КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-14-00341

НазваниеНовые мышиные и клеточные модели с геномными модификациями компонентов врожденного иммунитета, в том числе иммунологических чекпойнтов, для изучения роли миелоидных клеток в индивидуальном ответе на иммунотерапию

РуководительКупраш Дмитрий Владимирович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-210 - Молекулярная генетика

Ключевые словаврожденный иммунитет, костимуляция, иммунотерапия рака, цитокины, воспаление

Код ГРНТИ34.15.33


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Взрывной интерес к иммунотерапии рака оправдан впечатляющими успехами в этой области, однако многие аспекты биологи молекул, являющихся перспективными мишенями иммунотерапии, остаются недостаточно изученными. К таким молекулам относится TIM-3 (T cell immunoglobulin and mucin domain-3) - член суперсемейства иммуноглобулинов, который экспрессируется на полностью дифференцированных Т-лимфоцитах, а также на клетках миелоидного ряда дифференцировки и клетках некоторых опухолей. TIM-3 необходим для предотвращения аутоиммунных реакций в норме, и часто экспрессируется на CD4 T-хелперах и на CD8 Т-киллерах, инфильтрирующих злокачественные опухоли. На этих клетках TIM-3 часто обнаруживается совместно с PD-1, на настоящий момент наиболее успешной мишенью иммунотерапии рака. Таким образом, TIM-3, как и PD-1, относится к так называемым "иммунологическим чекпойнтам", а совместная блокировка TIM-3 и PD-1 представляется весьма привлекательной стратегией лечения рака, которая сейчас активно исследуется. Однако, помимо Т-лимфоцитов, TIM-3 также экспрессируется на клетках миелоидного происхождения - моноцитах, макрофагах и дендритных клетках, и его биологическая роль в этом отделе иммунной системы изучена недостаточно. Более того, согласно последним данным, встречающиеся в человеческой популяции мутантные формы TIM-3 приводят к развитию хронического воспаления, которое несет собственные онкогенные риски и указывает на возможные побочные последствия анти-TIM-3 терапии, связанные именно с миелоидными клетками. Для изучения этого аспекта биологии TIM-3 мы планируем сконструировать так называемую "флоксированную" линию мышей для кондиционной инактивации гена Havcr2 (hepatitis A virus cellular receptor 2), кодирующего TIM-3, при помощи технологии LoxP/Cre. Сайты рекомбинации LoxP будут вводиться в геном мыши при помощи системы редактирования CRISPR/Cas9, а инактивация гена Havcr2 в миелоидных клетках будет обеспечиваться скрещиванием с трансгенными мышами, экспрессирующими рекомбиназу Cre под контролем конститутивно активного в миелоидных клетках промотора гена макрофагального лизоцима (MLys1), или c использованием тамоксифен-индуцируемого промотора гена хемокинового рецептора CX3CR1. Мыши с кондиционным нокаутом гена Havcr2 в миелоидных клетках, как и вообще "флоксированный" аллель Havcr2, будут получены впервые, и позволят изучить ранее не исследованные свойства TIM-3 на миелоидных клетках. В частности, будут охарактеризованы фенотипические проявления этих мышей в нескольких из предложенных релевантных экспериментальных моделей системного воспаления: индуцированная липополисахаридом (ЛПС) и D-Галактозамином острая гепатотоксичность, прямая модель ЛПС-токсичности, индуцированный конканавалином А гепатит, модель внутрибрюшинного заражения мышей с помощью Listeria monocytogenes, экспериментальный полимикробный сепсис, а также экспериментальный колит, индуцированный декстрансульфатом натрия. Также на этих мышах будет изучена динамика развития перевиваемой меланомы B16-F10. Параллельно с получением, скрещиванием и разведением мышей с инактивацией гена Havcr2 в миелоидных клетках, будет проводиться работа по функциональному анализу индивидуальных аллелей генов человека на клеточных моделях, с акцентом на медиаторы миелоидных клеток, участвующих в воспалительных реакциях, к которым помимо TIM-3 также относятся рецепторы врожденного иммунитета, костимуляторные молекулы и провоспалительные цитокины. Наш опыт изучения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями, показывает, что современного уровня знаний в области функциональной генетики человека в большинстве случаев недостаточно для однозначного предсказания эффектов генетических вариаций in silico, но достаточно для составления коротких списков кандидатных вариантов, которые затем могут быть экспериментально исследованы в клеточных культурах релевантного происхождения.

