Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проанализированы результаты долгосрочного (в течение 1 года) эксперимента по изучению динамики многокомпонентного планктонного сообщества, сложившегося на основе естественного комплекса видов из прибрежных вод южной части Балтийского моря, в 4-х идентичных мезокосмах объемом 120 л, в которых поддерживался постоянный одинаковый гидрологический, гидрохимический и гидрофизический режим. Планктон в мезокосмах развивался в стабильных, строго контролируемых условиях без внешних стрессоров, т.е. при постоянных значениях освещенности, температуры и солености воды. Концентрация биогенных веществ (растворенного фосфора, нитрата, нитрита, аммония, общего азота и общего фосфора в сестоне) была сходной во всех мезокосмах (Schubert et al., 2017). Эксперимент был нацелен на изучение взаимодействия внешних движущих сил (триггеров) и внутренних механизмов (драйверов), определяющих динамику популяций планктонных организмов, включая протистов. Нами были выдвинуты и экспериментально проверены две гипотезы. Согласно гипотезе 1, естественное явление, которое можно охарактеризовать как «парадокс хаоса» (“the paradox of chaos”), подразумевает, что в стабильных системах, в которых отсутствуют внешние абиотические триггеры (стрессоры), биотические взаимодействия между организмами действуют и как триггеры, и как драйверы динамики планктона. Гипотеза 2 предполагает, что хаотическая динамика планктона не является неизбежной; она вероятностна и возможна, однако она не обязательно возникает в отдельных звеньях планктонного сообщества на разных трофических уровнях. В результате анализа полученных экспериментальных данных были подтверждены обе гипотезы. Эпизоды хаотической динамики планктона были обнаружены во всех четырех мезокосмах, на разных трофических уровнях. Мы наблюдали явление «парадокса хаоса» в мезокосмах без внешнего стресса, когда биотические взаимодействия (т.е. внутренние драйверы динамики популяций) играли роль генераторов внутренних абиотических триггеров комплексной (хаотической) динамики планктона. Эпизоды хаотической динамики микропланктона (в частности, протистов – раковинных амеб Arcella sp., а также коловраток Lecane sp.) были выявлены методом расчета экспоненты Ляпунова. Максимальное число таких эпизодов отмечено в мезокосме с наиболее стабильными абиотическими условиями. Кроме того, нами разработана оригинальная система качественных индикаторов комплексной динамики планктона (QIs, QIp, QI1, QI2) и Интегральный индикатор хаоса (the Integral Chaos Indicator, ICI). Эта новая система индикации может быть использована для оценки валидности рассчитанных величин экспоненты Ляпунова, т.к. известно, что этот показатель характеризуется повышенной чувствительностью к колебаниям значений измеряемых параметров. Полученные результаты будут использованы на последующих этапах выполнения проекта для оценки вероятности успешного расширения ареала инвазийных потенциально токсичных динофлагеллят P. minimum, а также для прогностического моделирования сроков наступления вредоносных «красных приливов» в морях европейской части России. Проведены исследования гетеротрофного питания миксотрофных потенциально токсичных динофлагеллят P. minimum. В том числе, выполнен подбор условий среды и пищевых объектов из числа одноклеточных эукариот и бактерий, позволяющих проводить исследования фаготрофного питания этого модельного вида. Разработан подход, позволяющий выявлять и наблюдать эндоцитоз с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии как на живых, так и на фиксированных объектах; подобраны соответствующие флуоресцентные метки и красители. В частности, отработана методика использования ацидотропного флуоресцентного красителя для мечения пищеварительных вакуолей в клетках динофлагеллят. На основании результатов окрашивания нефлуоресцирующих клеток протистов-фаготрофов (амебы, инфузории) подобран протокол визуализации и регистрации флуоресцентного сигнала, который позволит использовать данный краситель для автофлуоресцирующих живых клеток динофлагеллят. В предварительных экспериментах показано, что флуоресцентные красители FM™ 1-43FX (ThermoFisher Scientific) и CellBrite™ Fix 488 Membrane Dye (Biotium) подходят для окрашивания плазматической мембраны и связанных с ней мембранных клеточных структур «голых» и армированных динофлагеллят. У всех трех использованных нами модельных видов динофлагеллят (Prorocentrum minimum, Heterocapsa niei и Amphidinium carterae) хорошо окрашивается плазматическая мембрана и пузула – парная органелла, связанная со жгутиковым карманом. Установлено, что FM™ 1-43FX может служить флуоресцентной меткой для определения сайтов эндоцитоза динофлагеллят in situ. Отработан протокол фиксации клеток динофлагеллят для просвечивающей электронной микроскопии с учетом сохранности кортикальной области клетки, в первую очередь, цитоскелетных элементов, что имеет первостепенное значение для изучения структур клетки, отвечающих за питание. Разработан новый подход и подобраны условия для регистрации потенциал-управляемых катионных, в том числе кальциевых, каналов плазматической мембраны сферопластов динофлагеллят P. minimum методом локальной фиксации потенциала на мембране в конфигурации «inside-out». Использовали сферопласты P. minimum, лишенные текальных пластин с помощью блокатора синтеза целлюлозы 2,6-дихлорбензонитрила. Сферопласты предварительно обездвиживали центрифугированием. Установлено, что такие каналы могут быть зарегистрированы при использовании