КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-14-00115

НазваниеМетоды ЯМР в молекулярной фармакологии и фармакометаболомике

РуководительПольшаков Владимир Иванович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021  , продлен на 2022 - 2023. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаСпектроскопия ЯМР, структура и динамика белка в растворе, взаимодействие белок-лиганд, ЯМР скрининг, метаболомика, теломераза, пирофосфатаза, формиатдегидрогеназа, витамины

Код ГРНТИ34.15.63


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект нацелен на решение задач молекулярной фармакологии и фармакометаболомики методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Планируется исследовать строение, динамические и функциональные свойства трех фармакологически важных ферментов – потенциальных мишеней действия лекарственных препаратов, выполнить методами ЯМР скрининг ингибиторов двух мишеней – неорганической пирофосфатазы из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPаза) и формиатдегидрогеназы Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ), а также произвести поиск метаболитов в биологических жидкостях добровольцев, имеющих различный уровень потребления витаминов с целью определения биомаркеров витаминного статуса человека. Общей связующей целью проекта является разработка наиболее эффективных методик применения спектроскопии ЯМР для решения поставленных задач. В ходе выполнения проекта планируется исследовать функциональные свойства белка Est3 – компонента теломеразы термофильных дрожжей Hansenula polymorpha. Планируется также получить информацию о строении в растворе, функциональных и динамических свойствах крупных по меркам возможностей методов ЯМР белков - Mt-PPазы (116 кДа) и Sa-ФДГ (84 кДа). Будут измерены многомерные спектры ЯМР этих белков, обогащенных изотопами 15N, 13C и 2D, на основании которых будет получена информация об отнесении сигналов аминокислотных остатков этих белков. Оба этих фермента являются перспективными фармакологическими мишенями, которые могут быть использованы для поиска потенциальных антибактериальных препаратов. Планируется провести поиск ингибиторов этих ферментов методами ЯМР скрининга. Для скрининга будут отобраны соединения из коммерчески доступных библиотек химических соединений. Критериями отбора будут результаты докинга низкомолекулярных соединений в кристаллические структуры этих белков и их физико-химические свойства. Поиск и дизайн соединений-лидеров будет проведен с использованием современных методик ЯМР, включая SAR-by-NMR, используемый для дизайна молекулы из двух и более структурных фрагментов. Найденные ингибиторы ферментов Mt-PPазы и Sa-ФДГ будут использованы для финальной оптимизации их структуры методами медицинской химии и проведения углубленных доклинических исследований. Планируется, что найденные ингибиторы Mt-PPазы могут быть использованы в качестве противотуберкулезных средств, а ингибиторы Sa-ФДГ могут применяться для инактивации колоний высоко патогенных бактерий Staphylococcus aureus в виде биопленок. В рамках данного проекта планируется также исследование методом спектроскопии ЯМР метаболомных профилей здоровых лиц молодого возраста до и после монотерапии витаминами. В работе планируется исследовать влияние перорального приема витаминов С, В1, В6, В9, В12 и Д на метаболитный состав мочи, сыворотки и плазмы крови. Назначение моновитаминных препаратов необходимо для разработки методологии метаболомного типирования и идентификации метаболитов – маркеров биологической активности и/или витаминного статуса человека. Актуальность исследования обусловлена, как характером конкретных научных задач, которые планируется решить в рамках данного проекта, так и необходимостью разработки современных эффективных технологий применения спектроскопии ЯМР в молекулярной фармакологии и фармакометаболомике. Если говорить о конкретных научных задачах, то поиск новых антибактериальных препаратов (в том числе противотуберкулезных) является чрезвычайно важной задачей. Не менее важным и актуальным представляется и разработка методов персонализированной медицины. Так, в данном проекте планируется создать методы диагностики витаминного статуса человека, основанные на анализе спектров ЯМР биологических жидкостей. Предполагается, что разработанные методы позволят давать обоснованные рекомендации по приему витаминов. Все предложенные исследования являются новыми и в своей совокупности не имеют аналогов в мире. Планируется публикация полученных результатов преимущественно в журналах первого квартиля списка Web of Science.