Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Продолжена работа по развитию методов структурного анализа биомакромолекул и их комплексов с помощью дейтеро-водородного обмена в комбинации с методами тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения. Ранее, исследуя реакцию дейтеро/водородного обмена белков в стандартном источнике для электроспрея, было обнаружено, что даже при максимально допустимой температуре капилляра (450C) не удается достигать очень высокой глубины обмена. Было проведено исследования применимости капилляров различной длины для повышения эффективности реакции дейтеро/водородного обмена при атмосферном давлении. В отличие от предыдущих экспериментов было обнаружено, что увеличение температуры во внешнем капилляре приводит к фрагментации ионов. Сравнив фрагментацию в капилляре со столкновительно индуцированной фрагментацией, осуществленной в ионной ловушке, было обнаружено, что при фрагментации в капилляре образуются те же самые b/y ионы, хотя их относительная интенсивность различается. Было обнаружено, что фрагментация ионов является фактором, ограничивающим возможную глубину реакции дейтеро/водородного обмена. Было исследовано поведение нековалентного комплекса молекулы стрептавидина, которая является тетрамером массы 53кДа, составленной из одинаковых субъединиц. Исследован эффект термической диссоциации молекул стрептавидина. Показано, что механизм диссоциации удовлетворяет ранее известному механизму, включающего стадию переноса значительной части заряда на мономер. Также, совместно с ИБХФ РАН на начато изучение влияние посттрансляционных модификаций (ПТМ) на структуру и функцию белков. Исследование проводится на модели окислительного повреждения белков, индуцированного воздействием активных форм кислорода (АФК) и ультрафиолета. Точная и надежная идентификация неизвестных соединений и всесторонняя характеристика биологических систем на молекулярном уровне являются конечными целями масс-спектрометрии. Дополнительная структурная информация о молекуле для ее идентификации может быть получена при помощи селективных химических модификаций таких как водородно-дейтериевый обмен (H/D-обмен) или 16O/18O обмен. В мягких условиях число обменов можно предсказать, если известна структура молекулы (SMILES или SMARTS). Таким образом, применяя современные инструменты химической информатики, число обменов, наблюдаемых экспериментально для неизвестных молекул, можно использовать в качестве структурного дескриптора при выполнении поиска в базе данных. Растворение образца в D2O вместо H2O приводит к мгновенному обмену протонов у всех функциональных групп таких как −OH, −COOH, −NH и –SH. Добавление кислоты и основания или проведение реакции при повышенной температуре и давлении приводит к замене H на D в обогащенных электронами сайтах ароматического кольца. Методы ионизации биомакромолекул (ESI и MALDI) открыли новые возможности для приложений H/D обмена в исследовании конформаций макромолекул в растворителе и газовой фазе. В ходе исследования был представлен новый подход для повышения надежности идентификации липидов методами LC-MS и H/D обмена. Данный подход основан на характеристике соединений не только по времени элюирования, точной массе и спектрам фрагментации, но также и по количеству лабильных водородов, которые могут быть измерены с использованием метода H/D обмена. Количество лабильных водородов (из групп -OH и -NH) служит дополнительным структурным дескриптором, используемым при выполнении поиска в базе данных. Для эксперимента LC-MS H/D-обмен проводили в нагревательном капилляре модифицированного источника ионизации распылением в электрическом поле (ESI). Предложенный аналитический подход может быть успешно использован для идентификации не только липидов, но и пептидов и метаболитов. В частности, в комбинации со сверхвысоким разрешением масс-спектрометрии ИЦР ПФ, изотопный обмен позволяет предположить структуры, которые соответствуют брутто-формулам, определяемым в экстремально сложных смесях, таких как гуминовые вещества (ГВ). Интерес к ГВ обосновывается широким кругом их биологической активности. В рамках сотрудничества с Химическим факультетом МГУ был проведен анализ методом ИЦР МС образцов ГВ углей, проявляющих антивирусную активность по отношению к вирусу клещевого энцефалита. Для получения списка структур, возможно соответствующих компонентам ГВ, был проведен сбор данных из базы данных биологической активности ChEMBL. Полученные результаты позволили наложить дополнительный