Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Проведение работ по получению водных суспензий наночастиц кремния с различными размерными фракциями от 20-50 нм, 50-100 нм до 100-200 нм, методом лазерной абляции кремниевых мишеней в воде и исследование полученных наночастиц комплексом физических методов, включая зондовую и просвечивающую электронную микроскопию, оптическую спектроскопию, динамическое и рамановское рассеяние света Наночастицы кремния различного диаметра получали методом лазерной абляции в деионизированной воде. Условия фокусировки излучения для получения определенной фракции частиц определяли экспериментально ввиду нелинейной природы взаимодействия фемтосекундных импульсов с водой. Расчет проводился измерением концентрации наночастиц кремния в полученных суспензиях. Также проанализированы разные конфигурации метода лазерной абляции: вертикальная и горизонтальная. Было установлено, что в случае горизонтальной конфигурации минимальная толщина слоя воды составляет 6 мм, а в случае вертикальной конфигурации – 10 мм. Для синтеза наночастиц кремния различного диаметра использовалась горизонтальная конфигурация лазерной абляции. Получение наночастиц с размерами 20-50 нм и 50-100 нм проводили методом лазерной фрагментации из порошка кремниевых частиц размером около 500 нм. Порошок получали помолом кремниевой пластины п-типа, легированной бором и удельной проводимостью 10 Ом*см. Для синтеза фракции с размером частиц 100-200 нм использовали метод лазерной абляции. Мишенью служила кремниевая пластина н-типа с удельной проводимостью 1-10 Ом*см. После получения суспензии наночастиц кремния дополнительно проводили лазерную фрагментацию. Концентрация наночастиц кремния в итоговой суспензии составила 0.1 мг/мл. Полученные фракции наночастиц характеризовали методами динамического рассеяния света и просвечивающей электронной микроскопией. Например, наночастицы фракции 20-50 нм имеют сферическую форму, полимодальное распределение по размерам с преобладанием частиц размером 27 нм. Подобные исследования были проведены и для фракций 50-100 нм и 100-200 нм. Также наночастицы кремния были исследованы методом комбинационного рассеяния. 2. Выполнение работ по получению водных суспензий наночастиц кремния со средними размерами в диапазонах 20-50 нм, 50-100 нм и 100-200 нм содержащих от 5 до 20% золота по массе, и исследование полученных наночастиц комплексом физических методов, включая зондовую и просвечивающую электронную микроскопию, оптическую спектроскопию, динамическое и рамановское рассеяние света Для получения композитных кремниево-золотых наночастиц применялось несколько различных стратегий лазерно-абляционного синтеза: абляция кремниевой мишени в коллоидном растворе золотых наночастиц, абляция золотой мишени в коллоидном растворе кремниевых наночастиц, ко-фрагментация смеси коллоидных растворов золотых и кремниевых наночастиц. Все стратегии основаны на двух-стадийном лазерно-абляционном синтезе. Первый шаг заключался в приготовлении моноэлементного (золотого либо кремниевого) коллоидного раствора наночастиц с последующей абляцией в приготовленном коллоидном растворе мишени альтернативного элемента (золотая мишень в кремниевом коллоиде и наоборот). Альтернативный подход заключался в перемешивании коллоидных растворов золота и кремния, полученных в первом шаге, с последующей лазерной фрагментацией полученной смеси. Золото-кремниевые композитные наночастицы были получены при абляции золотой мишени в коллоидном растворе кремниевых наночастиц. Для качественного определения химического состава синтезированных наночастиц были измерены их спектры характеристического рентгеновского излучения. На спектре присутствуют два ярко выраженных локальных максимума. Первый пик, расположенный около 1.74 кэВ соответствует Kα линии кремния, второй менее интенсивный и более широкий пик около 1.8 кэВ соответствует двум близко расположенным линиям Mα (2.12 кэВ) и Mβ (2.21 кэВ) золота. По отношению интенсивностей пиков кремния и золота можно сказать, что состав синтезированных наночастиц соответствует заявленному (5-20% золота по массе). Всего было синтезировано 3 различные фракции кремниево-золотых наночастиц: 20-50 нм; 50-100 нм; 100-200 нм. 3. Проведение работ по получению водных суспензий наночастиц кремния и кремния с примесью золота, поверхность которых покрыта биополимерами (полиэтиленгликоль, декстран), и экспериментальное исследовании их свойств методами динамического рассеяния света и оптической спектроскопии Поверхностная модификация наночастиц позволяет решить ряд проблем, таких как повышение коллоидной стабильности наночастиц, биосовместимости и биодоступности. В