Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью проекта было изучение возможностей повышения чувствительности опухолей к терапии воздействием на энергетические системы клеток. Поскольку энергетика клетки зависит как от гликолиза, так и от митохондриального окислительного фосфорилирования, воздействие на оба процесса может быть использовано для борьбы с опухолями. Стимуляция гликолиза в опухолевых клетках предполагает, что его ингибирование может быть эффективным в качестве стратегии для элиминации раковых клеток. С другой стороны, учитывая роль митохондрий в стимуляции апоптоза, можно предположить, что специфическое воздействие на эти органеллы с целью пермеабилизации внешней мембраны и стимуляции выхода про-апоптотических факторов, приведет либо к гибели раковой клетки, либо усилит действие традиционно применяемых противоопухолевых препаратов. Оценка относительного вклада гликолиза и окислительного фосфорилирования в содержание АТФ в клетках различной природы показала, что клетки, к примеру, нейробластомы SK-M-BE(2) в большей степени зависят от гликолиза, чем клетки карциномы кишечника НСТ116. Поддержание высокого уровня АТФ в клетках НСТ116 обработанных дезоксиглюкозой можно объяснить компенсаторным ответом митохондрий, поскольку одновременное воздействие дезоксиглюкозой и олигомицином, существенно снижает содержание АТФ Тем не менее, оценка клеточной гибели в этих клетках показывает, что гликолитический сдвиг (зависимость энергообеспечения от гликолиза) не является решающим фактором, определяющим резистентность опухолевых клеток к индукторам апоптоза. Высокая интенсивность гликолиза в опухолевых клетках объясняется не только повышенной экспрессией гексокиназы, но и ее транспортом и локализацией на митохондриальной мембране. Помимо более эффективного гликолиза, это делает митохондрии более устойчивыми к пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны. Связь гексокиназы с VDАC не позволяет про-апоптотическим белкам взаимодействовать с VDАC, что обычно приводит к образованию неспецифических пор и выходу про-апоптотических факторов. Как показала оценка цитозольной и митохондриальной фракций гексокиназы, стимуляция апоптоза вызывала увеличение доли гексокиназы связанной с митохондриальной мембраной, что, по всей вероятности, можно объяснить адаптивным ответом клетки в условиях индукции гибели. Поэтому препятствование этому процессу позволит сделать терапию более эффективной. Воздействовать на чувствительность опухолевой клетки к противоопухолевым препаратам можно не только подавляя гликолиз, но и окислительное фосфорилирование. Нами было обнаружено, что подавление энергетики митохондрий ингибитором митохондриальной АТФ синтазы олигомицином приводит к диаметрально противоположным последствиям в различных клеточных линиях. Так в клетках карциномы кишечника НСТ116, для которых характерна бóльшая зависимость от гликолитического снабжения АТФ, ингибирование митохондриальной продукции АТФ подавляла апоптоз, вызванный цисплатином, в клетках нейробластомы, Tet21N, олигомицин не влиял на интенсивность апоптоза. Однако в клетках нейробластомы SK-N-ВЕ(2), наблюдалась существенная стимуляция клеточной гибели вызываемая цисплатином, этопозидом, фактором некроза опухолей в комбинации с циклогексимидом. Более того, в клетках SK-N-ВЕ(2), олигомицин сам по себе был способен стимулировать клеточную гибель, что сопровождалось активацией митохондриального пути апоптоза – процессингом каспазы-2, расщеплением про-апоптотического белка Bid и выходом цитохрома с из митохондрий. Было исследовано, в какой степени традиционно применяемые терапевтические средства способны воздействовать непосредственно на митохондрии и каковы последствия этого взаимодействия. Оценка показала, что из всех исследуемых терапевтических средств только этопозид вызывает практически мгновенное (в течение 1-2 минут ингибирование потребление кислорода. Это приводит к продукции активных форм кислорода (АФК) и стимуляции апоптоза в первые часы после добавки этопозида. Клеточная гибель существенно возрастает в условиях депривации глутамина, либо подавления синтеза глутатиона. Полученные данные продемонстрировали важную роль антиоксидантного статуса клетки. Это позволяет предположить, что успех противоопухолевой