фильтр на структуры из ChEMBL: компонентам ГВ могут соответствовать только структуру, удовлетворяющие результатам изотопного обмена. Разработанный подход и пример получаемых структур представлены в виде статьи в высокорейтинговом журнале. Известно, что во время масс-спектрометрического анализа процесс ионизации (электроспрей) может существенным образом искажать структуру биомакромолекулы и даже приводить к образованию соединений, которые в естественных условиях не встречаются. Одним из примеров такого эффекта является обнаруженное нами явление «суперметаллизации» ионов пептидов и белков. Для получения суперметаллизированных комплексов был разработан универсальный подход к проведению реакции обмена водорода в белках и пептида, в том числе на атомы металла. Предложена конструкция реактора, в которой реализован следующий подход: 1) раствор с образцом (напр. пептид и соли металла) поступает сквозь иглу электроспрея в герметичную камеру; 2) на иголку подается потенциал порядка 3кВт и с конца иглы срываются заряженные капли; 3) игла обдувается газом, который создает избыточное давление в камере, которое проталкивает капли через нагреваемый капилляр (другой конец капилляра открыт на атмосферу); 4) реакция суперметаллизации белка или пептида происходит в капилляре за счёт высокого нагрева (более 200С), при этом степень металлизации можно контролировать задавая температуру капилляра; 5) если в обдувочный газ подмешивать пары D2O, то в капилляре будет происходить реакция дейтеро/водородного обмена. Важным преимуществом данной конструкции является её полная независимость от масс-спектрометра и устройства его камеры ионизации. Некоторые широко распространенные масс-спектрометры не позволяют нагревать десольватирующий капилляр до высоких температур, а температура, как показано было показано в экспериментах, играет огромную роль при исследовании эффекта суперметаллизии. В рамках задачи протеомного и метаболомного анализа археологических и палеонтологических образцов, была разработана процедура экстракции белковой фракции из кости сибирского мамонта. Разработан метод проведения ферментативного гидролиза, с учетом особенностей образца. Идентифицированные белки из кости сибирского мамонта относились к классу модуляторов различных ферментов, белкам внеклеточного матрикса, а также к классу гидролаз. Зачастую данные белки ассоциированы с коллагеном (бигликан, люмикан и т.д.). Также были выявлены белки плазмы, такие как альбумин, концентрация которого в кости была очень высока. Некоторые из детектированых белков играют важную роль в формировании костной ткани, к примеру, секретируемый фосфопротеин (SPP2) принимает участие в обмене костной ткани, остеоглицин (OGN) индуцирует образование новой костной ткани в сочетании с TGF-бета-1 или TGF-бета-2 белками, альфа-2-HS-гликопротеин (AHSG) влияет на минерализацию кости. Разработанный протокол белковой экстракции применялся, совместно с ИМБП РАН, в рамках инициативы Всемирной организации по изучению протеома человека (НUPO) “Human proteomics at extreme conditions”, созданной нами с целью накопления и обобщения протеомных данных о влиянии экстремальных факторов на организм человека. В рамках данной работы проводилась экстракция белковой фракции плазмы крови полученной от 13 Российских космонавтов за полгода до (R0), а также на первые сутки (R+1) после приземления. В результате оптимизированной методики было выявлено 1900 пептидов 419 различных белков (FDR<0,01). Среди них также были выявлены белки, изменившие свой предполетный уровень предположительно под влиянием комплекса факторов космического полета. По результатам данной работы была опубликована статья в высокорейтинговом журнале. В рамках проекта был проведен первый анализ молекулярного состава гуминовых веществ (ГВ) глубоких слоев вечной мерзлоты. Было показано, что азотсодержащие алифатические соединения в наибольшей степени подвержен атаке микроорганизмами, причем даже на относительно небольшой глубине едомы (3 метра) их содержание существенно выше, чем в глубоких слоях аласа. В условиях глобального потепления это позволяет предположить повторение биогеохимических процессов, происходящих на границе Плейстоцена и Голоцена. Результаты были опубликованы в высокорейтинговом журнале. Также в ходе работы над проектом нами было получено аналитическое решение для системы кинетический уравнений, описывающие процесс обмена изотопов для молекулы. Детальное решение задачи представлено в дополнительных материалах. Была проведена