем современных медицины и биологии является поиск и создание новых лекарственных средств на основе растительного биоматериала, а также использование растительных объектов в качестве промышленных продуцентов целевых метаболитов. Известно, что на данный момент – до 70% фармацевтических препаратов основаны частично либо полностью на биологически активных веществах (БАВ) растительного происхождения. Однако, в связи с неблагоприятной экологической обстановкой, а также интенсивно возрастающим уровнем потребления возникает дефицит качественного природного лекарственного сырья. Новым решением является использование культивируемых клеток лекарственных растений в качестве возобновляемого экологически чистого альтернативного источника БАВ. Актуальность проекта основана на анализе доступной научной и коммерческой информации, из которого следует, что особое внимание уделяется препаратам для профилактики и лечения нарушений жирового и углеводного обмена, прежде всего - таких социально-значимых заболеваний, как атеросклероз и сахарный диабет. Разработка технологии выращивания культур клеток лекарственных растений с целью получения фармацевтических субстанций, содержащих целевые БАВ, в качестве основы для подобных лекарственных средств, будет способствовать переходу к эффективной персонализированной медицине и технологиям здоровьесбережения, в частности - увеличению продолжительности и качества жизни людей с сердечно-сосудистыми патологиями и сахарным диабетом, в том числе за счет рационального применения новых лекарственных препаратов с поливалентной терапевтической активностью.

Ожидаемые результаты
Ожидаемые научные и научно-технические результаты реализации Проекта: - Промежуточные и заключительный отчёты о проведенных работах, в частности -аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы (статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты – не менее 30 научно-информационных источников) по оценке возможности создания препаратов на основе целевых вторичных метаболитов культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. для профилактики и коррекции нарушений липидного и углеводного обмена человека - Отчет о патентных исследованиях - Заявки на патенты. - Новые линии культур клеток Tribulus terrestris и Panax spp., паспортизированные и депонированные в ВРККК ВР - Протоколы исследовательских испытаний на основании результатов проведенных работ по оптимизации параметров культивирования в колбах и в биореакторах полученных и/или отобранных культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. - Протоколы исследовательских испытаний на основании результатов проведенных работ по анализу качественного и количественного состава вторичных метаболитов (стероидных гликозидов и гинзенозидов), а также по интенсификации биосинтетической активности полученных и/или отобранных культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. - Оптимизированная схема масштабирования глубинного выращивания полученных и/или отобранных культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. до промышленных биореакторов (объемом не менее 0,6м3) без потери продуктивности по клеточной биомассе и целевым вторичным метаболитам. - Полученные биотехнологическим способом экспериментальные образцы биомассы клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. - Оптимизированные методы получения фармацевтических субстанций из наработанной и высушенной клеточной биомассы Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. - Протоколы исследовательских испытаний на основании результатов проведенных работ по изучению химического состава, физико-химических свойств, показателей безопасности и биологической активности получаемых фармацевтических субстанций, выделенных из биомассы культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. - Разработанные опытные образцы препаратов на основе полученной биомассы клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. - Публикации по результатам проведенных работ в рецензируемых научных журналах. - Рекомендации по использованию препаратов для профилактики и коррекции нарушений липидного и углеводного обмена человека на основе клеточной биомассы Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp., полученной биотехнологическим способом. - Опытно-промышленные регламенты и экологически безопасные модели крупномасштабного получения биомассы культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp.для фармацевтической индустрии Результаты проведенных работ могут быть использованы для проведения широкого спектра исследований в области фармацевтики, фитохимии, биотехнологии, включая опытно-конструкторские и опытно-технологические работы, направленные на создание штаммов-продуцентов и инновационных препаратов. Хранящиеся в коллекции и полученные новые линии и штаммы культур клеток растений-продуцентов целевых БАВ могут быть основой промышленного производства биомассы и ценных вторичных метаболитов растительного происхождения для создания высокотехнологичных лекарственных средств, предназначенных для профилактики и коррекции патологий с высокой социальной значимостью (в том числе, ССЗ, сахарного диабета). Успешному завершению работ будут способствовать: - наличие положительных результатов предшествующих фундаментальных исследований возможностей биосинтеза целевых вторичных метаболитов культурами клеток высших растений; - положительный практический и теоретический опыт потенциальных исполнителей в области биотехнологии и физиологии культур клеток высших растений; - обширный мировой опыт успешной реализации подобных работ, который может быть использован при реализации предлагаемого проекта.