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены новые данные о строении и механизме действия трех фармакологически важных ферментов – теломеразы термофильных дрожжей Hansenula polymorpha, неорганической пирофосфатазы из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPаза) и формиатдегидрогеназы золотистого стафилококка Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ). Используя рациональные методы дизайна биологически активных соединений планируется создание ингибиторов Mt-PPазы и Sa-ФДГ, которые потенциально могут быть использованы в качестве антибактериальных препаратов для лечения туберкулеза и борьбы с колониями стафилококка в виде биопленок. Запланированным результатом изучения изменения метаболомного профиля человека в зависимости от уровня приема отдельных витаминов (С, В1, В6, В9, В12 и Д) является идентификация метаболитов – маркеров биологической активности и/или витаминного статуса. Метаболиты-маркеры активности витаминов могут быть далее использованы для разработки новых методов диагностики витамин-дефицитных состояний человека и их коррекции. В ходе выполнения проекта будут созданы эффективные экспериментальные методы и/или программное обеспечение для применения спектроскопии ЯМР в молекулярной фармакологии и фармакометаболомике. Запланированные результаты соответствуют уровню работ ведущих мировых научных центров и имеют высокую научную значимость. Цели проекта полностью соответствуют направлению Стратегии научно-технологического развития РФ «Переход к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счет рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных)». Это относится, как к поиску новых антибактериальных средств, так и к развитию высокотехнологических методов ЯМР метаболомики для решения задач персонализированной медицины. Ожидаемые результаты проекта имеют не только очевидные возможности их практического применения в медицине, но и высокий фундаментальный уровень. Результаты исследования планируется публиковать в ведущих международных высокорейтинговых научных журналах.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью проекта является решение актуальных задач в области молекулярной фармакологии и фармакометаболомики методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Исследования, выполненные на первом этапе проекта, проводились в соответствии с исходным планом работ и были посвящены решению трех взаимосвязанных задач: (i) изучению структуры и функциональных свойств фармакологически важных ферментов – потенциальных мишеней действия лекарственных препаратов; (ii) поиску потенциальных ингибиторов ферментов; и (iii) поиску методами ЯМР метаболомики биомаркеров витаминного статуса человека. В качестве объектов исследования – потенциальных мишеней действия лекарств, были выбраны теломераза термофильных дрожжей Hansenula polymorpha, неорганическая пирофосфатаза из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPаза) и формиатдегидрогеназа из Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ). В 2019 году продолжены начатые ранее структурно-функциональные исследования теломеразы из термотолерантных дрожжей Hansenula polymorpha. Фермент теломераза - это сложный рибонуклеопротеиновый комплекс, поддерживающий целостность генома у эукариот и обеспечивающий клеточную пролиферацию. Теломераза из термотолерантных дрожжей Hansenula polymorpha содержит белки Est1 и Est3, которые необходимы для функции теломеразы in vivo. Было показано, что Est3 и Est1 взаимодействуют друг с другом, обеспечивая стабильность рибонуклеопротеинового комплекса. Отсутствие одного из этих белков делает невозможным связывание второго белка с TER. В то же время показано, что свободный Est3 не связывается специфически с N-терминальным доменом TERT, как это было предложено ранее для некоторых видов дрожжей. Ранее нами была определена структура высокого разрешения Est3 из Hansenula polymorpha в растворе. Белок имеет классический OB-фолд, типичный для белков, связывающихся с олигонуклеотидами. Несмотря на это, было показано, что свободный Est3 не взаимодействует с фрагментами ДНК и/или РНК, имитирующими возможное окружение Est3 в теломеразе. Был сделан вывод о том, что именно взаимодействие Est3 с Est1 лежит в основе функциональных свойств белка. Для скрининга и дизайна новых ингибиторов Mt-PPазы и Sa-ФДГ, потенциальных антибактериальных препаратов, начата работа по изучению этих ферментов методами ЯМР. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР этих белков необходимо для рационального дизайна структуры новых ингибиторов методами SAR-by-NMR. Оба фермента - очень крупные белки для изучения методами ЯМР. Mt-PPаза в растворе является гексамером с общей молекулярной массой 110 кДа, а sa-ФДГ – гомодимер с молекулярной массой 84 кДа. Для изучения белков такого размера необходимо не только обогащение изотопами 13C и 15N, но и дейтерирование. В 2019 году создана методика получения Mt-PPазы, обогащенной изотопами 13C и 15N на 99% и 2D на 95%. Разработан новый эффективный протокол обмена атомов дейтерия в амидных группах на протий без заметной потери ферментативной активности Mt-PPазы. Без такого обмена большое количество амидных групп белка, защищенных прочными водородными