рамках проекта были разработаны протоколы по модификации наночастиц кремния с примесью золота, кремния и золота. В качестве модификаторов были выбраны такие биосовместимые полимеры, как полисахариды (декстран с молекулярной массой 70000, фирмы Sigma, декстрана сульфат натриевая соль с молекулярной массой 500000, фирмы Serva) и производное полиэтиленгликоля гидрированного касторового масла (Cremophor RH40) фирмы BASF. Наночастицы кремния с примесью золота, кремния и золота модифицировали декстраном. Модификацию наночастиц кремния и кремния с примесью золота проводили сульфатом декстрана. Модификация наночастиц кремния и кремния с примесью золота проводилась производным полиэтиленгликоля гидрированного касторового масла. Также была проведена модификация наночастиц кремния и кремния с примесью золота трехзамещенным цитратом натрия (фирмы Helicon). Модификацию цитратом натрия проводили с целью снижения агрегации наночастиц кремния и кремния с примесью золота за счет дополнительной стабилизации поверхности наночастиц цитрат-ионами. Были проведены исследования полученных водных суспензий модифицированных наночастиц методами динамического рассеяния света и оптической спектроскопии. При модификации полимерами происходит уширение молекулярно-массового распределения, однако в ряде случаев гидродинамический диаметр наночастиц снижается, что свидетельствует о снижении агрегации наночастиц. Модификация цитратом натрия, как мы и предполагали, способствует дополнительной стабилизации наночастиц и снижает склонность к аггрегации – гидродинамический диаметр всех наночастиц после модификации снижается, а число частиц в образце растет - о чем также свидетельствуют данные ACR – интенсивность сигнала (average count rate, kilo counts per second). УФ-видимые спектры поглощения показали, что положение полосы максимума поглощения золота не меняется, т.е. в результате модификации не происходит агрегации наночастиц, а прирост диаметра наночастиц после модификации полимерами обусловлен присутствием оболочки из полимера. 4. Проведение исследований по определению цитотоксических концентраций полученных наночастиц кремния и кремния с примесью золота на клетках фибробластов мыши 3T3 и раковых клеток HeLa и Hep2 в зависимости от их размеров и состава Анализ цитотоксичности методом бромистого тетразолия (МТТ-тест) Цитотоксичность наночастиц кремния (SiNP) и композита кремния с золотом (AuSiNP) анализировали на клеточных линиях при помощи МТТ-теста. Результаты показали, что в культурах как HepG2, 3T3, так и HeLa при концентрации SiNP 10-20 мкг/мл доля жизнеспособных клеток была сравнима или выше, чем в контроле. Для композита AuSiNP токсичность отсутствовала, имелся слабый эффект повышения жизнеспособности клеток. Индекс ингибирования не превышал 10-15%. Отсутствие токсичности на высоких концентрациях наночастиц может быть связано с интерференцией наночастиц с красителем МТТ. Анализ доли мертвых клеток методом проточной цитометрии Анализ окрашивания йодистым пропидием клеток HepG2 и HeLa после инкубации с наночастицами в течение 24 ч показал, что доля мертвых клеток HepG2 снижалась в широком диапазоне концентраций SiNP и AuSiNp. Жизнеспособность клеток HeLa снижалась на 2-5%. Различие между линиями HepG2 и HeLa состоит в разном уровне спонтанного апоптоза, составившего 12 и 6 % соответственно. В клетках с высоким уровнем спонтанной цитотоксичности наночастицы снижали гибель клеток, что может быть связано со снижением продукции активных форм кислорода (АФК), основного механизма гибели клеток. В клетках HeLa минимальный цитотоксический эффект также наблюдался при высокой концентрации наночастиц и несколько повышался в диапазоне средних и низких концентраций. Анализ продукции реактивных форм кислорода (АФК) Анализ показал, что оба типа композитов снижали продукцию АФК в широком диапазоне концентраций с максимумом при максимуме концентраций наночастиц. Снижение продукции АФК объясняет протективный эффект высоких доз наночастиц, но не объясняет появление незначительной (10-15%) токсичности средних концентраций (1-10 мкг/мл). Визуально в клетках регистрируется значительное количество наночастиц внутри клеток, что может интерферировать с гомеостазом клеток. Эндоцитоз наночастиц приводит к их накоплению в лизосомах и, возможно, в других органеллах и цитоплазме, что может сказываться на пролиферативной активности клеток. Анализ влияния наночастиц кремния и композита кремния с золотом на клеточный цикл Анализ показал, что в диапазоне 1-20 мкг/мл увеличивалась доля клеток в G2/M фазе, что соответствует торможению пролиферации и объясняет снижение количества клеток в культурах, определенное методом МТТ. Полученные данные показали, что наночастицы SiNP и AuSiNP оказывают несколько эффектов на клетки: дозозависимо снижают продукцию АФК; накапливаются внутри клеток, что интерферирует с метаболизмом клеток; замедляют пролиферацию клеток, что приводит к снижению количества жизнеспособных клеток, но не к их гибели. Данные по цитотоксичности для клеток линии 3Т3 совпадают с данными по клеткам HepG2. 