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В настоящее время в мире особое внимание уделяется препаратам для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями жирового и углеводного обмена. Подобные нарушения повышают вероятность развития диабета и сердечнососудистых заболеваний (гипертензия, ишемическая болезнь сердца, инсульт), и являются наиболее распространенными причинами смертности от неинфекционных заболеваний. Профилактические меры могут снизить клинические проявления и преждевременную смертность у лиц с нарушениями липидного и углеводного обмена. Таким образом, проведение комплекса работ по разработке новых фармацевтических препаратов системного действия для профилактики и коррекции нарушений липидного и углеводного обмена весьма актуально. Для этих целей оптимальным является использование биологически активных веществ (БАВ), растительного происхождения и обладающих полифункциональным действием. Среди подобных препаратов по многочисленным данным из доступных источников, весьма перспективными можно считать стероидные гликозиды диоскореи дельтовидной и якорцев стелющихся (Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris), а также тритерпеновые гликозиды (гинзенозиды) различных видов женьшеня (Panax spp.). Однако эти виды растений относятся к редким, и второй серьезной проблемой является поиск высококачественного возобновляемого источника растительных БАВ. Одним из лучших способов решения этой проблемы можно считать использование культур клеток высших растений (их крупномасштабное выращивание в биореаторах). В тоже время, хорошо известно, что, получаемая подобным образом биомасса, в силу специфики клеток растений in vitro (отсутствие диффренцировки, постоянная пролиферация и др), как правило, существенно отличается от традиционного растительного сырья (ткани, органы интактных растений). Таким образом, важнейшим этапом работ по промышленному использованию культур клеток высших растений является исследование закономерностей их ростовых и биосинтетических характеристик. что и явилось основными задачами первого этапа выполнения проекта При выполнении первого этапа работ были проведены исследования и отбор по ростовым и биосинтетическим характеристикам культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp. Для культуры клеток якорцев стелющихся были оптимизированы условия их культивирования и проведены работы по индукции образования стероидных гликозидов за счет изменения гормонального состава среды. Показано, что замена ауксинов (2,4-Д на α-НУК) влияет не только на увеличение уровня содержания олигофуростанозидов (повышение до 6 раз), но и на их качественный состав. На основании масс-спектрометрический исследований установлено, что на среде с α-НУК клетки якорцев стелющихся содержат как минимум девять олигофуростанозидов, являющихся производными трех разных агликонов: гидрокси-диосгенина, гитогенина/неогитогенина и тигогенина/неотигогенина. Обнаружены и идентифицированы следующие соединения: пентагексозил-гидрокси-диосгенин, пентандрозид F, 25(R)-пентандрозид F, гексозил-25(S)-террестрозин H, гексозил-25(R)-террестрозин H, 25(S)-прототеррестрозин B, 25(R)-прототеррестрозин B, террестринин B, 25(R)-террестринин B. Повышение качественного и количественного содержания стероидных гликозидов сопровождалось изменением морфологии клеток, изменением их агрегированности и постепенным снижением жизнеспособности культуры, вплоть до ее гибели. Одновременное использование двух ауксинов приводило к поддержанию роста и повышению (однако менее значительному – в 2 -3 раза) содержания фуростаноловых гликозидов. В продолжение работ необходимо оптимизировать условия культивирования, при которых высокий уровень содержания в клетках стероидных гликозидов будет сочетаться с активным ростом культуры. Для культуры клеток диоскореи дельтовидной было проведено сравнительное изучение исходного (коллекционного) штамма ДМ-05, в сопоставлении со штаммами ДМ-05-02, ДМ-05-02у, ДМ-05-03, полученных путем повторной обработки исходного штамма ДМ-0,5 мутагеном N-нитрозо-N-метилмочевиной. Было показано, что все штаммы имеют близкие и достаточно высокие параметры роста и характеризуются сходным составом стероидных гликозидов. Клетки всех штаммов содержат как минимум 6 соединений, причем все они являются олигофуростанозидами - производными диосгенина и его 25(S)-стереоизомера – ямогенина. Идентификация соединений с помощью тандемной масс-спектрометрии привела к идентификации дельтозида, 25(S)-дельтозида, протодиосцина, 25(S)-протодиосцина, протодельтофолина и 25(S)-протодельтофолина. Важно отметить, что ацилированные производные протодиосцина – протодельтофолин и его 25(S)-изомер - в культурах клеток обнаружены впервые. Несмотря на одинаковый набор стероидных гликозидов, соотношение этих соединений отличается и является специфичным для каждого из штаммов. Количественный анализ содержания олигофуростанозидов показал трехкратное различие для разных линий (от 2,5% к сухой биомассе линии ДМ-0,5-02 до 8,5% - ДМ-0,5-2у). Наиболее стабильное накопление фуростаноловых гликозидов (в пределах 6 -7 % от сухой массы клеток) было отмечено в биомассе линии ДМ-0,5-03. С помощью ВЭЖХ-МС был проведен первичный скрининг тритерпеновых гликозидов