связями, оказываются недоступными для детектирования методами ЯМР. Указанные подходы и оптимизированные условия измерения спектров ЯМР позволили получить для Mt-PPазы спектры высокого качества, с шириной сигналов сопоставимой со спектрами белков, имеющих молекулярную массу 25-30 кДа. На полученных образцах Mt-PPазы-13C,15N,2D измерена серия 3D гетероядерных экспериментов ЯМР, необходимых для отнесения сигналов белковой цепи. Получено отнесение, которое будет далее верифицировано на втором этапе проекта. Проведены работы по получению образцов Sa-ФДГ на минимальной среде на основе D2O. Намечены подходы к получению образцов Sa-ФДГ, обогащенных стабильными изотопами 13C,15N и 2D, а также обмена дейтерия в амидных группах белка на протий. Для Mt-PPазы и Sa-ФДГ на основе имеющихся в распоряжении научного коллектива кристаллических структур проведен виртуальный скрининг потенциальных ингибиторов ферментов из коммерчески доступных библиотек химических соединений Интербиоскрин и ХимРар. Отобраны соединения, которые на втором этапе проекта будут исследоваться экспериментально методами ЯМР скрининга. В соответствии с планом исследований проведена работа по тестированию Mt-PPазы в качестве потенциального лекарственного средства для лечения пирофосфатной артропатии, характеризующейся накоплением пирофосфата кальция в хрящевой ткани суставов и синовиальной оболочке. Ранее было предложено с этой целью использовать фермент, иммобилизованный на наноалмазах детонационного синтеза, для повышения его стабильности и биодоступности. Методом ЯМР на ядрах 31P исследована ферментативная активность по гидролизу пирофосфата для растворимых форм фермента и образцов, иммобилизованных на наноалмазах. Конъюгаты Mt-PPазы показали высокую ферментативную активность и устойчивость к ингибированию фермента ионами кальция, содержащегося в синовиальной жидкости. Сделаны выводы о целесообразности применения Mt-PPазы для гидролиза неорганического пирофосфата in vivo, как потенциального метода лечения пирофосфатной артропатии. Начата работа в области ЯМР метаболомики, имеющая своей целью определение метаболомных профилей здоровых лиц молодого возраста до и после монотерапии витаминами С, В1, В6, В9, В12 и Д. Планируется исследовать влияние витаминов на метаболитный состав мочи, сыворотки и плазмы крови с целью идентификации метаболитов – маркеров витаминного статуса человека. Эта задача связана с необходимостью эффективной диагностики витаминной недостаточности — болезни, возникающей при недостаточном поступлении того или иного витамина с пищей, и ведущий к его дефициту в организме. В основе этой болезни лежат нарушения зависящих от данного витамина биохимических процессов, что может отражаться в метаболоме человека. Сотрудниками ФГБНУ «ФИЦ питания и биотехнологии» (организация – соисполнитель проекта) в 2019 году был проведен набор 80 добровольцев - участников исследования, в возрасте от 18 до 45 лет, с нормальным индексом массы тела и отсутствием в их анамнезе хронических заболеваний, влияющих на метаболические процессы в организме и/или нарушающие усвояемость витаминных препаратов. Проведенное исследование является полностью конфиденциальным. Все добровольцы были распределены на группы, в соответствии с назначаемым им витаминным препаратом. У каждого из них три раза с интервалом в 14 дней отбирались биологические жидкости (суточная моча, сыворотка и плазма крови). Первый отбор производился до назначения витаминного препарата, второй – сразу после 14 дней приема препарата. После этого прекращался прием витаминного препарата, и третий отбор проводился спустя 14 дней после его отмены. Всего было собрано и заморожено 720 образцов биологических жидкостей, которые были переданы для дальнейших исследований методами ЯМР. В образцах крови во время первого отбора определены уровни витаминов В1, В2, В6, фолиевой кислоты, В12, С, Д, А, Е и К методом иммуноферментного анализа. Установлено, что 37.5% добровольцев имели нормальное содержание всех исследуемых витаминов, 26.25% имели дефицит одного витамина, а остальные имели дефицит двух и более витаминов. Не было выявлено значимого влияния возраста или гендерной принадлежности участников эксперимента на содержание витаминов. На втором этапе проекта для всех образцов будут проведены измерения спектров ЯМР. В 2019 году были отработаны условия пробоподготовки и измерения спектров ЯМР биологических жидкостей. Определены оптимальные методы подготовки образцов мочи и крови, а также наиболее эффективные импульсные последовательности ЯМР, позволяющие минимизировать артефакты и наиболее адекватно воспроизводить количественное соотношение метаболитов. В 2019 году подготовлено и направлено в печать две статьи (в журналы Scientific Reports и ACS Omega). Участниками проекта сделано 8 докладов на международных и российских научных конференциях и научных школах с изложением полученных результатов исследований.