Ожидаемые результаты
Будет создана новая уникальная линия мышей с флоксированным аллелем гена Havcr2, на основе которой будут получены линии мышей с тканеспецифической делецией TIM-3 в миелоидных клетках. Будет установлена роль TIM-3, экспрессирующегося на миелоидных клетках, в патогенезе острого и хронического системного воспаления, а также в росте перевиваемых раковых клеток у мышей. Планируется изучение регуляторных последовательностей генов, активных в миелоидных клетках (в первую очередь Havcr2) и регулирующих развитие таких патологий. Модель и полученные на ней результаты будут приоритетными на мировом уровне. Полученные результаты будут полезны для планирования испытаний перспективных иммунотерапевтических препаратов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетном году была проведена оптимизация системы, необходимой для создания уникальной линии мышей с “флоксированным” геном Havcr2, кодирующим иммунологический чекпойнт TIM-3, на основе которой в будущем планируется получение мышей с тканеспецифической делецией TIM-3 в миелоидных клетках. В качестве наиболее подходящего инструмента для выполнения данной задачи была выбрана система программируемой геномной нуклеазы CRISPR/Cas9, которая позволяет вносить разрезы в выбранные места генома с последующей интеграцией в них сайтов loxP путем гомологичной репарации с использованием ДНК-доноров. Подобраны и успешно протестированы направляющие РНК, фланкирующие экзон 4 и не затрагивающие сайты сплайсинга. Также получены одноцепочечные донорные ДНК, содержащие последовательности loxP сайтов и "плечи" гомологии с участками, фланкирующими места посадки направляющих РНК. Таким образом, полностью подготовлена система для “флоксирования” экзона 4 гена Havcr2. Донорные ДНК и плазмиды pX330, содержащие ген Cas9 и последовательности для экспрессии направляющих РНК, были инъецированы преимущественно в мужские пронуклеусы 3108 оплодотворенных яйцеклеток мышей. После микроинъекции и краткосрочного культивирования осталось 714 клеток, пригодных для трансплантации (из них 482 на стадии двух бластомеров), их пересадили 48 псевдобеременным самкам-реципиентам, из которых у 3 реципиентов родилось 7 мышат. Из геномной ДНК полученного потомства, плацент, абортированного материала и излишка инъецированных бластоцист амплифицировали области вокруг предполагаемых loxP вставок. Полученный ПЦР продукт секвенировали, анализ сиквенса проводили с помощью алгоритма множественного выравнивания последовательностей (MAFFT). В геноме одного выжившего мышонка были обнаружены мутации в области разреза Cas9. Для более точного определения изменений в геноме будет проведен анализ потомства F1. Для повышения вероятности получения мышей с "флоксированным" аллелем Havcr2, мы подготовили альтернативный дизайн внесения loxP сайтов, фланкирующих экзон 4, в один этап, который предполагает использование одной направляющей РНК и донорной плазмиды, позволяющей вносить сразу оба loxP сайта. Была произведена сборка всех необходимых плазмид, система подготовлена к тестированию в бластоцистах. С помощью биоинформатического анализа мы определили промотор и возможный энхансер гена HAVCR2. Было показано, что разные варианты полиморфизмов rs10515746 и rs4704853, ассоциированных с ревматоидным артритом и раком груди, не оказывают значимого влияния на активность данного промотора в модели активированных моноцитов человека. Однако минорные варианты сцепленных с ними полиморфизмов rs560127761 (G) и rs189392665 (Т) значимо повышают активность промотора HAVCR2 в используемой модельной системе (клетки линии U937 миелоидного происхождения). Помимо этого, была показана дифференциальная экспрессия генов-мишеней TLR4 при нокдауне его основного транскрипционного регулятора SPI1, а также предложена гипотеза о SPI1-зависимой модуляции энхансерных свойств 3’-нетранслируемой области TLR4.

 

Публикации

1. Корнеев К.В., Свиряева Е.Н., Митькин Н.А., Горбачева А.М., Уварова А.Н., Устюгова А.С., Поляновский О.Л., Кулаковский И.В., Афанасьева М.А., Шварц А.М., Купраш Д.В. Minor C allele of the SNP rs7873784 associated with rheumatoid arthritis and type-2 diabetes mellitus binds PU.1 and enhances TLR4 expression Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease, 165626 (год публикации - 2019).