5. Экспериментальное изучение закономерности проникновения, пространственной внутриклеточной локализации и последующей биодеградации полученных наночастиц кремния и кремния с примесью золота в клетках фибробластов мыши 3T3 на различных временных этапах инкубирования от 1 до 24 часов, методами ОЗНТ Инкубация клеток фибробластов мыши 3Т3 проводилась на различных временных этапах инкубирования с наночастицами в концентрации 20 мкг/мл - 6 и 24 ч. Подготовленные клетки были внедренны в эпоксидную смолу исследованы методом оптико-зондовой нанотомографии (ОЗНТ). Для проведения измерений были выполнено ультрамикротомирование каждого образца с толщиной производимого среза 70 нм. Непосредственно после выполнения срезов атомно-силовой микроскопией (АСМ) были получены изображения поверхности образцов. На полученных в режиме отображения фазы АСМ изображениях высокого разрешения можно выделить группы наночастиц в цитоплазме, локализованные в эндосомах. Размеры наблюдаемых наночастиц соответствуют исходным. Внутри клеточных ядер наночастицы не детектированы. На АСМ-изображениях образцов клеток с периодом инкубации 1 ч также можно выделить наночастицы или их аггрегаты, локализованные в эндосомах размерами 200-500 нм. Выполненные эксперименты не показали значимых различий внутриклеточной локализации наночастиц кремния и кремния с примесью золота на данных сроках инкубирования. 6. Проведение экспериментов по введению полученных наночастиц кремния и кремния с примесью золота введенных внутривенно и интратуморально лабораторным животным с привитыми опухолями (карцинома легких Льюс LLC и др.) с последующим взятием образцов опухолевой ткани для выявления 3D локализации наночастиц методом ОЗНТ Для проведения экспериментов по введению полученных наночастиц кремния различного состава использовали аденокарциному толстой кишки – штамм АКАТОЛ. Мышам-самцам линии BALB/c интратуморально вводили по 0.1 мл (14 мкг) коллоидного раствора аблированных кремниевых наночастиц. Или по 0.1 мл (14 мкг) коллоидного раствора аблированных кремниевых наночастиц, легированных золотом. После чего проводили эвтаназию и выделяли образец опухоли, который исследовали методами ОЗНТ. На полученных АСМ-изображениях выделяется значительно большее количество наночастиц, чем в случае исследования фибробластов 3Т3, что может быть связано с более высокой относительной концентрацией вводимого коллоидного раствора наночастиц, а также с их аккумуляцией в опухолевой ткани. Стоит отметить, что заметное количество наночастиц в данном случае наблюдалось на границе клеточных ядер. 7. Теоретический анализ гипертермических эффектов при воздействии переменного магнитного поля на наночастицы кремния с примесью оксида железа с массовой долей от 0 до 50% и средними размерами от 10 до 200 нм для нахождения оптимальных параметров наночастиц и условий реализации гипертермии в эксперименте Магнитная гипертермия –перспективный терапевтический метод, который может использоваться в сочетании с химиотерапией или лучевой терапией для лечения онкологических заболеваний. Наночастицы оксидов железа считаются наиболее подходящими для использования в биомедицине из-за биосовместимости оксидов железа и достаточно высокой намагниченности насыщения. С помощью численного моделирования рассчитаны низкочастотные петли гистерезиса и удельная мощность поглощения (УМП) наночастиц магнетита с кубической магнитной анизотропией. В расчетах учитывалось влияние термических флуктуаций магнитных моментов частиц при комнатной температуре, влияние сильного магнито-дипольного взаимодействия между наночастицами ансамбля. Обнаружено, что УМП ансамбля взаимодействующих наночастиц магнетита существенно зависит от среднего диаметра наночастиц. Кроме того, из-за влияния магнито- дипольного взаимодействия, УМП ансамбля резко зависит также от концентрации наночастиц в немагнитной матрице, то есть от среднего расстояния между наночастицами ансамбля. УМП ансамбля резко уменьшается при уменьшении среднего расстояния между наночастицами ансамбля. Для ансамблей сферических наночастиц магнетита выявлена существенная зависимость удельной поглощаемой мощности от диаметра наночастиц. Именно, для ансамбля наночастиц магнетита существует оптимальный, достаточно