оценка энергия активации для нескольких ионов и были найдены её значения в пределах 0.04−0,3 эВ. Значение энергии активации может указывать на наличие определенных функциональных групп в молекуле. Полученные результаты могут использоваться для определения типов функциональных групп в реальных биомакромолекулах (белках, пептидах) и их комплексах. Полученные результаты могут использоваться для определения типов функциональных групп в реальных биомакромолекулах (белках, пептидах) и их комплексах. В рамках проекта отдельно рассматривался вопрос определения влияния методов возбуждения циклотронного движения на концентрационный порог коалесценции пиков в ионных ловушках Пеннинга. Нами показано, что в соответствии с развитой нами ранее теорией коалесценции порог коалесценции может быть увеличен при увеличении разности радиусов циклотронного движения и должен квадратично расти с увеличением этой разницы. Возбуждение на разные радиусы возможно в моде сканирования частоты в процессе возбуждения или в режиме SWIFT при подборе амплитуд возбуждения для близких m/z ионов. В рамках данного этапа выполнения работ детально исследован эффект слияния (коалесценции) ионных облаков с близкими массами при движении в ловушке масс-спектрометра ИЦР ПФ для магнита с напряженностью поля 21 Тесла, расположенного в Национальной лаборатории высоких магнитных полей (Флорида, США). Представленные результаты являются практически значимыми при планировании экспериментом с ультравысоким разрешением. В заключении хочется отметить, что все исследования за подотчетный период выполнены в запланированном объеме. Результаты проделанной работы представлены в 4 статьях в рецензируемых журналах, входящих в перечень Web of Science, Scopus, в том числе в изданиях первого квартиля (Q1), а также в виде устных и постерных докладов на ведущих международных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Масс-спектрометрия в сочетании с методами мягкой ионизации является мощным методом для исследования нековалентных комплексов белок-лиганд. Был исследован комплекс белков: барназы и ее ингибитора барстара. В рамках нашей работе для исследования комплекса bn-b* было предложено использование оригинального метода обмена в источнике ионизации в условиях нативного электроспрея. Максимальное число обменов было равно ~62 (79% от быстро обменивающихся протонов и 0.37% от всех подвижных водородов) при 450 C. В случае bn, число обменов уменьшилось с ростом заряда состояния и для наивысшей температуры 450 C изменялось от 83 (78% быстрых и 40% всех) для bn13+ до 117 (55% всех) для bn7+. Комплекс bn-b*обменивает при наивысшей температуре 450 C 184 (48% всех) и 202 (53% всех) атомов водорода для [bn-b*]11+ и [bn-b*]10+ соответственно. Таким образом были продемонстрированы новые возможности для исследования комплекса bn-b* с использованием оригинального метода обмена в источнике ионизации в условиях нативного электроспрея. Благодаря комбинированному источнику реакция H/D обмена комплекса bn-b* проходила в нативных условиях электроспрея. Отдельным этапом работы было исследование комплексов белка с металлами в составе флуоресцентных нанокластеров (НК). В данной работе, совместно с ФХМ ФМБА были исследованы флуоресцентные нанокластеры (НК) Au, Cd, биметаллические Au-Cd размером менее 1,6 нм, стабилизированные бычьим сывороточным альбумином (BSA). На основании данных масс-спектрометрии, а также энергодесперсионной рентгеновской спектроскопии среднее количество атомов металла на каждую молекулу BSA было оценено в 15 для НК BSA-Au; 40 для НК BSA-Cd; 9 атомов Au и 26 Cd для биметаллических НК Au-Cd. Нанокластеры продемонстрировали большие значения стоксовых сдвигов величиной более 130 нм. Максимум флуоресценции для НК Au при длине волны возбуждения в 325 нм наблюдался при 410 и 650 нм; для НК Cd при возбуждении на 370 нм максимум излучения –на 500 нм, тогда как для смешанных НК Au-Cd наблюдались 2 пика: 440 и 640 нм при возбуждении на 365-380 нм. Для клеточных линий человека HEp-2 и L41 как нанокластеры Au и Cd в комплексе с BSA оказались менее токсичными по сравнению с исходными растворами CdCl2 и HAuCl4. Белковые наночастицы, изготовленные из BSA в комплексе с нанокластерами металлов сохраняют свойства флуоресценции. Стоит отметить, что в отличии от ранее исследованных суперметаллизированных комплексов (белок-метал), встраивание металла и образование ковалентной связи не происходит при образовании флуоресцентных нанокластеров. Результаты работы были опубликованы в Q1 журнале Materials & Design. При исследовании крупных биомакромолекул (>100кДа) и их комплексов в нативном состоянии методов Top-Down, Middle-down необходимым является повышенная разрешающая способность масс-спектрометра. Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (ИЦР ПФ, тип масс-анализатора для определения отношения массы к заряду по циклотронной частоте вращения иона в фиксированном магнитном поле) дает самую высокую среди всех масс-спектрометрических методов точность измерения масс и разрешающую способность. В рамках данного этапа работы была предложена более оптимальная конфигурация динамически гармонизированной ионной ловушки открытого типа для масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса, которая позволяет увеличить предел максимального разрешения ловушки при фиксированной величине магнитного поля. Предложенная ловушка обеспечивает сверхвысокую разрешающую способность масс-спектрометра при улучшении эксплуатационных характеристик прибора и может найти применение во многих областях техники, включая исследовании крупных биомакромолекул (>100кДа) и их комплексов в нативном состоянии методов Top-Down, Middle-down. Для расчета геометрии электродов открытой ловушки ИЦР с динамической гармонизацией авторами было проведено компьютерное моделирование распределения электрического поля в ловушках разного типа. По результатам работы подготовлена публикация Nikolaev E, Lioznov A. Evaluation of major historical ICR cell designs using electric field simulations. Mass Spectrom Rev. (2020 г.) Применение развиваемых методов анализа применялось для полного секвенирования и анализа вторичной структуры больших белковых молекул и их комплексов, в том числе моноклональных антител, имеющих терапевтическое значение. В результате использования двух тандемных масс-спектрометров высокого разрешения получено 100% покрытие сиквенса исследуемых девяти препаратов Инфликсимаб, как для тяжелой, так и легкой цепи. По результатам проведенного анализа S-S мостиков было установлено, что во всех исследованных образцах наблюдаются 5 основных S-S мостиков, не наблюдаются мостики L23-L88 (L-легкая цепь) и H147-H203 (H-тяжелая цепь), дополнительно наблюдаются 7 мостиков, образование которых возможно связано с перестройкой исходных мостиков. В большинстве случаев масс-спектры столкновительной фрагментации позволяли подтвердить наличие S-S мостиков. В случае плохой МС/МС фрагментации комплекса связанных пептидов использовался поиск масс-спектр высокого разрешения для подтверждения наличия комплекса по точной массе. В результате исследования продемонстрированы возможности разрабатываемых методов масс-спектрометрии высокого разрешения для проведения сравнительного анализ структуры моноклональных антител, имеющих терапевтическое значение. В рамках развития масс-спектрометрических подходов для исследования механизмов окислительной модификации белков продолжены совместные исследования с ИБХФ РАН (лаб. М.А. Розенфельда). Основной целью данного этапа проекта было изучение окислительной модификации FXIII при действии на него активных форм кислорода (АФК) образующимися за счёт озонирования в реакторе или обработки гипохлоритом. Картирование окислительных сайтов, образующихся при действии АФК на FXIII на различных ступенях его активации, было детально исследовано методами масс-спектрометрии высокого разрешения. Окислительные модификации субъединицы FXIII-A были обнаружены для аминокислотных остатков Met, Trp, Tyr, Lys, Cys, Asp, Pro, His, Arg, Glu. На основании данных ВЭЖХ-МС/МС контрольных и окисленных образцов FXIII на отдельных стадиях его активации показано, что наибольшее количество и процентное содержание модифицированных аминокислотных остатков (по отношению к количеству аминокислотных остатков, входящих в МС-покрытие), наблюдалось в окисленных образцах активированной формы FXIIIa. Показано, что наиболее подверженными окислительной модификации структурными элементами оказались β-баррель 2 каталитической субъединицы (FXIII-A) и 8-й суши-домен регуляторной субъединицы (FXIII-B). Основные результаты были опубликованы в журнале Biomolecules (Q1). Были продолжены работы, совместно с ИМБП РАН, по совершенствованию методов исследования пептидома, протеома, метаболома физиолочисеских жидкостей человека при воздействии экстремальных факторов космического полета. Исследованы изменений протеома внеклеточных жидкостей тела добровольцев, участвующих в эксперименте с антиортостатической гипокинезией (АНОГ -6° 21 сут). Исследование