в биомассе суспензионных культур клеток трех видов женьшеня: женьшеня настоящего Panax ginseng (линия L1), женьшеня японского P. japonicus var. repens (линия 062) и женьшеня вьетнамского P. vietnamensis (линия PV70). Установлено, что все изученные культуры клеток женьшеня содержат тритерпеновые гликозиды даммаранового (производные 20(S)-протопанаксатриола, 20(S)-протопанаксадиола и/или окотиллола) и олеананового ряда. При этом гликозиды окотиллола обнаружены только в культуре клеток P. vietnamensis. Наибольшее структурное разнообразие тритерпеновых гликозидов отмечено в биомассе суспензионной культуры клеток женьшеня японского, -в которой обнаружено и идентифицировано более 20 гликозидов, в качестве агликонов которых выступают тритерпеноиды 20(S)-протопанаксатриол, 20(S)-протопанаксадиол и олеаноловая кислота. В связи с этим данная культура клеток была выбрана для дальнейшего изучения. Проведено изучение ростовых и физиологических характеристик культуры клеток женьшеня японского, выращиваемого в течение 12-циклов культивирования на 4-х разных средах, отличающихся по составу фитогормонов. Лучший рост был зафиксирован на среде с α-НУК без цитокининов. Таким образом, поведено разноплановое изучение культур клеток высших растений, обеспечивающие их практическое использование для разработки инновационных препаратов профилактики и лечения нарушений жирового и углеводного обмена. В то же время, полученные результаты имеют и фундаментальную значимость, так как позволяют установить общие закономерности образования вторичных веществ в клетках растений in vitro. В частности, две культуры клеток – якорцы стелющиеся и диоскорея дельтовидная – синтезируют только нетоксичные, фуростаноловые гликозиды, тогда как для интактных растениях характерно присутствие спиростаноловой, токсичной формы гликозидов. Аналогично, для культур клеток двух видов – якорцев и женьшеня – показано сходное действие двух синтетических ауксинов. Присутствие в среде 2,4Д способствует интенсивному росту культур, но невысокому уровню содержания БАВ (причем, относящихся к разным классам соединений – стероидным или тритерпеновым гликозидам). Замена 2,4Д на α-НУК приводит к цитодифференциовке, повышению агрегированности клеток, снижению интенсивности роста – и повышению качественного разнообразия и уровня количественного содержания (в несколько раз) БАВ. Это может свидетельствовать об альтернативном и универсальном влиянии этих синтетических ауксинов на рост культур клеток и их биосинтетический потенциал в отношении образования БАВ, возможно через процессы цитодифференцировки. Полученные результаты являются основой и обоснованием последующего внедрения в фармацевтическую промышленность результатов фундаментальных исследований в части разработки инновационных лекарственных средств для профилактики и лечения патологий, связанных с нарушениями липидного и углеводного обмена (атеросклероза и сахарного диабета), на основе культур клеток высших растений.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Актуальность проекта основана на предварительном анализе доступной научной и коммерческой информации, из которого следует, что в настоящее время в мире особое внимание уделяется препаратам для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями жирового и углеводного обмена. Подобные нарушения повышают вероятность развития диабета и сердечнососудистых заболеваний (гипертензия, ишемическая болезнь сердца (ИБС), инсульт), и являются наиболее распространенными причинами смертности от неинфекционных заболеваний (НИЗ). По данным ВОЗ, сердечнососудистые заболевания (ССЗ) последние 15 лет являются основной причиной инвалидности и преждевременной смертности (в 2016 г - 54% всех летальных случаев в мире; 15.2 миллиона человек от ишемической болезни сердца и инсульта). Не менее значимой проблемой здравоохранения является диабет. Россия, на данный момент, занимает одно из первых мест в Европе по смертности от сахарного диабета и ССЗ (в частности, инфарктов, инсультов и ИБС). Важно, что риск развития ССЗ у мужчин с сахарным диабетом в 2–3 раза, а у женщин – в 3–5 раз выше, чем у лиц без нарушений углеводного обмена. Таким образом, адекватная комплексная терапия не только СД, но и ССЗ, по-видимому, будет способствовать снижению частоты сердечно-сосудистых осложнений и позволит повысить выживаемость данной категории пациентов. Регулирование факторов риска и профилактические меры могут снизить клинические проявления и преждевременную смертность у лиц с установленными нарушениями липидного и углеводного обмена. Многие летальные случаи (43%) наступают преждевременно – в возрасте до 70 лет, и как правило предотвратимы за счет принятия мер по созданию благоприятных условий для здорового образа жизни и более качественных мер по диагностике, профилактике и лечению. С учетом изложенных данных, представляется весьма актуальным проведение комплекса работ по разработке новых фармацевтических препаратов системного действия для профилактики и коррекции нарушений липидного и углеводного обмена. Для этих целей оптимальным является использование биологически активных веществ, присутствующих в клетках растений и обладающих полифункциональным действием. среди которых, по многим данным из доступных источников, наиболее перспективными можно считать стероидные гликозиды диоскореи дельтовидной и якорцев стелющихся (Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris) и тритерпеновые гликозиды (гинзенозиды) различных видов женьшеня (Panax spp.). Согласно плану работ по Проекту, задачами второго года исследования были оптимизация параметров масштабирования аппаратного выращивания культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax japonicus до промышленных биореакторов без потери продуктивности по клеточной биомассе и целевым вторичным метаболитам; наработка образцов биомассы культур клеток-продуцентов в количествах, необходимых и достаточных для проведения дальнейших испытаний на биологическую активность и химического анализа; разработка и оптимизация методов получения фармацевтических субстанций из наработанной и высушенной клеточной биомассы. За время выполнения 2 этапа проекта для каждого штамма были проведены эксперименты по полупроточному аппаратному культивированию. Масштабирование осуществляли по последовательной схеме от лабораторного барботажного аппарата (емкость 20 л, точечный барботер) к пилотному (емкость 75 л, механическое перемешивание, точечный барботер) и к 630 л промышленному биореактору с использованием «отъемно – доливного» (полупроточного) режима выращивания. Наработанные в результате аппаратного выращивания образцы сухой клеточной биомассы были использованы для проведения химического анализа и экспериментов на биологическую активность. По итогам работ были составлены возможные аппаратурная и технологическая схемы организации процесса аппаратного культивирования. Оптимизированы схемы стерилизации и аэрации промышленных биореакторов. Наработанные образцы клеточной биомассы использовали в экспериментах по определению биологической активности и для химического анализа. Было проведено изучение особенностей состава тритерпеновых гликозидов гинзенозидов в биомассе культуры клеток P. japonicus var. repens, выращенной в различных биореакторах. Показано, что при выращивании в 20-л барботажном биореакторе в культуре клеток P. japonicus var. repens сохраняется достаточно сложный состав тритерпеновых гликозидов. Были обнаружены гликозиды в качестве агликонов которых выступают тритерпеноиды 20(S)-протопанаксатриол, 20(S)-протопанаксадиол и олеаноловая кислота. Идентифицированы гинзенозиды группы 20(S)-протопанаксатриола (гинзенозиды Rg1, Rf), 20(S)-протопанаксадиола (гинзенозиды Rb1, Rc, Rb2/Rb3, Rd, малонил-Rb1, малонил-Rb2/Rb3, малонил-Rd) и олеаноловой кислоты (гинзенозид R0, чикусетсусапонин IVа) (т.н. «мажорные» - практически всегда обнаруживаются у видов женьшеня в достаточно высоких концентрациях гинзенозиды). Кроме того, были обнаружены некоторые «минорные» (редко встречающиеся в интактных растениях, как правило, в исчезающее малых количествах (Yang et al., 2014)) гинзенозиды. Например, малонил-Rg1. Показано, что при дальнейшем масштабировании до 630-л биореактора в культуре клеток P. Japonicus var. Repens также сохраняется способность к образованию основных тритерпеновых гликозидов 20(S)-протопанаксатриола (PPT) (гинзенозид Rg1), 20(S)-протопанаксадиола (PPD) (гинзенозиды Rb1, малонил-Rb1, Rc, Rb2) и олеаноловой кислоты (OL) (гинзенозид R0). Основной вклад в общее содержание гликозидов (как и при выращивании в колбах) вносят гинзенозиды Rg1, Rb1, малонилированный гинзенозид Rb1 (малонил-Rb1) и R0. Суммарное содержание гинзенозидов в биомассе культуры клеток P. Japonicus var. Repens (при масштабировании) составляло 2,9-6,5% от сухой массы клеток. Стоит отметить, что это достаточно большие значения для культур клеток женьшеня, вполне сопоставимые с содержанием тритерпеновых гликозидов в интактных растениях (Court, 2000; Christensen, 2009; Yang et al., 2014). В биомассе исследованной культуры клеток также был обнаружен один из т.н. «минорных» (редко встречающимся в интактных растениях, как правило, в исчезающее малых количествах (Yang et al., 2014)) гликозидов – гипенозид XVII. Показано, что для успешного биотехнологического использования выбранной стратегии масштабирования процесса выращивания культуры клеток P. Japonicus var. Repens в биореакторах (имеют другой объем и механизм/режим перемешивания суспензии по сравнению с колбами) необходимо более детальное сравнительное изучение особенностей влияния крупномасштабного выращивания на клеточную агрегированность и распределение гинзенозидов по фракциям культуры, обогащенных агрегатами различного размерного диапазона. В высушенной биомассе клеток из колб и биореакторов был проведен анализ содержания гинзенозидов с помощью ВЭЖХ с УФ детекцией (хроматограф Shimadzu).. Анализ не выявил значительного различия в содержании гинзенозидов между агрегатами разного размерного диапазона. Тем не менее, наблюдалась некоторая тенденция к более высокому содержанию гинзенозидов Rb1, Rc, Rg1 и R0 в более крупных (250-500 мкм) агрегатах. Для гинзенозида Rd наблюдалась обратная тенденция — более мелких агрегаты размером 90-200 мкм содержали большее количество этого гинзенозида (из расчета на г сухой массы), чем более крупные агрегаты, особенно это было выражено на 7-е сутки, во время активного роста культуры. Это согласуется с гипотезой, что гинзенозид Rd является основным интермедиатом синтеза PPD гинзенозидов (Yang et al., 2018; Tang et al., 2019; Zhao et al., 2019; Глаголева и др., 2019; Глаголева, Кочкин, 2019). В целом, анализ состава гинзенозидов в клеточных агрегатах разного размера показал, что агрегаты всех размерных диапазонов (от 56 до >800 мкм) содержат весь спектр гинзенозидов, характерных для данной культуры. С увеличением размеров агрегатов