Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Ацинетобактер (Acinetobacter baumannii) является одним из наиболее клинически значимых патогенов, опасных для пациентов с ослабленной иммунной системой. Одним из факторов вирулентности ацинетобактера является капсульный полисахарид (КПС, К-антиген), образующий толстый защитный слой (капсулу) вокруг бактериальной клетки. Структуры КПС отличаются выслким разнообразием, и на их основе штаммы ацинетобактера разделяют на 130 К-типов. Высокая устойчивость ацинетобактера к антибиотикам делает актуальной разработку альтернативного подхода к лечению инфекций, такого как вакцинотерапия, основанная на протективном иммунном ответе организма хозяина против КПС бактерий. Данный проект направлен на комплексное исследование КПС ацинетобактера, включая изучение его строения и генетики биосинтеза как молекулярной основы для классификации штаммов ацинетобактера и разработку подходов к созданию вакцины против вызываемых ими инфекций на основе КПС различных типов и их олигосахаридных фрагментов. В рамках проекта выделены КПС клинических изолятов ацинетобактера, относящиеся к восьми ранее неисследованным K-типам (К26, К102, К106, К112, К116, К127, К128 и К129). Методом ГЖХ-масс-спектрометрии установлен моносахаридный состав этих КПС, в которых идентифицированы как широко распространенные в природе моносахариды (глюкоза, галактоза, манноза, рамноза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин), так и сахара, которые редко встречаются в полисахаридах (N-ацетилманнозамин, 6-дезокситалоза). В КПС типа K26 на одном из моносахаридов обнаружена О-ацетильная группа. Установлены полные структуры всех восьми исследованных КПС, которые оказались регулярными полимерами, построенными из повторяющихся разветвленных пентасахаридных единиц (К-звеньев), за исключением КПС типа К106, который имел линейное тетрасахаридное К-звено. Выявлено структурное родство некоторых КПС между собой, основанное на одинаковом моносахаридном составе и идентичной последовательности моносахаридов в К-звене при различных типах гликозидных связей между моносахаридами внутри К-звеньев или связей между К-звеньями. В секвенированных генных кластерах биосинтеза изучаемых КПС найдены все гены, необходимые для синтеза КПС, в том числе гены синтеза нуклеотидных предшественников моносахаридных компонентов, гены гликозилтрансфераз и ацетилтрансферазы и гены процессинга: транслоказы для транспортировки К-звена, собранного на липидном носителе, через мембрану и полимеразы для полимеризации K-звена. Сравнением с последовательностями в базах данных выяснена специфичность всех трансфераз, включая инициирующую трансферазу, присоединяющую первый моносахарид К-звена к липидному носителю. По субстратной специфичности этой трансферазы установлена последовательность, в которой происходит присоединение моносахаридов в ходе сборки К-звена, и идентифицирована связь между К-звеньями, создаваемая в процессе полимеризации. Таким образом, генетические данные согласуются с установленными структурами КПС. В совокупности структурно-генетические данные вносят существенный вклад в разработку отсутствующей до сих пор классификации штаммов ацинетобактера по К-антигенам. Для получения олигосахаридных фрагментов КПС, сохраняющих иммунодетерминантные группы - эпитопы, присутствующие в исходных КПС, использовали рецепторные белки бактериофагов, обладающие полисахарид-деполимеразной активностью. С этой целью генерировали рекомбинантные деполимеразы бактериофагов, специфичных к трем клинически значимым штаммам ацинетобактера типов К1, К3 и К9. Расщепление этих КПС деполимеразами привело к необходимым олигосахаридам, соответствующим мономерам или олигомерам К-звеньев. На основании структуры этих продуктов выяснено, что все изученные деполимеразы являются гликозидазами, расщепляющими КПС по гидролитическому механизму. На основе нерасщепленного КПС типа К9 и полученных олигосахаридных фрагментов КПС типов К1, К3 и К9, синтезированы конъюгаты с белками: бычьим сывороточным альбумином, гемоцианином улитки и яичным альбумином. Интактность олигосахаридных фрагментов КПС в составе конъюгатов подтверждена данными спектроскопии