2. Корнеев К.В., Свиряева Е.Н., Митькин Н.А., Поляновский О.Л., Шварц А.М., Купраш Д.В. Effects of genetic variations in the downstream regulatory region of human TLR4 gene on transcription in monocytes and B cells FEBS OPEN BIO, 9, 100-100 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
За отчетный период мы продолжили исследование альтернативных подходов к получению мышей с флоксированным геном Havcr2. Мы показали работоспособность ранее подобранной направляющей РНК sg6, комплементарной области внутри экзона 4 гена Havcr2. После микроинъекции линеаризованного донора и направляющей РНК в составе вектора pX330 выжило 806 клеток, их трансплантировали 65 псевдобеременным самкам-реципиентам. В итоге родилось 29 мышат, некоторые из которых имели мутации в месте предполагаемого разреза белком Cas9. Кроме того, была получена уникальная нокаутная мышь, в которой произошла делеция почти всего 4 экзона гена Havcr2, а также удалена часть 3 интрона, содержащая бранч-сайт и акцепторный сайт сплайсинга. Мы показали, что полученные первичные клетки миелоидного ряда (макрофаги и дендритные клетки костномозгового происхождения) обладают достоверно детектируемым уровнем экспрессии белка TIM3, который может быть снижен посредством трансфекции клеток анти-Havcr2 siRNA. Подобный подход позволил получить панель первичных миелоидных клеток мыши разных субпопуляций с дифференциальной экспрессией гена Havcr2, а также оценить экспрессию генов основных про- и противовоспалительных цитокинов после специфической активации полученных клеток. В рамках изучения генов, отвечающих за взаимодействие между клетками в опухолевом микроокружении, мы описали энхансер, находящийся в третьем интроне человеческого гена HAVCR2, а также выявили однонуклеотидный полиморфизм rs13360222 этого энхансера, минорный вариант которого вероятно влияет на активность промотора гена HAVCR2 в модели моноцитарных клеток. Также мы описали влияние минорного варианта однонуклеотидного полиморфизма rs2295613 промотора человеческого гена SLAMF1 на его активность. Введение минорного варианта данного полиморфизма приводит к повышению активности промотора SLAMF1 в клетках В-лимфобластоидной линии Raji. Мы осуществили сборку люциферазной репортерной конструкции, содержащей промотор гена хемокина CCL2, участвующего в регуляции противоопухолевого иммунного ответа и модификации опухолевого микроокружения, а также провели делеционный скрининг CCL2 промотора в культурах клеток рака человека и выявили участок промотора гена CCL2, отвечающий за регуляцию промотора противовоспалительными стимулами, продуцируемыми опухоль-ассоциированными макрофагами. Кроме того, мы провели биоинформатический поиск полиморфизмов некодирующих областей генов, ассоциированных с тяжелым течением инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV2.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Исследован новый подход к получению флоксированного аллеля гена Havcr2 с использованием направляющих РНК, комплементарных областям гена Havcr2 внутри интронов 3 и 4, соответственно, и длинного одноцепочечного донора (1350 нуклеотидов). 597 выживших бластоцист трансплантировали псевдобеременным самкам-реципиентам, у которых родилось 39 мышат. По результатам ПЦР-скрининга было отобрано четыре первичных трансгена из которых две самки дожили до этапа размножения, однако у их потомства в геноме не было обнаружено целевых интеграций. Самка с делецией почти всего 4 экзона и части 3 интрона гена Havcr2 также не принесла жизнеспособного потомства, что указывает на важность TIM-3 для обеспечения иммунологической толерантности при беременности. Высокоэффективный нокдаун TIM-3 в человеческих моноцитах и мышиных макрофагах позволил охарактеризовать его роль в регуляции воспалительного ответа миелоидными клетками при воздействии различными активационными стимулами. Оказалось, что дефицит TIM-3 в моноцитах человека приводит к снижению продукции IL-10 при активации с помощью TNF, но усиливает экспрессию IL-6 при ЛПС-активации. Нокдаун гена Havcr2 в макрофагах мыши вызывает повышенную экспрессию генов Il6 и Il10 при ЛПС-активации, стимуляция локсорибином (лиганд рецептора TLR7) приводит к усилению экспрессии только Tnf, в то время как активация с использованием CpG (лиганд TLR9) вызывает достоверное увеличение экспрессии Tnf, Il6 и Il10. Охарактеризованы промотор и энхансер гена HAVCR2 человека, показано, что наиболее активная область промотора располагается в пределах 200 п.н. до старт-кодона этого гена. В третьем интроне гена HAVCR2 обнаружен энхансер, способный существенно повышать активность промотора этого гена. В данном энхансере был функционально охарактеризован полиморфизм rs13360222, минорный вариант которого (Т) достоверно снижает энхансерную активность в модели активированных моноцитов. Это наблюдение может дополнить существующую схему молекулярных механизмов патогенеза аутоиммунных патологий. В результате оценки активности промотора гена CCL2 в клеточной модели рака молочной железы человека выявлено, что ключевую роль в регуляции экспрессии CCL2 в ответ на противовоспалительные стимулы играют транскрипционные факторы EGR1 и RXRA, формирующие недостающее звено в TIM3 - TGFβ - (EGR1/RXRA) - CCL2 регуляторной петле (https://www.indicator.ru/medicine/uchenye-nashli-gennyi-predokhranitel-dlya-metastazov-raka-grudi-18-09-2021.htm). Показано, что более редкий аллель полиморфизма rs2295613 (A) промотора гена SLAMF1, ассоциированный с риском развития системной красной волчанки, повышает активность данного промотора в В-клетках человека за счёт образования эффективного сайта связывание фактора c-Myc. При изучении Т-лимфоцитов человека, несущих разные генетические варианты полиморфизма rs12946510, ассоциированного с рассеянным склерозом, воспалительными заболеваниями кишечника и астмой, показано, что клетки с более распространенным генотипом CC обладают более высокой экспрессией генов IKZF3, ORMDL3 и GSDMB, по сравнению с клетками с генотипом TT. При анализе генетических маркеров предрасположенности к тяжелому течению COVID-19 был исследован полиморфизм rs71327024, расположенный в локусе хемокиновых рецепторов 3p21.31 и ассоциированный с развитием “цитокинового шторма” при COVID-19. Охарактеризован участок генома, содержащий данный полиморфизм и проявляющий энхансерную активность в CD4+ T-клетках человека. Показано, что энхансер, содержащий более распространенный аллель rs71327024(G), существенно усиливает активность промотора гена CXCR6, в отличие от энхансера с минорным вариантом этого полиморфизма (T). Это связано с критическим влиянием данного полиморфизма на способность энхансера связываться с фактором c-Myb.