терапии будет определяться сочетанным воздействием противоопухолевых препаратов и подавлением защитных антиоксидантных систем клетки. Ранее нами было показано, что дезоксиглюкоза, используемая для подавления гликолиза, ингибирует N-гликозилирование, что вызывает стресс ЭР. В зависимости от типа клеток, это может привести как к апоптозу, так и к аутофагии. Используя в дополнение к дезоксиглюкозе иные индукторы стресса ЭР, тапсигаргин и туникамицин, мы с использованием клеток карциномы кишечника дикого типа и с нокаутом по р53, показали, что несмотря на подавление апоптоза, вызванного цисплатином при нокауте р53, степень активации ЭР не изменяется. Стимуляция ЭР стресса тапсигаргином, не влияла на апоптоз, вызванный этопозидом, тогда как при замене тапсигаргина на дезоксиглюкозу наблюдалось подавление клеточной гибели. Ингибиторы комплексов дыхательной цепи, в частности, ингибитор комплекса II теноилтрифторацетон, ТТФА), существенно стимулируют клеточную гибель, вызванную как цисплатином, так и этопозидом. Поскольку развитие опухоли зачастую происходит при пониженном содержании кислорода, аналогичные опыты были поставлены в гипоксических условиях. Гипоксия вызывала подавление апоптоза во всех исследованных клеточных линиях, а стимуляция гибели клеток при совместном действии ТТФА и цисплатина была незначительной. Подавление апоптоза коррелировало со снижением образования АФК, а антиоксидант N-ацетилцистеин подавлял апоптоз вызванный сочетанным действием цисплатина и ТТФА в условиях нормоксии. Другим фактором, определяющим резистентность опухолевых клеток к апоптозу в гипоксии, является снижение содержания транскрипционного фактора р53. На модели гипоксии в присутствии хелатора железа дефероксамина было показано, что инкубация с дефероксамином снижает содержание р53, а также его мишеней про-апоптотических белков Bid и Puma, участвующих в пермеабилизации внешней митохондриальной мембране. В клетках с нокаутом по р53, несмотря на накопление фактора, индуцированного гипоксией (hypoxia inducible factor, HIF), появления про-апоптотических белков не наблюдалось, а апоптоз снижался.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью исследования, обозначенной в проекте, является поиск возможностей повышения эффективности противоопухолевых препаратов. Митохондрии являются не только энергетическими станциями клетки, но и принимают активное участие в реализации различных форм клеточной гибели. В частности, пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны и последующий выход про-апоптотических факторов из митохондрий является пусковым механизмом апоптоза. Это широко используется в противоопухолевой терапии с применением соединений, способных вызывать апоптоз в опухолевых клетках, воздействуя на митохондрии. Митохондрии не только способны определять тип гибели клетки, но и могут координировать взаимосвязь между механизмами гибели и выживания. Так, стимуляция механизмов контроля качества митохондриальной популяции может привести к удалению из популяции митохондрий органелл, способных стимулировать гибель клеток, что приведет к снижению эффективности противоопухолевой терапии (1). Вклад митохондрии в энергетику опухолевых клетках не столь велик, как в клетках нормальных тканей. Тем не менее, воздействие на дыхательную цепь митохондрий способно инициировать паталогические процесс, приводящие к дестабилизации органелл и стимуляции митохондриального пути в апоптозе. Исследуя возможности стимуляции апоптоза в результате таргетирования митохондрий мы показали, что в ряде клеточных линий не только воздействия на дыхательную цепь, но и на митохондриальную АТФ синтазу способно повысить эффективность противоопухолевого препарата. Так ингибирование олигомицином митохондриальной АТФ синтазы стимулировало апоптоз в клетках нейробластомы SK-N-BE(2), но не в клетках нейробластомы Tet21N. Как было показано нами ранее, обработка клеток SK-N-BE(2) олигомицином приводит к стимуляции пути опосредованного каспазой-2, что в конечном итоге вызывает пермеабилизацию внешней митохондриальной мембраны и выход цитохрома с. Однако, это не объясняет отсутствие эффекта олигомицина в клетках Tet21N. Так, обработка олигомицином стимулировала образование активных форм кислорода (АФК), способных вызвать повреждение