узкий интервал диаметров, в котором удельная поглощаемая мощность ансамбля максимальна. Этот интервал диаметров зависит от плотности ансамбля. Вне указанного оптимального интервала удельная поглощаемая мощность ансамбля резко уменьшается. Проведенные нами расчеты показывают, что при оптимальном выборе размеров наночастиц магнетита, и при оптимальном среднем расстоянии между наночастицами в кремниевой матрице, можно получить достаточно большие значения УМП, порядка 200-250 Вт/г, при характерной частоте f = 300 кГц и умеренной амплитуде магнитного поля, H0 = 100 Э. Использование умеренных значений амплитуды магнитного поля представляется важным, так как создание переменного магнитного поля большой амплитуды, H0 = 200-300 Э, требует генерации сильных переменных электрических токов, что является дорогостоящим и может быть опасным для применения в медицинской клинике.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Выполнение работ по получению водных суспензий композитных наночастиц на основе кремния с массовой долей оксида железа от 0 до 50% и различными размерными фракциями от 20-50 нм, 50-100 нм до 100-200 нм при помощи метода лазерной абляции твердотельных мишеней в воде или хлороформе и проведение исследование полученных наночастиц комплексом физических методов, включая зондовую и просвечивающую электронную микроскопию, оптическую спектроскопию, динамическое и рамановское рассеяние света, а также измерения магнитной восприимчивости. Суспензии композитных наночастиц на основе кремния и оксида железа были получены методом фемтосекундной лазерной абляции в ацетоне и воде. Для разделения полученных композитных наночастиц на три размерные фракции (фракция А: 100-200 нм, фракция Б: 50-100 нм, фракция В: 20-50 нм) и замены растворителя на воду (в случае абляции в ацетоне) был использован метод последовательного центрифугирования с использованием центрифуги Eppendorf 5427R. Морфологические свойства синтезированных композитных наночастиц определялись с помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа. Состав наночастиц определялся методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии. Гидродинамический размер измерялся методом динамического рассеяния света. Спектры оптической экстинкции измерялись на спектрофотометре PCI-MC 2. Энергодисперсионный рентгеновский анализ подтвердил, что в состав полученных наночастиц входят кремний, железо и кислород. Присутствие сигнала Ge на спектре обусловлено использованием германиевой подложки для фиксации наночастиц при измерении. Максимумы размерных распределений приходятся на диапазоны - фракция А: 125 нм, фракция Б: 55 нм, фракция В: 32 нм. Спектр оптической экстинкции в диапазоне 400 – 1100 нм показал монотонное спадание при увеличении длины волны. 2. Проведение работ по получению водных суспензий наночастиц кремния с примесью оксида железа, поверхность которых покрыта биополимерами (полиэтиленгликоль, декстран), и экспериментальное исследование их свойств методами динамического рассеяния света и оптической спектроскопии. С целью повышения коллоидной стабильности, биосовместимости и биодоступности наночастиц, были разработаны методики модификации поверхности биосовместимыми полимерами. Наночастицы кремния с примесью железа использовали двух фракций - до 50 нм и 50 -100 нм. Процедура модификации для обоих видов фракций была одинаковой. В качестве модификаторов были использованы такие полимеры, как полисахариды (карбоксиметилдекстран с молекулярной массой 500000), декстран с молекулярной массой 500000, производное полиэтиленгликоля гидрированного касторового масла, бычий сывороточный альбумин и лимонная кислота. Также была проведена модификация наночастиц кремния примесью железа трехзамещенным цитратом натрия. Модификацию цитратом натрия проводили с целью снижения агрегации наночастиц кремния с примесью железа за счет дополнительной стабилизации поверхности наночастиц цитрат-ионами. Были проведены исследования полученных водных суспензий модифицированных наночастиц кремния с примесью железа методами динамического рассеяния света. При модификации полимерами происходит уширение молекулярно-массового распределения наночастиц. Наночастицы, модифицированные карбоксиметилдекстраном и цитратом натрия, характеризовались наиболее узким распределением по размерам, в то время как модификация производным полиэтиленгликоля гидрированного касторового масла (Cremophor RH40) приводила к получению частиц с уширенным распределением по размерам, при этом присутствовали агрегаты. 