изменений протеома внеклеточных жидкостей тела в условиях моделированной невесомости средней продолжительности остается актуальным для уточнения физиологических механизмов регуляции гомеостаза и имеет важное значение для гравитационной физиологии и медицины. Были аннотированы и проведен полуколичественный анализ уровней 239 белков плазмы крови добровольцев обоих сеансов АНОГ. К концу эксперимента АНОГ без использования контрмер выявлено достоверное изменение относительной концентрации 33 белков. Было определено 13 белков, концентрации которых значительно изменились концу АНОГ с физическими тренировками. Физические тренировки способствовали повышению концентрации белков, участвующих в нормализации углеводного и липидного обменов - белка, стимулирующего макрофаги, и фосфатидилинозитолгликан-специфической фосфолипазы D, что указывает на эффективность профилактических мер. Были получены новые протеомные данные по измененеию протеома эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) в условиях микрогравитации. Для выявления внутриклеточных механизмов, включающихся в начальный период адаптации эндотелиальных клеток (ЭК) к условиям микрогравитации, исследовали протеом ЭК. Было показано, что наибольшее влияние условий микрогравитации приходится на белки, ассоциированные с актиновым цитоскелетом, а также на белки адгезии, свойства которой также зависят от структуры цитоскелета. Более того, увеличение или снижение экспрессии данных белков является реакцией клетки на происходящие в ней изменения и направлено на снижение реорганизации цитоскелета. В условиях моделирования условий микрогравитации в пятидневной сухой иммерсии, была проведена оценка регуляторных и метаболических процессов в системе кровообращения основывалась на анализе вариабельности сердечного ритма (ВСР) и протеомного профиля мочи. На основе математического и биоинформационного анализа из общей совокупности выделены белки, ассоциированные с состоянием сердечно-сосудистой системы и вегетативной регуляцией ритма сердца (серотрансферрин, тирозинкиназный рецептор UFO, простатическая кислая фосфатаза, секретируемый и трансмембранный белок 1, молекула клеточной адгезии 4, галектин-3-связывающий белок, константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина А, белок ассоциированный с ремоделированием матрикса 8, биотинидаза). Впервые выстроены ассоциативные связи между белками – маркерами процесса вегетативной регуляции сердечного ритма. Описанная комбинация обеспечивает баланс между симпатическими и парасимпатическими влияниями на сердечный ритм у молодых и здоровых обследованных. Таким образом, на основе протеомики представлены новые данные отражающие особенности физиологической регуляции сердечного ритма в протеоме мочи практически здоровых мужчин. Основные результаты работы опубликованы в Q1 журналах Frontiers in Physiology, Acta Astronautica.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За подотчетный период были достигнуты следующие результаты: Было продолжено исследование стабильности белковых комплексов в газовой фазе в условиях ионизации методом электроспрея (ESI) с дальнейшим использованием масс-спектрометра высокого разрешения (FT-ICR-MS). В качестве объекта исследовался комплекс тетра-пептида HAEE с бета-амилоидным пептидов (Аβ). Выбор объекта связан с тем, что патогенез болезни Альцгеймера тесно связан с нарушениями в холинэргической системе, в частности в связи с блокировкой ацетилхолиновых рецепторов накапливающимся бета-амилоидом. Для решения данной проблемы осуществляется поиск потенциальных мишеней, которые бы позволили предотвратить данное взаимодействие. Одним из подобных соединений является тетра-пептид HAEE, который является комплементарным по заряду участку петида Aβ(11-14), стратегически важного для многих патологических реакций связывания бета-амилоида, таких как координация ионов цинка, димеризация и др. В ходе исследования были проведены работы по оптимизации условий образования, ионизации и детектирования с помощью электроспрей ионизации и тандемной масс-спектрометрии комплексов Aβ с пептидом НАЕЕ, а также тройного комплекса в присутствии ионов цинка. А также было проведено исследования влияния структурной изомеризации пептида Aβ на комплексообразование. Была подобрана буферная система, рН, концентрации солей и пептидов для надежного детектирования образующихся комплексов. Показано что изомеризованная по аспартату-7 форма Aβ лучше образует комплексы с пептидом-мишенью, чем нативная форма, а также