снижалась доля гинзенозидов, характерных для стадии активного роста культуры (Rd, Rh1, ChIVa), а доля гинзенозидов характерных для стадии деградации (ZinR1, desGlcPSRT1) наоборот возрастала. Причиной такого распределения может являться то, что в небольших (90-250 мкм) агрегатах более активно происходит деление клеток и синтез гинзенозидов- предшественников, а в более крупных — происходит рост и дифференциация клеток и соответственно запасание более гликозилированных гинзенозидов. В процессе старения культуры начинается отмирание клеток в больших агрегатах, приводящее к увеличению накопления гинзенозидов, характерных для стадии деградации. Однако для подтверждения этих предположений требуются дополнительные исследования. В заключение стоит отметить, что впервые проведено достаточно подробное изучение качественного и количественного состава гинзенозидов в культуре клеток японского женьшеня, выращенной в биореакторах разного объема. Показано, что в процессе масштабирования выращивания в клетках P. japonicus var. repens in vitro сохраняется способность к образованию достаточно сложной смеси тритерпеновых гликозидов. Кроме того, получены результаты, позволяющие предположить единство клеточных механизмов, лежащих в основе формирования структурного разнообразия гинзенозидов в данной культуре клеток при выращивании в колбах и биореакторах (барботажного типа). Эти результаты могут быть использованы при дальнейшей оптимизации аппаратурного выращивания культуры клеток P. japonicus var. repens. Для структурной идентификации фуростаноловых гликозидов, присутствующих в биомассе культуры клеток T. terrestris, выращенной в биореакторе, был проведен УЭЖХ ЭР МС анализ очищенных экстрактов. В общей сложности в биомассе суспензионной культуры клеток якорцев было выявлено 4 стероидных гликозида фуростанолового типа. В качестве агликонов обнаруженных гликозидов выступают фуростаноловые формы производных следующих стероидов (Zheng et al., 2017; Mulinacci et al., 2003; Томилова и др., 2020): гидрокси-диосгенин (характеристический ион – m/z 431; гликозид 1), гитогенин/неогитогенин (характеристический ион – m/z 433, гликозид 2) и тигогенин/неотигогенин (характеристический ион – m/z 417; гликозиды 3 и 4). Следует отметить, что ранее для данной культуры клеток T. terrestris, выращенной в колбах на среде с 2-НУК и БАП в качестве фитогормонов, было показано образование не менее 9 фуростаноловых гликозидов разной структуры (Томилова и др., 2020). При этом в биомассе культуры клеток было зафиксировано наличие даже таких сложных стероидных олигозидов как террестринин B и его энантиомер. В настоящей работе показано, что при выращивании культуры клеток T. terrestris в барботажном биореакторе отмечается менее разнообразный состав соединений. В настоящее время трудно судить, является ли описанное изменение в составе гликозидов следствием разных условий выращивания (отличия режимов перемешивания в колбах и биореакторе, например). Другая возможная причина – свойственная многим культурам клеток растений тенденция к сокращению структурного разнообразия вторичных метаболитов в процессе длительного пассирования (Ramachandra Rao, Ravishankar, 2002). Для выявления конкретных механизмов данного явления требуются дополнительные исследования. Был также проведен фитохимический анализ суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной при аппаратном культивировании отъемно-доливным способом в барботажных биореакторах с рабочим объемом 20 л, 75 л, 630 л. Для всех вариантов было выявлено незначительное присутствие в клеточной биомассе спиростаноловых гликозидов (диосцина), причем их содержание возрастало на поздних сроках выращивания (стационарная фаза) – до 0,10 % от сухой массы клеток. В процессе выращивания максимальное накопление показано для R-протодиосцина. Из лиофильно высушенной наработанной в биореакторах клеточной биомассы были получены в режиме настаивания водные суспензии, которые были использованы в дальнейших в эспериментах по определению биологичекой активности. В наших предыдущих работах было показано, что фуростаноловые гликозиды (ФГ), выделенные из культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall, обладают различной биологической активностью. Одним из важнейших механизмов адаптогенных реакций организмов является регулирование их редокс статуса. В настоящей работе, исходя из задач по исследованию биологической активности экстрактов из культур клеток высших растений, было проведено исследование влияния фуростаноловых гликозидов, выделенных из биомассы клеток диоскореи дельтовидной, на редокс – состояние модельных объектов – культивируемых клеток люцерны Medicago sativa. Установлено, что обработка ФГ вызвала изменения состояния основных компонентов редокс-системы клеток люцерны in vitro, включая образование супероксид-аниона и активность супероксид-дисмутазы, работу НАДФ Н-оксидазы, образование перекиси водорода и авктивность различных форм пероксидаз, Кроме того, ФГ повлияли на активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, глутатионредуктазы и активность НАД∙Н/НАД-зависимых альдегидутилизирующих ферментов. Полученные результаты могут служить системой сопоставления при выясниии действия фуростоаноловых гликозидов на редокс системы животных клеток. Работы по определению острой пероральной токсичности, а также по оценке антигипоксического действия биомассы культур клеток женьшеня, диоскореи дельтовидной и якорцев стелющихся