ЯМР. По данным масс-спектрометрии в одну молекулу каждого белка включилось от пяти до семи олигосахаридных фрагментов. На мышах линии BALB/c отработана схема иммунизации с использованием в качестве антигенов гликонъюгатов на основе димера и тримера К-звена КПС типа К9 и соответствующего исходного КПС. Иммуногенность гликоконъюгатов на основе олигосахаридных фрагментов КПС оказалась выше, чем гликоконъюгатов на основе нерасщепленного КПС. Наиболее эффективными во взаимодействии с иммобилизованным КПС оказались иммунные сыворотки животных, иммунизированных гликоконъюгатами олигосахаридов с бычьим сывороточным альбумином. Таким образом, сделан вывод, что конъюгаты такого типа являются оптимальными для иммунизации.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Ацинетобактер (Acinetobacter baumannii) является одним из наиболее клинически значимых патогенов, опасных для пациентов с ослабленной иммунной системой. Одним из факторов вирулентности ацинетобактера является капсульный полисахарид (КПС, К-антиген), образующий толстый защитный слой (капсулу) вокруг бактериальной клетки. Структуры КПС отличаются высоким разнообразием, и на их основе штаммы ацинетобактера разделяют на 130 К-типов. Высокая устойчивость ацинетобактера к антибиотикам делает актуальной разработку альтернативного подхода к лечению инфекций, такого как вакцинотерапия, основанная на протективном иммунном ответе организма хозяина против КПС бактерий. Данный проект направлен на комплексное исследование КПС ацинетобактера, включая изучение его строения и генетики биосинтеза как молекулярной основы для классификации штаммов ацинетобактера и разработку подходов к созданию вакцины против вызываемых ими инфекций на основе КПС различных типов и их олигосахаридных фрагментов. В рамках исследованы КПС клинических изолятов ацинетобактера, относящиеся к K-ранее неисследованным типам (K1c, K17, К26, K27, K32, K55, K74, K85, К91 и К128). Методом ГЖХ-масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии установлен моносахаридный состав этих КПС, в которых идентифицированы как широко распространенные в природе моносахариды (глюкоза, галактоза, манноза, рамноза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, так и сахара, которые редко встречаются в полисахаридах (6-дезокситалоза, N-ацетилманнозаминуроновая кислота, N-ацетилгалактозаминуроновая кислота, ди-N-ацильные производные 6-дезокси-2,4-диаминохиновозы и легионаминовой кислоты). В КПС типа K26 на одном из моносахаридов обнаружена О-ацетильная группа. Установлены полные структуры исследованных КПС, которые оказались регулярными полимерами, построенными из повторяющихся олигосахаридных единиц (К-звеньев) который имел линейное тетрасахаридное К-звено. Выявлено структурное родство некоторых КПС между собой (K55, K74, K85), основанное на одинаковом моносахаридном составе и идентичной последовательности моносахаридов в К-звеньях при различных типах гликозидных связей между моносахаридами внутри К-звеньев или связей между К-звеньями. В секвенированных генных кластерах биосинтеза изучаемых КПС найдены все гены, необходимые для синтеза КПС, в том числе гены синтеза нуклеотидных предшественников моносахаридных компонентов, гены гликозилтрансфераз и ацетилтрансферазы и гены процессинга: транслоказы для транспортировки К-звена, собранного на липидном носителе, через мембрану и полимеразы для полимеризации K-звена. Сравнением с последовательностями в базах данных выяснена специфичность всех трансфераз, включая инициирующую трансферазу, присоединяющую первый моносахарид К-звена к липидному носителю. По субстратной специфичности этой трансферазы установлена последовательность, в которой происходит присоединение моносахаридов в ходе сборки К-звена, и идентифицирована связь между К-звеньями, создаваемая в процессе полимеризации. Таким образом, генетические данные согласуются с установленными структурами КПС. В совокупности структурно-генетические данные вносят существенный вклад в разработку отсутствующей до сих пор классификации штаммов ацинетобактера по К-антигенам. Для получения олигосахаридных фрагментов КПС, сохраняющих иммунодетерминантные группы - эпитопы, присутствующие