3. Исследования по определению цитотоксических концентраций полученных наночастиц кремния с примесью оксида железа на клетках фибробластов мыши 3T3 и раковых клеток HeLa и Hep2. Для оценки токсичности нанообъектов используют тест на основе оценки активности клеточного дыхания с помощью красителя МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-Ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид]. Оценка токсичности проводится по индексу цитотоксичности, который подсчитывается как концентрация изучаемой субстанции, вызывающая 50% гибель клеток (IC50). Эксперименты по оценке токсичности наночастиц кремния-железа SiFeNP проведены на клетках фибробластов мыши 3T3 и раковых клетках HeLa и Hep2. Никакие из частиц не вызывали 50% гибели клеток в широком диапазоне концентраций, что обозначает отсутствие токсичности. Во всех случаях на низких концентрациях наблюдается стимуляция клеточного метаболизма, на больших концентрациях токсичность не достигала 50%. Эффект наночастиц различного размера варьировал незначительно. На клетках 3Т3 стимулирующий эффект был максимальным, а ингибирующий отсутствовал, что скорее объясняется различием в метаболизме эпителиальных и мезенхимальных клеток, чем эффектом на пролиферацию этих типов клеток. 4. Экспериментальное изучение закономерностей проникновения, пространственной внутриклеточной локализации и последующей биодеградации полученных наночастиц кремния с примесью железа в клетках фибробластов мыши 3T3 на различных временных этапах инкубирования от 1 до 24 часов, с использованием комплекса ОЗНТ. Предварительно синтезированные наночастицы SiFe исследовали атомно-силовой и магнитно-силовой микроскопией (АСМ и МСМ) с использованием комплекса ОЗНТ. МСМ изображения характеризуются малой контрастностью, что обусловлено довольно слабым взаимодействием магнитного зонда с наночастицами в связи с их слабыми магнитными свойствами. Для исследований использовали клетки фибробластов человека 3Т3. При высоких концентрациях наночастиц SiFeNP меняется морфология клеток (гранулярность и размер клеток), что означает эндоцитоз частиц. Внутриклеточная локализация наночастиц также подтверждается цветом клеток после центрифугирования и отмывки. Проведен анализ влияния наночастиц на продукцию активных форм кислорода (АФК), что коррелирует с попаданием наночастиц в митохондрии. Оба метода показали незначимую продукцию АФК под действием наночастиц SiFeNP. Для анализа функции лизосом использовали потенциал-зависимый краситель LyzoTrackerRed. Показали, что при больших концентрациях наночастиц потенциал лизосом значительно (на 20-60%) снижается и увеличивается при малых. Дополнительно провели анализ продукции АФК методом конфокального анализа. Показали, что за 4 ч нет продукция АФК в культуре с наночастицами соответствует базовому уровню контроля. Для анализа изменения метаболизма цитоплазмы клеток анализировали распределение тубулиновых и актиновых микротрубочек методом конфокальной микроскопии. Показали, что значительного влияния наночастиц на цитоскелет нет, что означает минимальное поступление наночастиц в цитоплазму. Клетки фибробластов мыши 3T3, инкубированные с SiFe НЧ в течение 6 и 24 часов, исследовали методом ОЗНТ. Обнаруженные НЧ расположены в клетке не единично, а образовали кластеры размерами до 450 нм (в случае 6-тичасовой инкубации). В случае клеток, инкубированных с НЧ в течение 24 часов, размеры отдельных кластеров достигали 0.9 мкм. Кластеры НЧ располагаются как в области ядер, так и на периферических участках клеток. Однако в случае инкубации клеток с НЧ в течение 24 ч. наблюдается значительно меньше кластеров в области ядер. Также заметно явное изменение морфологии клеток (гранулярность и размер клеток). 5. Выполнение экспериментов по введению полученных наночастиц кремния с примесью оксида железа введенных внутривенно и интратуморально лабораторным животным с привитыми опухолями (карцинома легких Льюс LLC и меланома В16) с последующим приложением постоянного магнитного поля и взятием образцов опухолевой ткани для выявления 3D локализации наночастиц методом ОЗНТ. Исследовались наночастицы (НЧ) кремния (Si), полученные фемтосекундной лазерной абляцией мишеней из смеси поликристаллического кремния и силицида кремния в ацетоне или в воде. Полученные данные электронной микроскопии и рентгеновской дифракции свидетельствовали о формировании НЧ Si с размерами нанокристаллов 10-100 нм. Измерения магнитных свойств полученных НЧ свидетельствует о значительном росте магнитной восприимчивости и появлении слабого магнитного гистерезиса в образцах, полученных лазерной абляцией в воде. Проведенные эксперименты in vivo продемонстрировали возможность МРТ мониторинга НЧ Si с примесью железа, введенных внутривенно лабораторным животным с привитыми опухолями. В то же время, заметного накопления НЧ при внутривенном введении и последующем приложении постоянного магнитного поля обнаружено не было. Для анализа распределения наночастиц в ткани опухоли мышам C57BL/6 перевивали опухолевые клетки меланомы мыши B16/F1. Для введения в опухоль В16 использовали наночастицы размером 55 нм. Для обоих случаев внутривенного и интратуморального введения НЧ характерно наличие крупных кластеров НЧ. Помимо кластеров НЧ, в клетках имеются отдельные магнитные НЧ. Причем локализуются они преимущественно в области ядер клеток, в отличие от кластеров, которые находятся в объеме клеток. 