 

Публикации

1. Валуева А.В., Романов Р.С., Марьясина С.С., Елисеев М.С., Родина Е.В. Inorganic pyrophosphatase–nanodiamond conjugates hydrolyze pyrophosphate in human synovial fluid ACS Omega, - (год публикации - 2020).

2. Польшаков В.И., Петрова О.А., Манцызов А.Б., Марьясина С.С., Родина Е.В., Малявко А.Н., Шепелев Н.М., Ефимов С.В., Зацепин Т.С., Зверева М.Э. Донцова О.А. Структурно-функциональные исследования белков теломеразы БИОТЕХНОЛОГИЯ - МЕДИЦИНЕ БУДУЩЕГО, Материалы всероссийской мультиконференции с международным участием. Новосибирск, 2019, БИОТЕХНОЛОГИЯ - МЕДИЦИНЕ БУДУЩЕГО, Материалы всероссийской мультиконференции с международным участием. Новосибирск, 2019 Издательство: ООО "Офсет-ТМ", стр. 132 (год публикации - 2019).

3. Шепелев Н.М., Марьясина С.М., Манцызов А.Б., Малявко А.Н., Ефимов С.В., Петрова О.А., Родина Е.В., Зверева М.Э., Донцова О.А., Польшаков В.И. Insights into the structure and function of Est3 from the Hansenula polymorpha telomerase Scientific Reports, - (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью проекта является решение актуальных задач в области молекулярной фармакологии и фармакометаболомики методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В ходе выполнения проекта продолжено решение трех взаимосвязанных задач: (i) изучение строения фармакологически важных биомакромолекул; (ii) поиск новых биологически активных соединений; и (iii) поиск биомаркеров витаминного статуса человека. Для решения указанных задач использовались современные методы спектроскопии ЯМР. В 2020 году продолжены исследования строения, динамики и функциональных свойств нескольких фармакологически важных биомакромолекул, прежде всего неорганической пирофосфатазы из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPазы) и формиатдегидрогеназы из Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ). Методами гетероядерной 3D спектроскопии ЯМР сделано отнесение сигналов 1H, 13C и 15N основной цепи Mt-PPазы – крупного по меркам метода ЯМР белка (110 кДа, гексамер). Высокое качество спектральной информации было обеспечено применением эффективных методов дейтерирования белка. Информация об отнесении сигналов Mt-PPазы использована для определения вторичной структуры белка в растворе и установления динамических свойств белковой цепи в шкале времени от пс до мс. Установлены области белка, различающиеся своей структурой в растворе и кристалле. Разработан метод получения фермента Sa-ФДГ, обогащенного стабильными изотопами 15N и протокол обмена атомов дейтерия в амидных группах белка на протий. Измерены спектры 15N-1H TROSY этого крупного белка (84 кДа, димер), высокое качество которых гарантирует возможность отнесения сигналов белка в гетероядерных спектрах ЯМР. Методами спектроскопии ЯМР исследован транскрипционный фактор CTCF из двух видов дрозофилы, в результате чего показано его существование в олигомерном состоянии. Продолжены работы по поиску потенциальных ингибиторов Mt-PPазы и Sa-ФДГ и установлению строения новых антибиотиков. Отобраны и закуплены 36 соединений – потенциальных молекулярных фрагментов ингибиторов Sa-ФДГ из коммерчески доступных библиотек ХимРар и Интербиоскрин. Используя АМФ, являющийся фрагментом кофактора НАДФ и обладающий умеренной аффинностью по отношению к Sa-ФДГ, оптимизированы условия ЯМР скрининга с помощью экспериментов STD и WaterLOGSY. Методами ЯМР скрининга проведено тестирование 36-ти молекулярных фрагментов на способность специфически связываться с Sa-ФДГ. Найдено 3 хита, имеющие аффинность по отношению к белку, превышающую аффинность АМФ. Для этих хитов в присутствии АМФ проведены эксперименты NOESY, показавшие, что все найденные соединения связываются в одном и том же сайте белка, либо в сайтах, расположенных в непосредственной близости друг к другу. При этом ни один из хитов не конкурирует с АМФ за его сайт связывания. Полученная информация будет использована для создания соединений, обладающих более высокой аффинностью по отношению к Sa-ФДГ. Для Mt-PPазы проведены эксперименты по поиску соединений, связывающихся с ферментом, путем мониторинга сигналов белка (SAR-byNMR). Найдены фрагменты – производные 