митохондрий, однако накопление АФК происходило в обеих клеточных линиях. Использование ингибитора транспорта адениновых нуклеотидов, что также подавляет продукцию АТФ митохондриями, не вызывало сколь либо существенной стимуляции апоптоза, индуцированного цисплатином или этопозидом. Ингибитор дыхательной цепи антимицин стимулировал апоптоз, однако механизм стимуляции отличался от стимуляции олигомицином. Так антиоксидант N-ацетил цистеин подавлял апоптоз, вызванный антимицином, но был неэффективен в случае использования олигомицина. Действие олигомицина обращалось ингибитором каспаз – Z-VAD.fmk. Ранее нами было показана тесная связь между процессами аутофагии и апоптоза, когда стимуляция аутофагии подавляла апоптоз и наоборот (2). Более того, стимуляция аутофагии, направленной на митохондрии – митофагия, способна подавить апоптоз, удаляя поврежденные митохондрии. Исследование процессов, способных влиять на гибель клеток, показало, что клетки Tet21N обладают эффективной системой аутофагии. Так, бафиломицин, мощный ингибитор клеточной аутофагии вызывал накопление липидированной формы маркера аутофагосом LC3, чего не наблюдалось в клетках SK-N-BE(2). Зачастую индукция стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР) способна подавлять апоптоз (3). Для проверки предположения, не вовлечен ли ЭР стресс в индукцию апоптоза, была проведена оценка одного из маркеров ЭР стресса – шаперона GRP78/BiP. Как оказалось, содержание этого шаперона в клетках SK-N-BE(2) снижается с возрастанием концентрации олигомицина, тогда как в клетках Tet21N его содержание не меняется. Более того, в количественном отношении, содержание GRP78/BiP в клетках Tet21N существенно выше. Можно предположить, что апоптоз, индуцируемый олигомицином и стресс ЭР связаны между собой. Таким образом, учитывая полученные данные о механизмах и процессах протекающих в клетках под действием олигомицина, можно предположить, что процессы, регулирующие стресс ЭР и аутофагию тесно связаны со стимуляцией апоптоз, и, воздействуя на них можно модулировать гибель клеток, вызванную противоопухолевыми препаратами. Рост опухолей часто происходит в условиях гипоксии, которая является мощным фактором устойчивости раковых клеток к терапии. Для выяснения механизмов устойчивости нами было исследована стимуляция гибели различных опухолевых клеток в условиях нормоксии и гипоксии. В качества индуктора апоптоза использовали широко применяемый препарат цисплатин, в сочетании с ингибитором комплекса III дыхательной цепи митохондрий теноилтрифторацетоном (ТТФА). Как было показано нами ранее, такое сочетание позволяет существенно снизить концентрации препарата. В условиях гипоксии наблюдается снижение клеточной гибели, вызванной цисплатином, и отсутствует стимулирующий эффект ТТФА. Тем не менее, ТТФА и в гипоксических и в нормоксических условиях стимулирует появление фосфорилированной (активной) формы фермента Drp1, принимающего участие во фрагментации митохондриальной сети – необходимого шага индукции митофагии. Оценка содержания маркера аутофагосом показало увеличение их содержания под действием ТТФА в гипоксических условиях. Причем, если под действием бафиломицина лишь небольшая часть аутофагосом была ко-локализована с митохондриями, то в случае гипоксии белок LC3 продемонстрировал, в основном митохондриальную локализацию, что можно рассматривать как стимуляцию митофагии, вызванную сочетанным действием цисплатина и ТТФА. Митофагия может быть зависима как от тандема PINK1/Parkin, так от присутствия специфических рецепторов (рецептор-зависимая митофагия). В наших условия появление PINK1 мы наблюдали лишь после сброса мембранного потенциала митохондрий протонофором CCCP. Кроме того, накопление LC3 наблюдалось и в клетках немелкоклеточного рака легкого U1810, лишенных ключевого фермента аутофагии Atg13. Стабилизация фактора, индуцированного гипоксией (Hypoxia inducible factor 1, HIF1) ведет к появлению в клетках белка BNIP3, принимающего участие как в апоптозе, так и в митофагии. Для выявления роли BNIP3 в митофагии в условиях гипоксии, были использованы клетки карциномы легкого А549 с нокаутом по этому белку. Оказалось, что нокаут по BNIP3 не предотвращает митофагию и, тем самым, гибель клеток не усиливается. На первый взгляд, это поставило под сомнение важность BNIP3 в митофагии, однако выяснилось, что при нокауте BNIP3, гипоксия стимулирует образование димеров родственного белка BNIP3L/Nix (60 kDa), которые компенсируют отсутствие BNIP3. Причем их образование происходит исключительно в условиях гипоксии, что обеспечивает протекание митофагии. Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что в условиях гипоксии стимуляция экспрессии BNIP3 и BNIP3L/NIX может предотвращать гибель опухолевых клеток, запуская процесс митофагии. Наше исследование показало, что противораковые стратегии следует выбирать с осторожностью, чтобы предотвратить стимуляцию путей выживания раковых клеток. Литература 1. Abdrakhmanov A, Kulikov AV, Luchkina EA, Zhivotovsky B, Gogvadze V. Involvement of mitophagy in cisplatin-induced cell death regulation. Biol Chem. 2019;400:161-170. 2. Sorokina IV, Denisenko TV, Imreh G, Tyurin-Kuzmin PA, Kaminskyy VO, Gogvadze V, Zhivotovsky B. Involvement of autophagy in the outcome of mitotic catastrophe. Sci Rep. 2017;7:14571. 3 Maximchik P, Abdrakhmanov A, Inozemtseva E, Tyurin-Kuzmin PA, Zhivotovsky B, Gogvadze V. 2-Deoxy-D-glucose has distinct and cell line-specific effects on the survival of different cancer cells upon antitumor drug treatment. FEBS J. 2018;285:4590-4601.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году нами были продолжены работы по исследованию влияния ингибиторов митохондриальной энергетики на гибель клеток, вызванную противоопухолевыми препаратами. Как было показано ранее, клетки нейробластомы Tet21N и SK-N-BE(2) по-разному отвечают на действие ингибитора митохондриальной АТФазы – олигомицина. Клетки SK-N-BE(2) отвечают индукцией апоптоза в ответ на действие возрастающих концентраций олигомицина, тогда как клетки Tet21N устойчивы к данному препаратуВ клетках SK-N-BE(2) олигомицин сам по себе индуцировал апоптоз, а также стимулировал апоптоз, вызванный цисплатином, чего не наблюдалось в клетках Tet21N. В случае использования этопозида в качестве индуктора апоптоза, наблюдалась аналогичная стимуляция. Использование атрактилозида вместо олигомицина не только не стимулировало гибель клеток, но и несколько подавляла апоптоз в клетках Tet21N, вызванный как цисплатином, так и этопозидом. Известно, что в митохондриях ингибирующее действие олигомицина опосредовано белком OSCP (oligomycin sensitivity conferring protein). Для выяснения вопроса не связана ли различная чувствительность клеток SK-N-BE(2) и Tet21N к олигомицину с содержанием этого белка, была проведена оценка уровня OSCP в используемых клетках. Как оказалось, содержание белка OSCP практически не отличается в клетках SK-N-BE(2) и Tet21N, более того, в процессе инкубации клеток с возрастающими концентрациями олигомицина его уровень практически не изменяется. В дополнение была проведена оценка содержания классического рецептора аутофагии р62. Как выяснилось, его содержание в клетках Tet21N существенно выше, однако оно не менялось в ответ на возрастающие концентрации олигомицина. В другой серии экспериментов для выяснения роли аутофагии в резистентности клеток SK-N-BE(2) и Tet21N к, воздействию олигомицина эксперименты проводили в присутствии активатора аутофагии рапамицина а ингибитора завершающей стадии аутофагии бафиломицина. Рапамицин не влиял на апоптоз, вызванный олигомицином в клетках SK-N-BE(2). Исходное содержание белка р62 в клетках Tet21N было несколько выше чем в клетках SK-N-BE(2), и повышалось только в присутствии бафиломицина. Учитывая взаимосвязь апоптоза, аутофагии и стресса ЭР, была проведена одновременная оценка параметров, характеризующих эти процессы, в условиях модуляции апоптоза, вызванного цисплатином, ингибитором ATP синтазы олигомицином. В качестве параметра аутофагии производилась оценка маркера, белка LC3, липидированная форма которого LC3-II служит маркером аутофагосом, в качестве параметра апоптоза – фрагмент PARP, а стресса ЭР – шаперон GRP7/BIP. В присутствии олигомицина в клетках SK-N-BE(2) увеличивается содержание LC3-I, однако при этом его липидирование происходит не столь интенсивно как в клетках TET21N. Сопоставляя данные по LC3 с данными по р62 можно заключить, что в целом процесс аутофагии (autophagic flux) в клетках TET21N проистекает интенсивнее чем в клетках SK-N-BE(2). Учитывая, что