проводились на базе и по методикам ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Минздрава России. В результате проведенных работ признаков токсического влияния исследуемых культур клеток на организм животных, сопровождавшихся изменением показателей относительной и абсолютной массы внутренних органов, выявлено не было. При определении острой токсичности по методике ОЭСР Тест № 423 «Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности» применяемые дозы препаратов не вызывали летального исхода при применении у экспериментальных животных, что позволяет отнести исследуемые культуры клеток к классу токсичности «5 класс токсичности или не классифицируется». Cпециалистами ВО СПХФУ c помощью программы PASS был спрогнозирован спектр биологической активности индивидуальных соединений, которые были обнаружены в культурах клеток (12 гинзенозидов и 7 фуростаноловых глкозидов). Механизмы действия, связанные с антигипоксическим эффектом, были предсказаны для большинства соединений. С использованием программного обеспечения Pharma Expert были установлены возможные синергетические или аддитивные эффекты комбинаций анализируемых соединений, в соответствии с их наличием в препаратах. Специалистами ВО СПХФУ предсказанные антигипоксические эффекты экстрактов были экспериментально проверены на животных. Было показано, что действие экстрактов из клеток превышало активность препарата сравнения. В целом, все экспериментальные препараты продемонстрировали умеренную активность, наиболее эффективными оказались диоскорея дельтовидная и якорцы стелющиеся. Проведенные экспериментальные исследования на животных моделях полностью подтвердили предсказанную in silico антигипоксическую активность экстрактов из культур клеток. Полученные результаты при дальнейших работах по выполнению Проекта будут использованы при оценке специфической активности фармакологических агентов на основе разрабатываемых фитопрепаратов. Результаты проведенных работ должны быть использованы в рамках исполнения Соглашения с Российским научным фондом № 19-14-00387 от 29.04.2019 года по теме: «Разработка биотехнологических подходов получения инновационных препаратов на основе культур клеток высших растений для профилактики и лечения нарушений жирового и углеводного обмена». По результатам работ 2020 года опубликованы 2 статьи и еще одна статья принята на рецензирование журналом «Физиология растений».

 

Публикации

1. Волкова Л.А., Урманцева В.В., Бургутин А.Б., Носов А.М. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ФУРОСТАНОЛОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК DIOSCOREA DELTOIDEA НА РЕДОКС СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК ЛЮЦЕРНЫ IN VITRO Физиология растений, - (год публикации - 2021)

2. Лагунин А., Повыдыш М., Ивкин Д., Лужанин В., Краснова М., Оковитый С., Носов А., Титова М., Томилова С., Филимонов Д., Поройков В. Antihypoxic action of Panax Japonicus, Tribulus Terrestris and Dioscorea Deltoidea cell cultures in silico and animal studies Molecular informatics, том 39, № 11, с. 1-12 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1002/minf.202000093

3. С. В. Томилова, М. Т. Ханды, Д. В. Кочкин, Б. А. Галишев, А. Г. Клюшин, А. М. Носов ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ АУКСИНОВ – 2,4-Д и α-НУК – НА РОСТОВЫЕ И БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК Tribulus terrestris L. ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, том 67, № 4, с. 389–399 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.31857/S001533032004017X


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На третий 2021 год выполнения работ по Проекту в соответствии с планом была проведена наработка биомассы культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp, осуществлено получение фармацевтических субстанций из наработанной биомассы; выполнено изучение химического состава и физико-химических свойств полученных фармацевтических субстанций; проведено исследование биологической активности полученных фармацевтических субстанций. Разработаны рекомендации по использованию получаемых фармацевтических субстанций из клеточной биомассы Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp., полученной биотехнологическим способом, для профилактики и коррекции нарушений липидного и углеводного обмена человека, а также составлены Проекты опытно-промышленных регламентов. С целью наработки образцов биомассы для изготовления фармацевтический субстанций и дальнейшего проведения испытаний на биологическую активность штаммы T.terrestris, P.japonicus и D.deltoidea выращивали в лабораторных и промышленных барботажных биореакторах в отъемно-доливном режиме по отработанной на втором этапе работ технологии. Для всех культур клеток накопление сухой массы клеток находилось в пределах 8-14 г\л по сухой массе клеток и уровень жизнеспособности клеток не опускался ниже 83%. В результате для проведения исследований по биологической активности было наработано по 5 кг лиофильно высушенной биомассы of P. japonicus, D. deltoidea и 1 кг - T. terrestris, Проведенный химический анализ образцов фармацевтических субстанций из клеточной биомассы подтвердил, что в полученной промышленным способом биомассе культуры клеток D. deltoidea основными компонентами являлись стероидные гликозиды фуростанолового ряда (ФГ) 25(S)-дельтозид (25(S)-протодельтонин); дельтозид (протодельтонин); 25 (S) -протодиосцин (протонеодиосцин); протодиосцин. Общее содержание 4.62 ± 0.53 % от сухой массы клеток. В аналогичных образцах Panax japonicus подтверждено присутствие тритерпеновых гликозидов с 20(S)-протопанаксадиолом (гинзенозиды Rb1, malonyl-Rb1, Rb2/Rb3, malonyl-Rb2/Rb3, Rd, malonyl-Rd). 