1-аминонафталин-5-сульфокилоты, специфически взаимодействующие с Mt-PPазой. На их основе синтезировано соединение, обладающее сравнительно высокой ингибирующей активностью по отношению к ферменту. Структура синтезированного соединения подтверждена методами ЯМР. Информация об отнесении сигналов Mt-PPазы в спектрах ЯМР была использована для изучения деталей механизма действия фермента, в частности его связывания с соединениями, обладающими ингибирующими и активирующими свойствами – АТФ, метиленбисфосфонатом, солями яблочной и лимонной кислоты, ионами цинка. Полученные данные позволили определить расположение центров связывания исследованных соединений с белком. Методами ЯМР установлена структура трех антибиотиков природного происхождения, механизмом действия которых является ингибирование белкового синтеза, найденных коллегами из Химического факультета МГУ с помощью оригинальной тест-системы. Один из найденных антибиотиков не имеет аналогов среди известных структур фармакологически активных соединений. Продолжена работа в области ЯМР метаболомики, имеющая своей целью определение метаболомных профилей здоровых лиц молодого возраста до и после монотерапии витаминами С, В1, В6, В9, В12 и Д с целью обнаружения биомаркеров витаминного статуса человека. В 2020 году проведена пробоподготовка 720 образцов биологических жидкостей (моча, плазма и сыворотка крови) добровольцев, участвовавших в метаболомном тестировании на предыдущем этапе выполнения проекта. Для всех образцов измерены 1D спектры ЯМР. Начата работа по идентификации метаболитов и количественной оценки их содержания с помощью программы метаболомного анализа Chenomx. Параллельно начат статистический анализ спектров ЯМР методом главных компонент (PCA), а также с помощью дискриминационного анализа методом проецирования латентных структур (PLS-DA) и дискриминационного ортогонального анализа методом проецирования латентных структур (OPLS-DA). Эти три метода наиболее часто используются для статистического анализа данных, получаемых в ЯМР метаболомике. Метод PCA позволяет оценить тенденцию имеющихся образцов к кластеризации на отдельные группы, а методы PLS-DA и OPLS-DA позволяют непосредственно наблюдать разницу между изначально заданными группами, в частности выделять причины различий в группах (например, до и после приема витаминов, а также различия в группах, принимавших различные витамины). Сотрудниками ФГБНУ «ФИЦ питания и биотехнологии» (организация-соисполнитель проекта) в 2020 году был произведен дополнительный отбор 40 добровольцев с целью увеличение числа участников эксперимента до 120 человек. Это необходимо для повышения статистической значимости проведенного исследования. Пробоподготовка и измерение спектров ЯМР новой группы образцов биологических жидкостей будут проведены в начале 2021 года. Статистический анализ на следующем этапе проекта будет проведен на объединенном массиве метаболомных данных. В 2020 году опубликовано 6 статей в рецензируемых научных журналах (Scientific Reports, ACS Omega, Nature Chemical Biology, Biomolecular NMR Assignments и International Journal of Molecular Sciences), включая две статьи, посланные в печать в конце 2019 года. Одним из участников проекта (Павловой О.С.) защищена кандидатская диссертация. По промежуточным результатам ЯМР-метаболомных исследований Ларичевой Д.И. сделан доклад на международной научной школе-конференции «Magnetic Resonance and Magnetic Phenomena in Chemical and Biological Physics. VI International School for Young Scientists».

 

Публикации

1. - Учёные проследили эволюцию белка-мишени для противораковых препаратов Аргументы и факты, Москва, 3 сентября - АиФ-Москва (год публикации - ).

2. - Российские ученые расшифровали структуру "белка бессмертия" РИА Новости, МОСКВА, 3 сен — РИА Новости (год публикации - ).

3. - Теломеразный белок сменил профессию Индикатор, - (год публикации - ).

4. - Расшифровали белок бессмертия российские ученые Курьер, - (год публикации - ).

5. - Учёные проследили эволюцию белка-мишени для противораковых препаратов Информационный портал о высшем и дополнительном образовании в России ACADEMICA.RU, - (год публикации - ).