аутофагия (в частности одна из ее форм, митофагия) способна сдерживать апоптоз, можно, по-видимому, объяснить различие в ответах на олигомицин в клетках SK-N-BE(2) и TET21N тем, что олигомицин стимулирует аутофагию в клетках TET21N в большей степени нежели в клетках SK-N-BE(2), сдвигая баланс апоптоз/аутофагия в сторону аутофагии, тогда как в клетках SK-N-BE(2) его воздействие завершается апоптозом. Как было показано нами в предыдущих отчетах, одним из факторов, сдерживающих апоптоз в гипоксических условиях служит митофагия, осуществляемая в результате стимуляции экспрессии белка BNIP3, а в его отсутствии BNIP3L. Для подтверждения роли BNIP3 и BNIP3L в защите клеток от апоптоза в условиях гипоксии с помощью CRISPR-Cas9 был проведен нокаут гена, кодирующего BNIP3L в клетках с нокаутом BNIP3, и отобраны клоны с минимальным содержание этого белка. Апоптоз инициировали цисплатином в присутствии или отсутствии ТТФА в клетках дикого типа, с нокаутом BNIP3 и с двойным нокаутом BNIP3 и BNIP3L. Оценку апоптоза проводили по расщеплению PARP. Нокаут белков BNIP3 и BNIP3L значительно усиливал гибель клеток в гипоксических условиях (отношение отщепленного фрагмента к полноразмерному белку (PARP cleaved/full) возрастало. Таким образом, можно сделать вывод, что устойчивость клеток к противоопухолевым препаратам объясняется стимуляцией рецептор-зависимой митофагии, опосредованной белками BNIP3 и BNIP3L. Однако в случае двойного нокаута BNIP3 и BNIP3L, ингибирующее действие гипоксии на апоптоз хоть и снижалось значительно, но не устранялось полностью. По всей вероятности, стимуляция митофагии является лишь одним из факторов, определяющих устойчивость клеток к индукции гибели. Процесс митофагии определяется различными факторами, в частности степенью фрагментации митохондрий, который протекает по-разному в различных опухолевых клетках. Исходя из этого, в последующих экспериментах нами была проведена оценка фрагментации митохондрий в клетках Tet21N и SK-N-BE(2), вызванная как гипоксическими условиями так и действием ТТФА. Оценку проводили как в условиях нормоксии, так и гипоксии. В контрольных клетках Тет21N в условиях нормоксии митохондрии представляют собой нитчатые структуры. Такая же структура сохраняется и при действии ТТФА, а также в условиях гипоксии. И лишь при действии ТТФА в гипоксических условиях четко видна фрагментация органелл. В отличие от клеток Тет21N, в клетках SK-N-BE(2) добавка ТТФА приводит к фрагментации и в нормоксических условиях. Точно также митохондрии фрагментируются в условиях гипоксии как в отсутствие, так и в присутствии ТТФА. Степень фрагментации митохондрий коррелирует с содержанием белка-фермента, ответственного за фрагментацию митохондрий pDRP, что было продемонстрировано нами ранее (см отчет 2020 года). Важным фактором, способным инициировать апоптоз являются активные формы кислорода. В условиях гипоксии образование АФК в ответ на действие ТТФА, цисплатина и при их совместном применении в клетках SK-N-BE(2) существенно подавлена. Наибольший вклад в производство АФК вносит ТТФА, что позволяет в значительной мере стимулировать апоптоз, вызываемый умеренными дозами цисплатина. Для выяснения вопроса, какие еще факторы могут быть вовлечены в формирование устойчивости опухолевых клеток к противораковым препаратам в условиях гипоксии, оценивали ключевые параметры таких процессов как стресс ЭР и аутофагия. Обработка клеток цисплатином, ТТФА а также сочетание этих соединений, стимулирует не только апоптоз, но и стресс ЭР. В условиях гипоксии наблюдается снижение не только апоптоза, но стресса ЭР, оцениваемое по уровню щаперона Bip/Grp78. Интересно, что в условиях гипоксии снижается и уровень белка CHOP, индуцируемого стрессом ЭР и вызывающим апоптоз. Сопоставление этих изменений позволяет предположить, что апоптоза, в клетках Тет21N в значительной степени обусловлен индукцией стресса ЭР, тогда как в клетках SK-N-BE(2) вклад стресса ЭР незначителен. В условиях гипоксии аутофагия несколько стимулируется, что не удивительно, учитывая ее вклад в сдерживание апоптоза. Содержание транскрипционного фактора p21 экспрессия которого может быть как зависима, так и независима от другого фактора р53, увеличивается в ответ на добавку цисплатина, но не ТТФА. Интересно, при