20(S)-протопанаксатриолом (гинзенозиды Rg1, malonyl-Rg1, Rf) и олеаноловой кислотой (гинзенозид R0 и чикусетсусапонин IVa) в качестве агликонов. Содержание основных групп гинзенозидов в сухой биомассе было следующим по данным HPLC-UV анализа: гликозиды PPT (сумма Rg1, Re, Rf) – 13,5 мг/г; гликозиды PPD (сумма Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd) – 6,5 мг/г; производные олеаноловой кислоты (R0) – 9,6 мг/г; малонил-Rb1 – 12,4 мг/г Общее содержание гинзенозидов 3.46 ± 0.68 % от сухой массы клеток. В биомассе Tribulus terrestris показано присутствие фуростаноловых гликозидов: пентагексозил-гидрокси-диосгенин (фуростанол тип); пентандрозид F; 25(R) -пентандрозид F; гексозил-25(S) -террестрозин H; гексозил-25(R) -террестрозин H; 25(S) -протеррестрозин B; 25(R) -протеррестрозин B; террестринин B; 25(R) -террестринин B . Общее содержание 0.10 ± 0.03 % от сухой массы клеток. Кроме того, показано присутствие изомера кофеоилхинной кислоты и хинной кислоты Указанные выявленные соединения в образцах клеточной биомассы можно рассматривать как основные фитокомпоненты потенциальных растительных препаратов. На основании результатов экспериментов по аппаратурному выращиванию и данных по расширенному химическому анализу были составлены проекты опытно-промышленных регламентов получения биомассы культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax japonicus глубинным способом в биореакторах . На основании результатов экспериментов по аппаратурному выращиванию и данных по расширенному химическому анализу были составлены проекты опытно-промышленных регламентов получения биомассы культур клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax japonicus глубинным способом в биореакторах. В 2021 году было продолжено изучение механизмов адаптогенного действия фуростаноловых гликозидов (ФГ), выделенных из биомассы культуры клеток диоскореи дельтовидной Dioscorea deltoidea на клетки растений in vitro. Было сопоставлено протекторное действие ФГ при воздействии на суспензионную культуру клеток люцерны (Medicago sativa L.) двух видов стресса - гиперосмотического и низкотепературного (гипотермии). Показано, что популяция клеток люцерны in vitro обладает разной чувствительностью к действию исслдеованных абиотических стрессоров, что выражалось в разном уровне жизнеспособности клеток: высокой (85%) в условиях гипотермии и низкой (25%) при гиперосмотическом воздействии. Гипотермия стимулировала скорость генерации супероксид-аниона (О2•¯), ей сопутствовала высокая конститутивная активность антиоксидантных ферментов (гваякол-зависимой пероксидазы, аскорбатпероксидазы и глутатионпероксидазы), уровень которых отражает компенсаторный потенциал клеток. Экзогенная обработка ФГ при этом виде стрессового воздействия способствовала повышению активности антиоксидантных ферментов, однако не оказывала заметного влияния на изначально высокий уровень жизнеспособности клеток. В условиях гиперосмотического стресса предварительное воздействие ФГ приводило к 3-кратному увеличению выживаемости клеток (с 25 до 73%) и повышению на 30% активности растворимой пероксидазы по сравнению с ее уровнем при влиянии только стрессора. Воздействие ФГ также вызывало повышение активности антиоксидантных ферментов, снижение уровня перекисного окисления липидов и повышение активности ферментов малатдегидрогеназного (МДГ) комплекса. Однако, в отличие от гипотермии, наблюдаемые изменения вызывали существенное повышение жизнеспособности клеток люцерны in vitro. На увеличение образования осмолитов в реакциях НАД/НАД·Н-МДГ указывало повышенная в сравнении с контролем концентрация осмотика (маннита), вызывающего начальную степень плазмолиза клеток. Полученные результаты подтверждают наличие разнопланового стресс-протекторного действия фуростаноловых гликозидов, механизмы которого могут модифицироваться в зависимости от природы стрессовых факторов. С целью исследования биологической активности получаемых фармацевтических субстанций были выбраны доклинические модели сахарного диабета второго типа: адреналиновая гипергликемия для определения наличия гипогликемических свойств и модель, сочетающая использование диабетогенного агента стрептозотоцина и высокожировой диеты. Проведены исследования гипогликемических свойств фитопрепаратов на основе женьшеня, диоскореи и якорцев. Показана эффективность применения фитопрепаратов на основе диоскореи и якорцев при СД 2 у крыс, основанная на снижающихся показателях уровня глюкозы крови, мочи, суточного диуреза и ОХС сыворотки крови. Снижение показателей углеводного и липидного обмена сопоставимы с действием препарата сравнения (метформина). Однако способность снижать массу тела у фитопрепаратов не выявлена. Водные экстракты культур клеток диоскореи, якорцев и женьшеня показали гипохолестеринемическую активность у животных с ожирением. По влиянию на уровень общего холестерина в сыворотке крови возможно распределение фармакологических агентов в следующей последовательности: ВЭ женьшеня>ВЭ диоскореи>ВЭ якорцев/лираглутид>интактная группа>контрольная группа. Значимым показателем в контексте такого заболевания, как ожирение, является уровень глюкозы в сыворотке крови. По выраженности гипогликемического