6. - Теломеразный белок сменил профессию Сайт о нанотехнологиях NanoNewsNet, - (год публикации - ).

7. - Российские ученые расшифровали структуру «белка бессмертия» Рамблер новости, - (год публикации - ).

8. - Descifran la estructura de una proteína 'inmortal' clave para una cura contra el cáncer Sputnik, - (год публикации - ).

9. - Structure of ‘immortality protein’ now better understood Bioengineer, - (год публикации - ).

10. - A new antibiotic binding site found in the ribosome Phys.org, - (год публикации - ).

11. - В рибосоме найден новый сайт связывания антибиотика Naked science, - (год публикации - ).

12. - A new antibiotic binding site was found in the ribosome Science Magazine, - (год публикации - ).

13. - Российские химики нашли вещество для антибиотика нового поколения РИА Новости, МОСКВА, 30 июня — РИА Новости (год публикации - ).

14. - В бактериях нашли новую мишень для антибиотиков Наука и Жизнь, - (год публикации - ).

15. А.В. Валуева, Р.С. Романов, С.С. Марьясина, М.С. Елисеев, Е.В. Родина Inorganic Pyrophosphatase–Nanodiamond Conjugates Hydrolyze Pyrophosphate in Human Synovial Fluid ACS Omega, Vol. 5, issue 15, pages 8579–8586 (год публикации - 2020).

16. А.Н. Бончук, С. Камалян, С.С. Марьясина, К.М. Бойко, В.О. Попов, О.Г. Максименко, П.Г. Георгиев N-terminal domain of the architectural protein CTCF has similar structural organization and ability to self-association in bilaterian organisms Scientific Reports, Volume 10, Article number: 2677 (2020) (год публикации - 2020).

17. И.А. Остерман, M. Wieland, T.P. Maviza,К.А. Лашкевич, Д.А. Лукьянов, Е.С. Комарова, Ю.В. Закалюкина, R. Buschauer, Д.И. Ширяев, S.A. Leyn, J.E. Zlama, М.В. Бирюков, Д.А. Скворцов, В.Н. Ташлицкий, В.И. Польшаков, J. Cheng, Ю.С. Поликанов и др. Tetracenomycin X inhibits translation by binding within the ribosomal exit tunnel Nature Chemical Biology, Vol. 16, pages 1071–1077 (2020) (год публикации - 2020).

18. Н.Н. Шепелев, С.С. Марьясина, А.Б. Манцызов, А.Н. Малявко, С.В. Ефимов, О.А. Петрова, Е.В. Родина, М.Э. Зверева, О.А. Донцова, В.И. Польшаков Insights into the structure and function of Est3 from the Hansenula polymorpha telomerase Scientific Reports, Article number: 11109 (2020) (год публикации - 2020).

19. Павлова А.В., Монахова М.В., Оглоблина А.М., Андреева Н.А., Лаптев Г.Ю., Польшаков В.И., Громова Е.С., Зверева М.Э., Якубовская М.Г., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А., Долинная Н.Г. Responses of DNA Mismatch Repair Proteins to a Stable G-Quadruplex Embedded into a DNA Duplex Structure International Journal of Molecular Sciences, vol. 21, article 8773 (год публикации - 2020).

