Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетном году была проведена оптимизация системы, необходимой для создания уникальной линии мышей с “флоксированным” геном Havcr2, кодирующим иммунологический чекпойнт TIM-3, на основе которой в будущем планируется получение мышей с тканеспецифической делецией TIM-3 в миелоидных клетках. В качестве наиболее подходящего инструмента для выполнения данной задачи была выбрана система программируемой геномной нуклеазы CRISPR/Cas9, которая позволяет вносить разрезы в выбранные места генома с последующей интеграцией в них сайтов loxP путем гомологичной репарации с использованием ДНК-доноров. Подобраны и успешно протестированы направляющие РНК, фланкирующие экзон 4 и не затрагивающие сайты сплайсинга. Также получены одноцепочечные донорные ДНК, содержащие последовательности loxP сайтов и "плечи" гомологии с участками, фланкирующими места посадки направляющих РНК. Таким образом, полностью подготовлена система для “флоксирования” экзона 4 гена Havcr2. Донорные ДНК и плазмиды pX330, содержащие ген Cas9 и последовательности для экспрессии направляющих РНК, были инъецированы преимущественно в мужские пронуклеусы 3108 оплодотворенных яйцеклеток мышей. После микроинъекции и краткосрочного культивирования осталось 714 клеток, пригодных для трансплантации (из них 482 на стадии двух бластомеров), их пересадили 48 псевдобеременным самкам-реципиентам, из которых у 3 реципиентов родилось 7 мышат. Из геномной ДНК полученного потомства, плацент, абортированного материала и излишка инъецированных бластоцист амплифицировали области вокруг предполагаемых loxP вставок. Полученный ПЦР продукт секвенировали, анализ сиквенса проводили с помощью алгоритма множественного выравнивания последовательностей (MAFFT). В геноме одного выжившего мышонка были обнаружены мутации в области разреза Cas9. Для более точного определения изменений в геноме будет проведен анализ потомства F1. Для повышения вероятности получения мышей с "флоксированным" аллелем Havcr2, мы подготовили альтернативный дизайн внесения loxP сайтов, фланкирующих экзон 4, в один этап, который предполагает использование одной направляющей РНК и донорной плазмиды, позволяющей вносить сразу оба loxP сайта. Была произведена сборка всех необходимых плазмид, система подготовлена к тестированию в бластоцистах. С помощью биоинформатического анализа мы определили промотор и возможный энхансер гена HAVCR2. Было показано, что разные варианты полиморфизмов rs10515746 и rs4704853, ассоциированных с ревматоидным артритом и раком груди, не оказывают значимого влияния на активность данного промотора в модели активированных моноцитов человека. Однако минорные варианты сцепленных с ними полиморфизмов rs560127761 (G) и rs189392665 (Т) значимо повышают активность промотора HAVCR2 в используемой модельной системе (клетки линии U937 миелоидного происхождения). Помимо этого, была показана дифференциальная экспрессия генов-мишеней TLR4 при нокдауне его основного транскрипционного регулятора SPI1, а также предложена гипотеза о SPI1-зависимой модуляции энхансерных свойств 3’-нетранслируемой области TLR4.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
За отчетный период мы продолжили исследование альтернативных подходов к получению мышей с флоксированным геном Havcr2. Мы показали работоспособность ранее подобранной направляющей РНК sg6, комплементарной области внутри экзона 4 гена Havcr2. После микроинъекции линеаризованного донора и направляющей РНК в составе вектора pX330 выжило 806 клеток, их трансплантировали 65 псевдобеременным самкам-реципиентам. В итоге родилось 29 мышат, некоторые из которых имели мутации в месте предполагаемого разреза белком Cas9. Кроме того, была получена уникальная нокаутная мышь, в которой произошла делеция почти всего 4 экзона гена Havcr2, а также удалена часть 3 интрона, содержащая бранч-сайт и акцепторный сайт сплайсинга. Мы показали, что полученные первичные клетки миелоидного ряда (макрофаги и дендритные клетки костномозгового происхождения) обладают достоверно детектируемым уровнем экспрессии белка TIM3, который может быть снижен посредством трансфекции клеток анти-Havcr2 siRNA. Подобный подход позволил получить панель первичных миелоидных клеток мыши разных субпопуляций с дифференциальной экспрессией гена Havcr2, а также оценить экспрессию генов основных про- и противовоспалительных цитокинов после специфической активации полученных клеток. В рамках изучения генов, отвечающих за взаимодействие между клетками в опухолевом микроокружении, мы описали энхансер, находящийся в третьем интроне человеческого гена HAVCR2, а также выявили однонуклеотидный полиморфизм rs13360222 этого энхансера, минорный вариант которого вероятно влияет на активность промотора гена HAVCR2 в модели