эффекта препараты можно распределить следующим образом: ВЭ якорцев > ВЭ диоскореи > ВЭ женьшеня > лираглутид > интактная группа > контрольная группа. Кроме того, препараты оказали влияние на суточный диурез животных. Его выраженность можно отразить таким образом: ВЭ женьшеня > ВЭ якорцев > ВЭ диоскореи > лираглутид> интактная группа > контрольная группа. При этом фитопрепарат женьшеня значительно превышал фоновый уровень суточного диуреза. Сравнительная оценка эффективности фитоэкстрактов на основе культур клеток диоскореи, якорцев и женьшеня по отношению к референсному препарату лираглутиду показала следующее. Несмотря на то, что масса животных в группах статистически значимо не изменялась, наблюдалось снижение массовой доли жира в организме животных некоторых групп. По влиянию на данный показатель препараты можно распределить следующим образом: ВЭ диоскореи > лираглутид > интактная группа > ВЭ якорцев > ВЭ женьшеня > контрольная группа. По итогам проведенной работы наиболее эффективным фитопрепаратом, обладающим гипохолестеринемическим и гипогликемическим действиями, оказывающим значимо большее влияние на массовую долю жировой ткани, чем референсный препарат лираглутид, показал себя водный экстракт культур клеток Dioscorea deltoidea. На основании результатов проведенных работ составлены предварительные рекомендации по изготовлению и использованию фармацевтических субстанций в виде водных суспензий из клеточной биомассы Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp., полученной биотехнологическим способом, для профилактики и коррекции нарушений липидного и углеводного обмена человека. На основе полученных результатов будет продолжена разработка современных биотехнологий получения биологически-активных веществ растительного происхождения из культур клеток высших растений. Создаваемые технологии призваны обеспечить сырьем реальные сектора экономики – производство фармацевтических препаратов, функциональных продуктов питания и нутрицевтиков. Полученные результаты рекомендуются к использованию в образовательном процессе на биологических факультетах университетов и могут применяться в лекционных курсах «Физиология растений» (общий курс), «Вторичный метаболизм высших растений» (спецкурс), «Культура клеток высших растений с основами биотехнологии» (спецкурс), а также для проведения практических занятий.

 

Публикации

1. А. Г. Клюшин, С. В. Томилова, Д. В. Кочкин, Б. А. Галишев, А. М. Носов ВЛИЯНИЕ АУКСИНОВ И ЦИТОКИНИНОВ НА РОСТОВЫЕ И БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК Tribulus terrestris L. Физиология растений (Russian Journal of Plant Physiology), 2022, том 69, № 2, с. 1–9 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.31857/S0015330322020075

2. Л. А. Волкова, В. В. Урманцева, А. Б. Бургутин, А. М. Носов CТРЕСС-ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФУРОСТАНОЛОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ КЛЕТКИ ЛЮЦЕРНЫ В УСЛОВИЯХ ГИПОТЕРМИИ И ГИПЕРОСМОТИЧЕСКОГО СТРЕССА Физиология растений (Russian Journal of Plant Physiology), - (год публикации - 2022)

3. Повыдыш М.Н., Титова М.В., Иванов И.М., Клюшин А.Г., Кочкин, Д.В., Галишев Б.А., Попова Е.В., Ивкин Д.Ю., Лужанин В.Г., Краснова М.В., Демакова Н.В., Носов А.М. Effect of Phytopreparations Based on Bioreactor-Grown Cell Biomass of Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris and Panax japonicus on Carbohydrate and Lipid Metabolism in Type 2 Diabetes Mellitus Nutrients, том 13, № 11, 3811 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/nu13113811

4. Титова М.В., Попова Е.В., Константинова С.В., Кочкин Д.В., Иванов И.М., Клюшин А.Г., Титова Э.Г., Небера E.A., Василевская Э.Р., Толмачева, Г.С., Котенкова Е.А., Носов А.М., Пэк К.-Й. Suspension Cell Culture of Dioscorea deltoidea—A Renewable Source of Biomass and Furostanol Glycosides for Food and Pharmaceutical Industry Agronomy, том 11, № 2, 394 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/agronomy11020394


Возможность практического использования результатов
Исследованные культуры клеток перспективны для создания современных биотехнологий, использованные методы их исследования полностью соответствует современному научно-техническому уровню. На основе полученных результатов будет продолжена разработка методов получения биологически-активных веществ растительного происхождения из культур клеток высших растений. Создаваемые технологии призваны обеспечить сырьем реальные сектора экономики – производство фармацевтических препаратов, функциональных продуктов питания и нутрицевтиков. Полученные при выполнении проекта данные послужат обоснованием для последующего внедрения в фармацевтическую промышленность результатов фундаментальных исследований в части разработки инновационных лекарственных средств для профилактики и лечения патологий, связанных с нарушениями липидного и углеводного обмена (атеросклероза и сахарного диабета), на основе культур клеток диоскореи дельтовидной, якорцев стелющихся и женьшеня японского (Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax japonicus). Полученные результаты рекомендуются к использованию в образовательном процессе на биологических факультетах университетов и могут применяться в лекционных курсах «Физиология растений» (общий курс), «Вторичный метаболизм высших растений» (спецкурс), «Культура клеток высших растений с основами биотехнологии» (спецкурс), а также для проведения практических занятий.