6. Проведение экспериментов по исследовании гипертермических эффектов при воздействии переменного магнитного поля на наночастицы кремния с примесью оксида железа с массовой долей от 0 до 50% и средними размерами от 10 до 200 нм для найденных в теоретическом анализе оптимальных параметров наночастиц и условий реализации гипертермии. Были синтезированы образцы суперпарамагнитных наночастиц состава FeSi2 методом абляции в водной среде и в ацетоне. Магнитная гипертермия обычно реализуется при помещении образца в переменное (частота 1-1000 кГц) магнитное поле, вызывающее отклик в суперпарамагнитных частицах. Были получены кривые намагниченности для порошков, полученных при высушивании данных коллоидов. Для исследования возможности использования наноночастиц как агентов для УВЧ гипертермии была создана установка на основе генератора “Медтеко” УВЧ-60. Установка включала в себя генератор УВЧ-60 с частотой генерации 27 МГц и выходной мощностью до 60 Вт, систему контроля на основе радиомодуля PL2303 + SI4463 (HC-12), систему тепловизионного контроля FlirC3, а также было разработано ПО для установки ВЧ гипертермии. Эксперимент по нагреву наночастиц проводился в двух вариантах геометрии – в каплях размером 200 мл на стеклянной подложке и в полистироловых кюветах объемом 3600 мкл. Было обнаружено, что наночастицы, полученные при абляции мишеней FeSi2, обладают относительно слабым нагревом при воздействии высокочастотного электромагнитного излучения (27 МГц). При больших объемах образцов удалось обнаружить нагрев, превышающий нагрев альбумина, что потенциально позволяет использовать наночастицы, полученные при абляции FeSi2, в качестве сенсибилизаторов для ВЧ гипертермии.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. In-vitro исследование эффективности фотогипертермии с использованием наночастиц кремния с примесью золота при воздействии лазерного излучения в полосе плазмонного поглощения и вне ее в области поглощения полупроводниковой матрицы. Экспериментальные результаты первого этапа проекта показали, что наночастицы (НЧ) кремния с примесью золота (Si-Au) нетоксичны. Однако в связи с довольно низкой стабильностью данных НЧ, в рамках проекта был разработан способ получения устойчивого водорастворимого комплекса Si-Au частиц с целью внедрения в клеточные культуры и опухоли для дальнейшей более эффективной гипертермии. Размер синтезированных Si-Au НЧ составляет 70-76 нм. Проведен анализ цитотоксиности синтезированных Si-Au НЧ. Цитотоксичность НЧ Si-Au анализировали методом МТТ-теста. Результаты цитотоксичности сравнимы с показателями для частиц, использованных на первом этапе проекта, и демонстрируют отсутствие цитотоксичности в широком диапазоне концентраций. Для проверки возможности использования частиц Si-Au в качестве агентов для фотогипертермии было проведено их облучение непрерывным лазерным излучением с длиной волны 808 нм и 532 нм. При облучении образцов наблюдался нагрев на 5-6 ⁰С за 9 минут, что является достаточным для проведения фотогипертермической обработки. 2. In-vitro исследование эффективности магнитной гипертермии с использованием наночастиц кремния с примесью оксида железа с контролем закономерностей проникновения и пространственной внутриклеточной локализации методами ОЗНТ. В результате осуществления лазерной абляции мишени SiFe2 в воде были получены стабильные суспензии композитных наночастиц на основе кремния и железа, обладающие магнитными свойствами. Средний размер НЧ составляет 65 нм. Были проведены эксперименты по исследованию гипертермических эффектов при воздействии высокочастотного электромагнитного поля (27 МГц) с мощностью 60 Вт на водные суспензии наночастиц кремния без примесей и кремния с оксидом железа и средними размерами 60 нм. В качестве сравнительного контроля использовали кремниевые НЧ размером 60 нм. Нагрев НЧ кремния с оксидом железа за две минуты составил 4⁰С. Полученные результаты указывают на потенциальные возможности НЧ кремния с оксидом железа как усилителей (сенсибилизаторов) гипертермии, вызванной воздействием высокочастотного электромагнитного поля. Для отработки эффективности режимов магнитной гипертермии провели исследования на клеточной линии фибробластов мыши 3T3, инкубированных с SiFe НЧ. Измерения методом ОЗНТ показали, что в случае воздействия ЭМП значительная часть магнитных НЧ распределена в клетках единично, тогда как в контрольном образце наблюдается кластеризация. В образцах после влияния ЭМП происходит заметное изменение морфологии клеток (увеличена гранулярность, размер). Такие изменения можно объяснить включением магнитных НЧ в клеточные структуры и органеллы, т.