моноцитарных клеток. Также мы описали влияние минорного варианта однонуклеотидного полиморфизма rs2295613 промотора человеческого гена SLAMF1 на его активность. Введение минорного варианта данного полиморфизма приводит к повышению активности промотора SLAMF1 в клетках В-лимфобластоидной линии Raji. Мы осуществили сборку люциферазной репортерной конструкции, содержащей промотор гена хемокина CCL2, участвующего в регуляции противоопухолевого иммунного ответа и модификации опухолевого микроокружения, а также провели делеционный скрининг CCL2 промотора в культурах клеток рака человека и выявили участок промотора гена CCL2, отвечающий за регуляцию промотора противовоспалительными стимулами, продуцируемыми опухоль-ассоциированными макрофагами. Кроме того, мы провели биоинформатический поиск полиморфизмов некодирующих областей генов, ассоциированных с тяжелым течением инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV2.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Исследован новый подход к получению флоксированного аллеля гена Havcr2 с использованием направляющих РНК, комплементарных областям гена Havcr2 внутри интронов 3 и 4, соответственно, и длинного одноцепочечного донора (1350 нуклеотидов). 597 выживших бластоцист трансплантировали псевдобеременным самкам-реципиентам, у которых родилось 39 мышат. По результатам ПЦР-скрининга было отобрано четыре первичных трансгена из которых две самки дожили до этапа размножения, однако у их потомства в геноме не было обнаружено целевых интеграций. Самка с делецией почти всего 4 экзона и части 3 интрона гена Havcr2 также не принесла жизнеспособного потомства, что указывает на важность TIM-3 для обеспечения иммунологической толерантности при беременности. Высокоэффективный нокдаун TIM-3 в человеческих моноцитах и мышиных макрофагах позволил охарактеризовать его роль в регуляции воспалительного ответа миелоидными клетками при воздействии различными активационными стимулами. Оказалось, что дефицит TIM-3 в моноцитах человека приводит к снижению продукции IL-10 при активации с помощью TNF, но усиливает экспрессию IL-6 при ЛПС-активации. Нокдаун гена Havcr2 в макрофагах мыши вызывает повышенную экспрессию генов Il6 и Il10 при ЛПС-активации, стимуляция локсорибином (лиганд рецептора TLR7) приводит к усилению экспрессии только Tnf, в то время как активация с использованием CpG (лиганд TLR9) вызывает достоверное увеличение экспрессии Tnf, Il6 и Il10. Охарактеризованы промотор и энхансер гена HAVCR2 человека, показано, что наиболее активная область промотора располагается в пределах 200 п.н. до старт-кодона этого гена. В третьем интроне гена HAVCR2 обнаружен энхансер, способный существенно повышать активность промотора этого гена. В данном энхансере был функционально охарактеризован полиморфизм rs13360222, минорный вариант которого (Т) достоверно снижает энхансерную активность в модели активированных моноцитов. Это наблюдение может дополнить существующую схему молекулярных механизмов патогенеза аутоиммунных патологий. В результате оценки активности промотора гена CCL2 в клеточной модели рака молочной железы человека выявлено, что ключевую роль в регуляции экспрессии CCL2 в ответ на противовоспалительные стимулы играют транскрипционные факторы EGR1 и RXRA, формирующие недостающее звено в TIM3 - TGFβ - (EGR1/RXRA) - CCL2 регуляторной петле (https://www.indicator.ru/medicine/uchenye-nashli-gennyi-predokhranitel-dlya-metastazov-raka-grudi-18-09-2021.htm). Показано, что более редкий аллель полиморфизма rs2295613 (A) промотора гена SLAMF1, ассоциированный с риском развития системной красной волчанки, повышает активность данного промотора в В-клетках человека за счёт образования эффективного сайта связывание фактора c-Myc. При изучении Т-лимфоцитов человека, несущих разные генетические варианты полиморфизма rs12946510, ассоциированного с рассеянным склерозом, воспалительными заболеваниями кишечника и астмой, показано, что клетки с более распространенным генотипом CC обладают более высокой экспрессией генов IKZF3, ORMDL3 и GSDMB, по сравнению с клетками с генотипом TT. При анализе генетических маркеров предрасположенности к тяжелому течению COVID-19 был исследован полиморфизм rs71327024, расположенный в локусе хемокиновых рецепторов 3p21.31 и ассоциированный с развитием “цитокинового шторма” при COVID-19. Охарактеризован участок генома, содержащий данный полиморфизм и проявляющий энхансерную активность в CD4+ T-клетках человека. Показано, что энхансер, содержащий более распространенный аллель rs71327024(G), существенно усиливает активность промотора гена CXCR6, в отличие от энхансера с минорным вариантом этого полиморфизма (T). Это связано с критическим влиянием данного полиморфизма на способность энхансера связываться с фактором c-Myb.