совместном использовании ТТФА и цисплатина, экспрессия р21 снижается. Учитывая, что р21 не только способен блокировать клеточных цикл, но и подавлять апоптоз, снижение его содержания в условиях сочетанного действия ТТФА и цисплатина может объяснить стимуляцию апоптоза. В условиях гипоксии происходит некоторое снижение содержания р21, но, тем не менее оно остается выше контрольного уровня. Ключевым событием, определяющим стимуляцию апоптоза служит пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны, что позволяет про-апоптотическим факторам выйти из митохондрий и стимулировать митохондриальный путь апоптоза. Для выявления роли белков семейства Bcl-2 в подавлении апоптоза в условиях гипоксии была проведена оценка клеточной гибели как в условиях нормоксии, так и гипоксии. Чтобы убедиться, что гибель клеток в наших экспериментах была апоптозом, были оценены несколько параметров этой формы гибели клеток. Индукция апоптоза приводит к появлению клеток с содержанием ДНК ниже 2n, так называемой субпопуляции SubG1. В клетках HCT116 ДФО слегка стимулировал апоптоз, оцениваемый по этому параметру, но при этом снижал количество клеток во фракции SubG1, обработанных доксорубицином или цисплатином. Важным маркером апоптоза является проницаемость внешней митохондриальной мембраны и последующее высвобождение цитохрома с из митохондрий. Фракционирование клеток, обработанных ДФО, выявило присутствие цитохрома с в цитозоле. Сам по себе ДФО не стимулировал выход цитохрома с из митохондрий, но значительно подавлял высвобождение этого белка, стимулируемое доксорубицином. Выход цитохрома с из митохондрий способствует образованию апоптосомы, что запускает каскад каспаз, завершающийся активацией каспазы-3. Аналогично выходу цитохрома с, ДФО подавлял процессинг каспазы-3, стимулируемый доксорубицином. Высвобождение цитохрома с опосредуется балансом про- и антиапоптотических белков. Следующим этапом исследования была оценка уровня этих белков при комбинированном воздействии ДФО и цисплатина или доксорубицина. Уровень антиапоптотического белка Bcl-2 не изменялся в присутствии ДФО, доксорубицина, цисплатина или их комбинацией. Напротив, уровень проапоптотических белков Bax, Bid и Puma в апоптотических клетках снижался после обработки ДФО. Оценка отношения Bax/Bcl2, важный показатель апоптоза, выявила его снижение в присутствии ДФО. Одним из основных регуляторов гибели клеток является фактор транскрипции p53, который контролирует экспрессию нескольких проапоптотических белков, таких как Bid, Bax, Puma и Noxa, регулируя тем самым проницаемость внешней митохондриальной мембраны. Повреждение ДНК, вызванное доксорубицином или цисплатином, стабилизировало p53 и увеличивало его уровень в клетке. Совместная обработка с ДФО обращала индуцированную доксорубицином или цисплатином стабилизацию р53 и, как результат, уменьшала количество проапоптотических белков. Таким образом, подавление апоптоза в условиях, имитирующих гипоксию, может быть следствием снижения экспрессии p53 и, в результате, уровня проапоптотических белков, участвующих в пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны. Далее была проведена оценка влияние низкой концентрации кислорода (вместо ДФО) на апоптоз. Клетки HCT116 помещали в гипоксический инкубатор при 0,1% O2 на 24 часа, обрабатывали 100 мкМ доксорубицином или 20 мкг/мл цисплатина, и спустя сутки проводили оценку апоптоза. Гипоксия подавляла апоптоз, оцениваемый по расщеплению PARP, снижала содержание p53 и проапоптотического белка Puma. Аналогичные результаты были получены с использованием клеток аденокарциномы A549. В условиях гипоксии индуцированная цисплатином и доксорубицином стабилизация р53 подавлялась. Как следствие, апоптоз, оцениваемый по расщеплению PARP, также снижался. Чтобы удостовериться в ведущей роли p53 в регуляции апоптотического ответа, эксперименты были продолжены с клетками HCT116, лишенными p53 (p53-/-). Оценка апоптоза, вызванного цисплатином, в этих клетках показала, что нокаут р53 повышает их устойчивость к цисплатину. Апоптоз анализировали по появлению фосфатидилсерина на плазматической мембране после окрашивания йодидом пропидия (PI) и аннексином V. Как показала оценка, в клетках с нокаутом р53 содержание про-апоптотических белков существенно снижалась.