20. Р.С. Романов, С.С. Марьясина, С.В. Ефимов, В.В. Клочков, Е.В. Родина, В.И. Польшаков Backbone resonance assignment and dynamics of 110 kDa hexameric inorganic pyrophosphatase from Mycobacterium tuberculosis Biomolecular NMR Assignments, Vol. 14, issue 2, pages 281–287 (2020) (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году в рамках выполнения проекта исследовано строение в растворе и динамика белковой цепи формиатдегидрогеназы из Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ), выполнены работы по поиску ингибиторов Sa-ФДГ и неорганической пирофосфатазы из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPазы), установлено строение нескольких новых биологически активных соединений, проведен анализ метаболомных данных для выявления биомаркеров витаминного статуса человека. Основным экспериментальным методом решения всех задач была спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Разработан эффективный метод получения образцов Sa-ФДГ, обогащенных стабильными изотопами 13C, 15N и 2D, основанный на использовании изотопно-меченной богатой среды ISOGRO-13С,15N,2D на стадии экспрессии белка. Для получения образцов белка, в котором все амидные группы представлены в виде NH, а не ND, экспрессия белка проводилась на смеси H2O/D2O (1:1). Высокая прочность структуры белка и его сложный фолд не позволил использовать альтернативные методы обмена амидных групп ND на NH. Полученные образцы белка, обогащенного стабильными изотопами Sa-ФДГ-15N,2D и Sa-ФДГ-13С,15N,2D, использовали для измерения гетероядерных 3D спектров ЯМР tr-HNCO, tr-HN(CA)CO, tr-HNCA, tr-HN(CO)CA, tr-HNCACB и tr-CBCA(CO)NH. Их анализ позволил выполнить отнесение сигналов 1H, 13C и 15N для ~80% непролиновых аминокислотных остатков белка и определить его вторичную структуру в растворе. На образце 15N,2D-Sa-ФДГ измерены также скорости релаксации ядер 15N амидных групп белка и гетероядерные эффекты Оверхаузера 15N-1H. Время корреляции вращательной диффузии белка, полученное из анализа релаксационных данных, оказалось равным ~30 нс при 45°C, что хорошо согласуется с размером исследуемого белка (М.М. ~84 кДа). Рассчитаны параметры, характеризующие амплитуду и эффективные частоты внутренних движений аминокислотных остатков Sa-ФДГ. С целью поиска новых ингибиторов Sa-ФДГ – потенциальных антибактериальных препаратов, найдены три соединения с достаточно высокими для молекулярных фрагментов ингибирующими свойствами. Для двух соединений, имеющих схожий молекулярный остов, определен сайт связывания с белком и установлено положение лигандов в этом сайте. На основании полученных данных выявлен перспективный молекулярный каркас для дальнейшей модификации с целью повышения ингибирующих свойств соединений-аналогов. Методами ЯМР-титрования исследовано взаимодействие найденного на предыдущем этапе ингибитора Mt-PPазы с белком. Установлено, что центр связывания этого соединения расположен во внутритримерном интерфейсе гексамера Mt-PPазы. Найденный новый сайт связывания использован для поиска соединений, способных связываться с ферментом по этому центру. Методами виртуального скрининга установлено, что в этом центре могут связываться соединения класса α-аминофосфонатов. Два соединения этого класса были синтезированы, очищены и идентифицированы. Для обоих новых соединения была подтверждена ингибирующая активность по отношению к Mt-PPазе и определены их константы связывания с Mt-PPазой. Методами спектроскопии ЯМР установлено строение нового аналога тетраценомицина X, выделенного из культуральной среды актинобактерий Amycolatopsis sp. A23. Определено строение и конформационные свойства трех новых синтетических соединений пептидной природы, содержащих в своем составе фрагменты, связывающиеся с высокой селективностью с простат-специфичным мембранным антигеном (ПСМА). Одно из исследованных соединений представляет собой базовый каркас для синтеза новых аналогов, второе соединение содержит флуоресцентный краситель для визуализации клеток рака простаты, третье соединение содержит фрагмент, обладающий цитотоксическими свойствами для лечения рака простаты. Установлена природа конформационной изомерии всех исследованных соединений. В развитие работ по поиску биомаркеров витаминного статуса человека методами ЯМР-метаболомики, в 2021 году проведена пробоподготовка и измерены спектры ЯМР образцов биологических жидкостей (мочи, плазмы и сыворотки крови) дополнительной группы из 40-ка добровольцев, участвующих в метаболомном эксперименте. Проведена идентификация метаболитов в спектрах ЯМР образца каждого вида биологических жидкостей. На спектре мочи удалось определить и количественно оценить концентрации 50 соединений, на спектрах сыворотки и плазмы крови — по 55. Проведен статистический анализ формы линий на 1H-ЯМР на всех 1080 спектрах, измеренных за три года выполнения проекта. Статистический анализ подготовленных спектральных данных проводили методами мультивариантной статистики: методом главных компонент (PCA), методом дискриминантного анализа проекций на латентные структуры (PLS-DA) и методом множественного регрессионного анализа проекций на латентные структуры (OPLS-DA). Статистический анализ включал построение указанных моделей для образцов каждого типа (моча, сыворотка и плазма крови), попарно для каждого визита (до/после начала витаминотерапии, а также до начала и после отмены витаминотерамии) в группе каждого витамина (A, D, С, E, K, В1, В6, B9 и В12). Созданные модели PCA показали, что в большинстве случаев индивидуальный уровень метаболизма добровольца оказывает более значимое влияние на форму линий на спектрах, чем наличие или отсутствие витаминотерапии. Построенные для преодоления этой проблемы модели PLS и OPLS-DA в случаях витаминов B9 и C также не показали разбиения данных на кластеры по признаку приёма витамина. Тем не менее, с помощью построения модели OPLS-DA удалось добиться разбивки образцов в группах витаминов B1 и B12 на два непересекающихся кластера в соответствии с приёмом витамина или его отсутствием. Анализ компонент, вносящих вклад в кластеризацию спектров, показал, что разбиение в обоих случаях связано преимущественно с изменением концентрации гиппурата, а также нескольких других метаболитов. Более надежным, но существенно более трудоемким методом анализа спектров ЯМР биологических жидкостей, была ручная идентификация метаболитов в каждом спектре. Эта работа была полностью завершена для группы витамина B9 и контрольной группы добровольцев, принимавших плацебо вместо витаминов. Распределение концентраций метаболитов, идентифицированных в группе витамина B9, проанализировано методами статистического унивариантного анализа с использованием T-критерия Уилкоксона и эмпирического Байесовского анализа микроматрицы. В результате проведенного исследования удалось установить, что у людей, принимавших витамин B9, значимо и с высокой степенью достоверности возрастает концентрация 3-гидроксибутирата в крови. Этот метаболит с высокой надежностью можно рассматривать в качестве биомаркера уровня содержания фолиевой кислоты (витамина B9). В 2021 году опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах (Molecules, Biochimie и Journal of Medicinal Chemistry). Членами научного коллектива сделано пять докладов на Российских и международных конференциях и научных школах.