к. содержание НЧ в цитоплазме минимально, как было показано на втором этапе проекта. 3. In-vivo исследования эффективности фотогипертермии с использованием наночастиц кремния с примесью золота при воздействии лазерного излучения в полосе плазмонного поглощения и вне ее в области поглощения полупроводниковой матрицы. Исследования эффективности фотогипертермии с использованием НЧ Si-Au при воздействии лазерного излучения проводились на линии клеток фибробластов мыши 3Т3. Учитывая результаты in-vitro экспериментов для фотогипертермии использовали непрерывное лазерное излучение 808 нм. Нагрев образца клеток с НЧ составил 5.1 ℃ за 5 минут. Такми образом, эффектиность нагрева образца с НЧ выше на 37.8% в минуту по сравнению с контрольным образцом клеток без НЧ. Для подтверждения наличия НЧ в клетках (а не в культуральной среде, например) образцы клеток исследовали ОЗНТ. Поверхность срезов образца исследовалась АСМ в режиме фазового контраста для выявления НЧ Si-Au. Установлено присутствие НЧ в клетках. Предположительно НЧ локализованы в эндосомах, где они находятся как в форме небольших кластеров (около 150 нм), так и единично. 4. In-vivo исследования закономерностей проникновения, пространственной внутриклеточной локализации полученных наночастиц кремния с примесью золота после фотогипертермии опухолей. Для анализа локализации НЧ Si-Au в тканях опухоли использовали мышей C57BL/6. При достижении размера опухоли 200-400 мм3 (через 2 недели) мышам вводили интратуморально наночастицы с концентрацией 200 мкг/мл. Через два часа мышь фиксировали и опухоль направленно облучали лазером 808 нм в течение 15 минут. Образцы опухолей с НЧ исследовали АСМ в режиме фазового контраста для обнаружения НЧ Si-Au. На полученных АСМ изображениях выявлено значительно большее количество наночастиц Si-Au, чем в случае образцов клеток фибробластов 3Т3, что связано с более высокой относительной концентрацией вводимого коллоидного раствора наночастиц, а также с их аккумуляцией в опухолевой ткани, т.к. производилось только интратуморальное введение НЧ без применения внутривенного. АСМ исследование показало, что НЧ в клетках опухоли распределены неравномерно, наблюдается аккумуляция НЧ в области ядер клеток, но не в самих ядрах, а также в эндосомах. НЧ находятся в клетке как в виде кластеров (до 200 нм), так и единично и единичных НЧ значительно больше. 5. Отработка режимов реализации фотогипертермии с использованием наночастиц кремния с примесью золота при воздействии лазерного излучения в полосе плазмонного поглощения и в области поглощения полупроводниковой матрицы для достижения максимального терапевтического эффекта для моделей опухоли меланомы В-16 in-vivo. Для отработки оптимального режима реализации фотогипертермии проводили интратуморальное введение НЧ Si-Au в ткани опухоли мышам B16/F1. Фотогипертермия опухолей при облучении лазером 532 нм, как и ожидалось, не показала эффективного нагрева. Напротив, облучение опухолей с Si-Au НЧ лазером 808 нм показало эффективный нагрев опухоли на 4.8 ℃ в течение 15 минут – до 42.5 ℃ (при 150 Дж/см2) и до 42 ℃ (при 50 Дж/см2). Предполагая, что при данных температурах происходит гибель клеток, использование Si-Au НЧ с параметрами фотогипертермии: 808 нм, 50 Дж/см2, 15 мин – является наиболее оптимальным. В использовании режима: 808 нм, 150 Дж/см2, 15 мин нет необходимости, т.к. происходит нагревание ткани более более 42 ℃. После проведения экспериментов по подбору оптимального режима реализации фотогипертермии мышей забивали, забирали опухоли и фиксировали их в 4% растворе параформальдегида. Фрагменты опухолей затем фиксировали в эпоксидной смоле для дальнейших исследований методами ОЗНТ. 6. Отработка режимов реализации магнитной гипертермии с использованием наночастиц кремния с примесью оксида железа в экспериментах для достижения максимального терапевтического эффекта для моделей опухоли карциномы LLC in-vivo. Для отработки оптимального режима реализации магнитной гипертермии проводили интратуморальное введение НЧ Si-Au с концентрацией 200 мкг/мл мышам в ткани опухоли LLC. Подбор