в исходных КПС, использовали рецепторные белки бактериофагов, обладающие полисахарид-деполимеразной активностью. С этой целью генерировали рекомбинантные деполимеразы бактериофагов, специфичных к клинически значимым штаммам ацинетобактера типов (К19, K26, К27, К91 и K128). Расщепление этих КПС деполимеразами привело к необходимым олигосахаридам, соответствующим мономерам или олигомерам К-звеньев. Было найдено, что большинство деполимераз являются гликозидазами, расщепляющими КПС по гидролитическому механизму, и одна деполимераза является лиазой, использующей для расщепления механизм бета-элиминирования в уроновой кислоте. На основе полученных олигосахаридных фрагментов КПС синтезированы новые конъюгаты с бычьим сывороточным альбумином. Интактность олигосахаридных фрагментов КПС в составе конъюгатов подтверждена данными спектроскопии ЯМР. По данным масс-спектрометрии в одну молекулу каждого белка включилось от семи до девяти олигосахаридных фрагментов. Иммуногенность полученных ранее гликонъюгатов на основе димеров и тримеров К-звеньев КПС типа К9 из штамма A. baumannii B05 с БСА определяли на мышах линии BALB/c с использованием протокола, разработанного в первый год проекта. Проведена оценка уровня иммунного ответа на основании значения титров иммунных сывороток и определено относительное содержание суммарных иммуноглобулинов и IgM в сыворотках крови экспериментальных животных. Оценка опсонизирующей способности сывороток иммунизированных мышей по отношению к бактериям A. baumannii штамма В05 показала, что конъюгаты фрагментов КПС типа К9 с БСА вызывают длительный иммунный ответ (10 месяцев после последней иммунизации). При этом также стабильным сохранялся и титр опсонизации исследуемых сывороток. Высокий титр суммарных иммуноглобулинов по сравнению с титром IgM означал повышение содержания IgG в сыворотке крови, а, следовательно, и более высокий уровень иммунологической памяти. Увеличение количества инъекций до четырех повышало у мышей из этих групп относительное содержание суммарных иммуноглобулинов, не изменяя при этом содержание IgM в сыворотке крови. При этом примерно через 5 месяцев после последней иммунизации усредненные показатели сывороток этих животных практически полностью воспроизвели данные для экспериментальных групп с более длинным сроком иммунизации и большим количеством инъекций. Это открывает возможность в дальнейшем использовать селезенки и лимфоузлы животных, иммунизированных по такой схеме и таким коньюгатом, в качестве источника В-лифоцитов для получения моноклональных антител.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Ацинетобактер (Acinetobacter baumannii) является одним из наиболее клинически значимых патогенов, опасных для пациентов с ослабленной иммунной системой, особенно в условиях больниц, где эта бактерия проявляет себя как важнейший возбудитель тяжелых внутрибольничных инфекций (абсцессы, менингиты и пневмония и проч). Одним из факторов вирулентности ацинетобактера является капсульный полисахарид (КПС, К-антиген), образующий толстый защитный слой (капсулу) вокруг бактериальной клетки. Структуры КПС отличаются высоким разнообразием, и на их основе штаммы ацинетобактера разделяют сейчас, на 2021-ый год, на 140 К-типов. Высокая устойчивость ацинетобактера к антибиотикам делает актуальной разработку альтернативного подхода к лечению инфекций, такого как вакцинотерапия, основанная на протективном иммунном ответе организма хозяина против КПС бактерий. Данный проект направлен на комплексное исследование КПС ацинетобактера, включая изучение его строения и генетики биосинтеза как молекулярной основы для классификации штаммов ацинетобактера и разработку подходов к созданию вакцины против вызываемых ими инфекций на основе КПС различных типов и их олигосахаридных фрагментов. В рамках этапа 2021-го года (третий этап выполнения проекта) были исследованы КПС клинических изолятов ацинетобактера, относящиеся к K-ранее неисследованным типам (K26, K55, K74, K85, K86, K87, K92, K106, K112, K139 и K144). Методом ГЖХ-масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии установлен моносахаридный состав этих КПС, в которых идентифицированы как