 

Публикации

1. Алферова В.А., Мавиза Т.П., Бирюков М.В., Закалюкина Ю.В., Лукьянов Д.А., Скворцов Д.А., Васильева Л.А., Ташлицкий В.Н., Польшаков В.И., Сергиев П.В., Коршун В.А., Остерман И.А. Biological evaluation and spectral characterization of a novel tetracenomycin X congener Biochimie, in press, published online 28 September 2021 (год публикации - 2022).

2. Ларичева Д.И., Марьясина С.С., Вараева Ю.Р., Стародубова А.В., Польшаков В.И. Оценка витаминного статуса человека методами ЯМР-метаболомики ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ. Сборник тезисов. XXXIII ЗИМНЯЯ МЕЖДУНАРОДНАЯ МОЛОДЁЖНАЯ НАУЧНАЯ ШКОЛА. Москва, 2021, Сборник тезисов. XXXIII ЗИМНЯЯ МЕЖДУНАРОДНАЯ МОЛОДЁЖНАЯ НАУЧНАЯ ШКОЛА. Москва, 2021, стр. 210 (год публикации - 2021).

3. Мачулкин А.Е., Успенская А.А., Зык Н.Ю., Нименко Е.А., Бер А.П., Петров С.А., Польшаков В.И., Шафиков Р.Р., Скворцов Д.А., .... , Белоглазкина Е.К., Зык Н.В., Хазанова Е.С., Мажуга А.Г. Synthesis, characterization, and preclinical evaluation of a small-molecule prostate-specific membrane antigen-targeted monomethyl Auristatin E conjugate Journal of Medicinal Chemistry, in press (год публикации - 2022).

4. Мачулкин А.Е., Шафиков Р.Р., ..., Польшаков В.И.,..., Донцова О.А., Белоглазкина Е.К., Зык Н.В., Хазанова Е.С., Мажуга А.Г. Synthesis and biological evaluation of PSMA ligands with aromatic residues and fluorescent conjugates based on them Journal of Medicinal Chemistry, volume 64, issue 8, pages 4532–4552 (год публикации - 2021).

5. Петров С.А., Мачулкин А.Е., Успенская А.А., Зык Н.Ю., Нименко Е.А., Гаранина А.С., Петров Р.А., Польшаков В.И., Гришин Ю.К., Рознятовский В.А., Зык Н.В., Мажуга А.Г., Белоглазкина Е.К. Polypeptide-Based Molecular Platform and Its Docetaxel/Sulfo-Cy5-Containing Conjugate for Targeted Delivery to Prostate Specific Membrane Antigen Molecules, Vol. 25, 5784 (год публикации - 2020).

6. Стародубова А.В., Косюра С.Д., Вараева Ю.Р., Ливанцова Е.Н., Поленова Н.В. The association between vitamin D levels and LDL-C in healthy adults Atherosclerosis, Vol. 331, e170-e171 (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
не указано