режима проводили с помощью генератора магнитного поля TOR MFG 02/14 с дополнительной опцией работы с лабораторными животными. Время воздействия магнитного поля составило в каждом случае 12.5 минут. Использовали четыре варианта воздействия переменного магнитного поля (15, 40, 70 и 100 мТл). Опухоли, на которые воздействовали полем 15, 40 и 70 мТл показали слабый отклик. При воздействии полем 100 мТл нагрев составил 3.2 ℃ за 12 м℃. Причем нагрев происходил неравномерно по времени, эффект гипертермии стал заметен только с 500 секунды эксперимента. Максимальная температура нагрева составила 41.9 ℃. Таким образом, положительный эффект магнитной гипертермии определен при параметрах: 100 мТл, 400 кГц. 7. Исследования 3D пространственной локализации наночастиц кремния с примесью золота и оксида железа после гипертермии опухолей методами ОЗНТ. Проведен анализ реконструированных 3D изображений фрагментов опухолей с наночастицами, введенными интратуморально, до и после фото/магнитной гипертермии. Опухоль В16 с Si-Au НЧ. До применения фотогипретермии клетки опухоли остаются оформленными (неповрежденными). Si-Au НЧ распределены в основном крупными кластерами. После применения фотогипретермии характерным показателем эффективности явилось очевидное разрушение клеток и клеточных структур. Si-Au НЧ распределяются небольшими кластерами и единичными НЧ, причем единичные НЧ преобладают в границах клетки. Кластеры НЧ значительно меньше по размерам по сравнению с контрольным образцом (до фотогипертермии) и тотальное количество НЧ в образце после фотогипертермии меньше, что говорит о их деградации, соответственно, подтверждается биодеградируемость Si-Au НЧ. Опухоль LLC с магнитными SiFe НЧ. Клетки опухоли до магнитной гипертермии не повреждены. Магнитные SiFe НЧ в основном распределены кластерами. После магнитной гипертермии значительная часть магнитных НЧ распределена в клетках единично, сами клетки имеют явно выраженные повреждения. Также, значительное уменьшение количества кластеров SiFe НЧ после магнитной гипертермии говорит о деградации данных НЧ. 8. Анализ полученных результатов и выработка рекомендаций для проведения доклинических испытаний исследованных наночастиц. Глобальной целью проекта была разработка новых наноматериалов, получаемых методами лазерного воздействия на вещество (лазерная абляция), метод, перспективный с точки зрения получения наночастиц высокой чистоты, с заданными свойствами для биомедицинских применений, в частности, для диагностики и терапии онкологических заболеваний. Были решены три принципиальные задачи в плане дальнейшего применения полученных наноматериалов в медицине:на клеточных моделях показано, что полученные наночастицы не токсичны, что открывает перспективу по разработке методов их введения в организм для доставки в новообразование; показано, что они способны накапливаться в опухолевых клетках. В частности, степень накопления НЧ, содержащих железо, может быть повышена приложением постоянного магнитного поля в области опухоли; показано, что внешние физические воздействия на области накопления разработанных наноматериалов вызывают гипертермический эффект, достаточный для воздействия на опухоль. - В частности, при использовании наночастиц, содержащих золото, это фотогипертермический эффект, обусловленный возбуждением плазмонов металле. Важно, что локальное повышение температуры может быть вызвано как воздействием лазерного излучения оптического диапазон (зеленый, 532 нм), так и ближнего ИК диапазона (808 нм). В первом случае открывается возможность воздействовать на поверхностные новообразования, во втором, использование окна прозрачности биологических тканей позволяет доставлять энергию облучения в более глубокие слои ткани при воздействии на полупроводниковую матрицу. - В случае использования наночастиц, содержащих железо, биологические ткани прозрачны для электромагнитного излучения радиочастотного диапазона. Здесь, на первый план выступает адресность доставки наночастиц и использование показанного в настоящем проекте эффекта накопления таких наночастиц в области приложения магнитного поля. В целом, результаты являются основой дальнейшего развития предложенных походов, разработанных методов синтеза и направленного воздействия на ткани в присутствии синтезированных наночастиц. Можно полагать, что результаты проекта дают все основания для развития этого направления. По-видимому, целесообразно продолжить эти разработки в рамках совместного проекта НИЯУ МИФИ и ИБХ РАН. В ИБХ РАН имеются все возможности работы с животными (Питомник лабораторных животных) и проведения доклинических испытаний (Отдел биологических испытаний ИБХ РАН).