легче наблюдается образование тройного комплекса с цинком. Проведена оптимизация условий ионизации Aβ в источнике MALDI для дальнейшего использования MALDI-TOF-масс-спектрометрии. За счет простой пробоподготовки и отсутствия необходимости очистки ионного источника между измерениями, MALDI позволяет анализировать большое количество образцов за короткий промежуток времени. Предварительно проведены измерения Aβ16 и Аβ42 с различными матрицами в режимах положительных и отрицательных ионов. Были отобраны следующие растворы матриц для дальнейшего рассмотрения: DHB, 0.1% Trifluoroacetic Acid (TFA) в 30% Acetonitrile и DHB, 0.5% Phosphoric Acid (PA) в 30% Acetonitrile (ACN). Выбор этих матриц обусловлен высокой интенсивностью получаемых спектров, а также лучшей интенсивностью Аβ формы амилоида как для пептида 1-16, так и для 1-42. Раствор матрицы DHB, 1.5-2% PA показал себя лучше всего, в то время как интенсивность пептида в стандартных условия (DHB, 0.1% TFA) оказалась значительно меньше. Был разработан способ количественного определения изомеризации аспартата 7 (Asp7) в бета-амилоидном пептиде (Аβ) с использование тандемной MALDI-TOF масс-спектрометрии, а также масс-спектрометрии с ионной подвижностью. Был проведен анализ изомеризованных форм амилоида (isoD7-Aβ) в формировании амилоидных отложений в мозге мышей линии 5xFAD, модели болезни Альцгеймера. В работе были задействованы образцы мозга от трансгенных мышей линии 5xFAD, и стандартная модель сверхэкспрессии человеческого Aβ, широко используемая в исследованиях болезни Альцгеймера. Следует отметить, что сравнение динамики накопления для изомеризованной формы и для амилоида в целом выявляет задержку между ними для точек в интервале от 6 до 9 месяцев. Увеличение относительного содержания isoD7-Aβ, начинается после 7-месячного возраста, в то время как увеличение общего содержания амилоида в тот момент еще не наблюдается. Это свидетельствует о том, что прогрессирующая изомеризация может запускать последующую фазу резкого увеличения общего содержания Aβ, которое начинается после 9-месячного возраста. Скорость роста части изомеризованной формы на протяжении жизни мыши оказывается более или менее постоянной, что может отражать процесс спонтанной изомеризации, сопровождающий старение отложений амилоида. Планируется дальнейшее внедрение разработанного метода для анализа биоматериала (кровь, ликвор, ткани мозга) от пациентов. Результаты представлены на ведущих международных конференция (ASMS, HUPO, Lancet summit) и готовятся к публикации в высокорейтинговом журнале. Продолжены работы по совершенствованию масс-анализаторов для исследования биомакромолекул. В рамках данного этапа работы мы представляем возможность встраивания ловушки в вакуумную трубу, что позволяет уменьшить площадь, с которой могут появиться остаточный газ и ещё больше увеличить качество вакуума. В рамках теоретической части мы так же показали, что поле в ловушке близко к гармонизованному. Такое поле позволяет оценить время сигнала в несколько десятков секунд. В настоящее время решены технические проблемы по созданию подобной ловушки и ведётся её изготовление для дальнейшего тестирования. Для изготовления используется полый цилиндр с вырезанными титановыми электродами, скреплённый керамическим материалом с таким же коэффициентом расширения, что и у титана. Про новую ловушку и её встроенную модификацию была опубликована работа Nikolaev, Evgeny, and Anton Lioznov. "How to Increase Further the Resolving Power of the Ultrahigh Magnetic Field FT ICR Instruments? The New Concept of the FT ICR Cell–the Open Dynamically Harmonized Cell as a Part of the Vacuum System Wall." Analytical Chemistry 93.3 (2020): 1249-1253. Были продолжены работы исследованию окислительного повреждения белков. Совместно с ИБХФ РАН, исследованы изменения структуры и функции белков хрусталика глаза, а именно, бета-кристаллинов и их комплексов, за счёт воздействия ультрафиолета (УФ). Были проанализированы все возможные модификации и выявлены значимые модификаиции характерные как для кристаллинов разной локализации (ядро/кора), так и подвергшихся УФ излучению. Стоит отметить, что группа значимых модификаций для УФ воздействия в основном состоит из различных сайтов окисления остатков метионина (M), гистидина (Н) и триптофана (W), часто исполняющих роль быстрых перехватчиков в условиях окислительного стресса. Также показано, что быстрые окислительные модификации больше представлены в белках коры хрусталика, в то время как ядерные