широко распространенные в природе моносахариды (глюкоза, галактоза, манноза, рамноза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, так и сахара, которые редко встречаются в полисахаридах (например, 6-дезокситалоза). В КПС типа K26 на одном из моносахаридов обнаружена О-ацетильная группа в необычном положении 4. Все 11 изученных КПС, относящиеся к различным типам, отличались уникальным строением, но некоторые из них имеют одинаковый или близкий моносахаридный состав и образуют группы полимеров с родственными структурами. Так КПС типа К112 и ранее изученный нами К83 имеют одинаковый моносахаридный состав и разветвленное пентасахаридное звено, но отличаются положением замещения остатка D-GlcNA боковым остатком Rha (4 и 3, соответственно). Гексасахаридное К-звено штамма K-26, включающее остаток 4-О-дезацетилированной 6dTal, имеет одинаковый трисахаридный фрагмент [-2)-b-D-Glcp-(1-3)-а-L-6dTalp-(1-3)-b-D-GlcpNAc-(1-] с КПС других четырех исследованных нами на этом и предыдущим этапах проекта штаммов ацинетобактера: К11, К83, K112 и К106. Повторяющееся К-звено штамма K55 являются не только самыми крупными повторяющимися звеном, найденными до сих пор у ацинетобактера, но и одними из наиболее крупных обнаруженных у бактериальных полисахаридов вообще. Все установленные структуры КПС ацинетобактера были включены в нашу электронную онлай-доступную постоянно пополняемую базу данных Bacterial CSDB (http://csdb.glycoscience.ru/bacterial/), включающую в настоящий момент 28634 углеводных соединений из 14806 организмов. В секвенированных генных кластерах биосинтеза изучаемых КПС найдены все гены, необходимые для синтеза КПС, в том числе гены синтеза нуклеотидных предшественников моносахаридных компонентов, гены гликозилтрансфераз и ацетилтрансферазы и гены процессинга: транслоказы для транспортировки К-звена, собранного на липидном носителе, через мембрану и полимеразы для полимеризации K-звена. Сравнением с последовательностями в базах данных выяснена специфичность всех трансфераз, включая инициирующую трансферазу, присоединяющую первый моносахарид К-звена к липидному носителю. По субстратной специфичности этой трансферазы установлена последовательность, в которой происходит присоединение моносахаридов в ходе сборки К-звена, и идентифицирована связь между К-звеньями, создаваемая в процессе полимеризации. Таким образом, генетические данные согласуются с установленными структурами КПС. В совокупности структурно-генетические данные вносят существенный вклад в разработку отсутствующей до сих пор классификации штаммов ацинетобактера по К-антигенам. Для получения олигосахаридных фрагментов КПС, сохраняющих иммунодетерминантные группы - эпитопы, присутствующие в исходных КПС, использовали рецепторные белки бактериофагов, обладающие полисахарид-деполимеразной активностью. На основе полученных олигосахаридных фрагментов КПС синтезированы новые конъюгаты с бычьим сывороточным альбумином. Интактность олигосахаридных фрагментов КПС в составе конъюгатов подтверждена данными спектроскопии ЯМР. По данным масс-спектрометрии в одну молекулу каждого белка включилось от семи до девяти олигосахаридных фрагментов. Лучшим уровнем и стабильностью по времени иммунного ответа обладал конъюгат из штамма A. baumanii K-9. Было показано, что даже после 18 месяцев после иммунизации сохраняется достаточно высокий титр антител в тех случаях, когда проводили иммунизацию иммунопрепаратами, которые содержали спейсер с квадратной кислотой. В целом при использовании гликоконъюгатов, полученных методом перйодатного окисления, уровень содержания KL-9-связывающих антител оказался ниже, чем при использовании гликоконъюгатов, полученных с использованием химии квадратной кислоты, что наблюдали в течение 18 месяцев измерения. Высокий титр суммарных иммуноглобулинов по сравнению с титром IgM означал повышение содержания IgG в сыворотке крови, а, следовательно, и более высокий уровень иммунологической памяти. Таким образом, было подтверждено, что коньюгаты фрагментов КПС ацинетобактера с БСА могут быть реально использованы в клинической практике для достижения долговременного (около 2-х лет) стабильного иммунитета к инфекции.