 

Публикации

1. - УЧЕНЫЕ НАШЛИ ГЕННЫЙ «ПРЕДОХРАНИТЕЛЬ» ДЛЯ МЕТАСТАЗОВ РАКА ГРУДИ Информационное агентство "Научная Россия", - (год публикации - ).

2. - Ученые нашли генный «предохранитель» для метастазов рака груди Информационно-сервисный портал Indicator.Ru, - (год публикации - ).

3. Горбачева А.М., Уварова А.Н., Устюгова А.С., Батрахайя А., Корнеев К.В., Купраш Д.В., Митькин Н.А. EGR1 and RXRA transcription factors link TGF‑β pathway and CCL2 expression in triple negative breast cancer cells Scientific reports, Том. 11, номер 1, страницы 1-13. (год публикации - 2021).

4. Корнеев К.В., Устюгова А.С., Митькин Н.А., Уварова А.Н., Дёмин Д.Э., Калмыков В.А., Коршунова Д.С., Силаева Ю.Ю., Шварц А.М., Афанасьева А.А., Дейкин А.В., Купраш Д.В. Use of CRISPR/Cas9 gene targeting to conditionally inactivate immunological checkpoint Tim-3 in mice FEBS OPEN BIO, Том 11, приложение 1, страница 282 (год публикации - 2021).

5. Уварова А.Н., Митькин Н.А., Корнеев К.В., Демин Д.Э., Устюгова А.С, Купраш Д.В., Шварц А.М. Molecular mechanisms underlying the regulation of HAVCR2 expression in myeloid cells FEBS OPEN BIO, Том 11, приложение 1, страница 108 (год публикации - 2021).

6. Уварова А.Н., Стасевич Е.М., Мурашко М.М., Устюгова А.С., Митькин Н.А., Корнеев К.В., Купраш Д.В., Кулаковский И.В., Шварц А.М. CXCR6 expression depends on the genetic polymorphisms in the 3p21.31 locus enhancer region in CD4+ T cells European Journal of Immunology, Том 51, приложение S1, страница 234 (год публикации - 2021).

7. Уварова А.Н., Устюгова А.С., Митькин Н.А., Шварц А.М., Корнеев К.В., Купраш Д. В. МИНОРНЫЙ T-АЛЛЕЛЬ ОДНОНУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА rs13360222 СНИЖАЕТ АКТИВНОСТЬ ЭНХАНСЕРА ГЕНА HAVCR2 В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ МАКРОФАГОВ ЧЕЛОВЕКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, Том 56, № 1, стр. 126–134 (год публикации - 2022).

8. Устюгова А.С., Купраш Д.В., Афанасьева М.А. Genome editing confirms functionality of autoimmunity‐associated intergenic polymorphism rs12946510 in a T‐helper cell line European Journal of Immunology, Том 51, приложение S1, страница 239 (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
не указано