кристаллины отличаются содержанием метиллированных, убиквитинированных и деамидированных остатков, а также различными модификациями остатков цистеина и серина, которые накапливаются в белках по мере их «старения». Анализ главных компонентов позволил получить распределением и кластеризацией значимо различающихся модификаций и выделить 4 группы белков бета-кристаллинов хрусталика глаза, в зависимости от локализации (ядро/кора) и модификаций белков, вызванных воздействием УФ. УФ-облучение является важным катарактогенным фактором. Проводимые исследование представляют интерес для изучения молекулярных механизмов поддерживания и нарушения прозрачности хрусталика глаза, и разработки превентивных мер. Были продолжены работы, совместно с ИМБП РАН, по развитию масс-спектрометрических подходов для исследования пептидома, протеома, метаболома физиологических жидкостей человека при воздействии экстремальных факторов космического полета (КП). На данном исследовании была поставлена цель оценить влияние факторов КП на частоту пост-трансляционных модификаций (ПТМ) в белках плазмы крови в образцах, собранных у российских космонавтов. По результатам хромато-масс-спектрометрического анализа различных ПТМ были идентифицирован для 131 белка крови после полета. Белки с окислительными ПТМ (ox-ПТМ) были отобраны для дальнейшего анализа. Для каждого белка уровень окислительной модификации, вызванной КП, был получен путем сравнения ox-ПТМ между предполетными и послеполетными образцами. Динамики появления ox-ПТМ в белках крови была проанализирована с использование списка соответствующих уникальных триптических пептидов, причем белок входил в рассмотрение если для него удалось идентифицировать один или два уникальных пептида. Увеличение окислительной модификации после КП наблюдалось для большинства из 131 рассматриваемых белков, включенных в анализ ПТМ. Двукратное увеличение окисления по сравнению с предполетным уровнем наблюдалось для 30 белков крови, причем увеличение окисления белков было обнаружено исключительно после КП и отсутствовало в фоновой точке в случае 16 белков, при этом 26 белков крови демонстрировали одинаковый уровень окисления до и после КП. Измение уровня окислиения обнаружено для групп белков, которые участвуют в метаболизме внеклеточного матрикса (ECM), метаболизме липидов, иммунных функциях и контроле воспаления. Среди белковых групп наиболее значимо уровень окисления изменялся для аполипопротеинов (APOA1, APOA2, APOA4, APOL1 и APOE), причем повышение уровня окисление наблюдалось более чем в 5 раз (для APOA2) в образцах после полета по сравнению с их предполетным состоянием. Более чем двукратное увеличение интенсивности окислительной модификации наблюдалось для цепей как мембранных, так и секреторных иммуноглобулинов (Ig). Также в исследовании по космонавтам были количественно определены концентрации 121 белка плазмы крови. Выявлены различия в уровне белков (Immunoglobulin heavy constant mu, Complement C1q subcomponent subunit C, Plasma serine protease inhibitor, Protein- 72 kDa type IV collagenase, Fibulin-1, Immunoglobulin lambda constant 3) между двумя группами космонавтов с различным типом регуляции кровообращения, симпатотониками и ваготониками. Данные белки могут служить премаркерами вегетативного статуса. Дополнительно проведены исследования изменения протеома крови при моделировании условий невесомости в рамках эксперимента «сухая иммерсия» в ИМБП РАН. В ходе 21-суточной иммерсии после отбора проб у участников исследования выявлен геморрагический синдром легкой степени, проявляющийся в виде петехий, микрокровоизлияний и припухлостей кожи стоп. Была выделена группа из 6 белков, непосредственно связанных с повреждением сосудов, с травмой и изменением проницаемости. Показаны изменения уровня плазминогена, фибронектина, других факторов свертывания и фибринолиза; активация системы комплемента; измененения коагуляционного каскада и концентрации плазминогена и его активаторов (калликреина и др.); повышение содержание продуктов фибринолиза. Основные результаты исследований проведенных на данном этапе были опубликованы в Frontiers in Physiology (Q1, IF 4.6), Nikolaev E.N. et. al. Blood Plasma Proteins Associated With Heart Rate Variability in Cosmonauts Who Have Completed Long-Duration Space Missions. (2021 г.), а также Acta Astronautica (Q1, IF 2.4), Nikolaev E.N., Larina I.M. et. al. Characteristics of blood proteome changes in hemorrhagic syndrome after head-up tilt test during 21-day Dry Immersion (2021 г.).