ступенчатого протокола изменения мембранного потенциала в диапазоне от -80 до +50 мВ. Отработанная методика позволит приступить к характеристике исследуемых ионных каналов на следующем этапе работ по проекту. В результате экспериментального изучения влияния нитрата, аммония, мочевины и их комбинаций на экспрессию генов транспортера мочевины dur3 и транспортера нитрата nrt2, а также оценки общего уровня транскрипции у динофлагеллят P. minimum получены новые данные, демонстрирующие тотальный клеточный ответ этих микроорганизмов на изменение доступного азотсодержащего субстрата. Показано, что клетки P. minimum чувствительны к изменению пропорций разных азотсодержащих веществ в среде и могут применять наиболее эффективную стратегию их ассимиляции в изменяющихся условиях окружающей среды. Так, уровни экспрессии генов dur3 и nrt2 у растущей на нитрате культуры P. minimum изменялись после добавления исследуемых источников азота, демонстрируя наиболее низкую экспрессию в присутствии аммония. Уровни экспрессии dur3 понижались при добавлении нитрата, аммония, мочевины или смеси мочевины и NH4+ в 1.7-2.6 раз по сравнению с контролем, растущим в присутствии нитрата. Уровни экспрессии гена nrt2 понижались в 1.9 раз только в присутствии NH4+. Измерение скорости репликации показало, что добавление разных источников азота не влияло на уровни синтеза ДНК в клетке. Однако транскрипционная активность динофлагеллят повышалась после добавления всех изученных субстратов. Наибольшее повышение транскрипционной активности клеток (в 4.9 раз) было зафиксировано после добавления смеси мочевины и аммония к стационарной культуре P. minimum и в 12.5 раз – при проточном культивировании с добавлением мочевины. Полученные результаты позволяют сделать вывод о высоком потенциале использования изученных параметров для моделирования формирования вредоносных цветений в морских экосистемах в условиях глобального азотного загрязнения прибрежных акваторий (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045653519323227). Обобщены данные о трофических связях динофлагеллят P. minimum (синоним P. cordatum) в природных морских планктонных пищевых сетях Балтийского и Черного морей. Проанализированы сведения о пороговых концентрациях клеток этих динофлагеллят при их массовом цветении (т.е. формировании «красных приливов») в разных морских водоемах. Обобщены данные о скоростях роста популяций P. minimum в разных экологических условиях, конкурентных преимуществах вида благодаря его миксотрофному метаболизму и эффективным адаптационным стратегиям, размерах и содержании углерода в клетках, а также потенциальной токсичности этих протистов. Установлено, что основными потребителями P. minimum в морских планктонных сообществах служат каляноидные копеподы Acartia clausi, A. tonsa, A. erythraea, Calanipeda aquaedulcis, Arctodiaptomus salinus, Calanus helgolandicus, Temora longicornis, Centropages chierchiae и некоторые другие виды; миксотрофные динофлагелляты Heterocapsa triquetra; гетеротрофные динофлагелляты Gyrodinium spp. и Polykrikos kofoidii; инфузории-тинтинниды Favella ehrenbergii, F. taraikaensi, Eutintinnus pectinis и Metacylis angulata; беспанцирные инфузории Strombidinopsis spp., Strombidium spp. и Pelagostrobilidium sp. Представлены сведения о диапазоне скоростей питания P. minimum; скоростях его потребления инфузориями, гетеротрофными динофлагеллятами и копеподами; возможностях массовых видов копепод контролировать вредоносные цветения динофлагеллят (http://protistology.ifmo.ru/num13_3/khanaychenko_protistology_13-3.pdf). Кроме того, в ходе нашего исследования разработан новый эффективный метод получения экстрактов клеток динофлагеллят P. minimum, обогащенных пигментами-каротиноидами перидинином и диадиноксантином, с целью использования этих биологически активных соединений в биомедицине и токсикологии (http://genescells.ru/). В 2019 г. коллективом опубликованы 6 публикаций, в том числе 2 статьи и 1 тезисы в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science (Core Collection) или Scopus; среди них 1 статья в журнале Q1 (Chemosphere, IF=5.108). Результаты работ по проекту также обнародованы в серии докладов на международных конференциях, в том числе, в виде 3-х приглашенных пленарных докладов. Публикационные показатели реализации проекта в 2019 г. превышают заявленные плановые значения.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Экологические, клеточные и молекулярно-генетические предпосылки успешного распространения вредоносных цветений инвазийных потенциально токсичных динофлагеллят в прибрежных водах морей невозможно адекватно оценить без знаний о реальных триггерах и драйверах динамики планктона. Решению этой важнейшей проблемы также способствует четкое понимание того, какие сочетания гидрофизических, гидрохимических и биотических характеристик пелагических экосистем индуцируют вспышки массового развития водорослей. Между тем, эти цветения («красные приливы») в наши дни все шире распространяются в водоемах Земного шара и происходят чаще всего в условиях теплой погоды, высокой иррадиации и пониженного турбулентного перемешивания водных масс при отсутствии ветра. Наши лабораторные эксперименты с мезокосмами выявили важную роль стабильности физико-химических факторов как универсального свойства окружающей среды, определяющего тип динамики планктона, в том числе, его хаотическую динамику (Telesh, …, Skarlato, 2019; https://www.nature.com/articles/s41598-019-56851-8). Выдвинута и подтверждена натурными данными гипотеза, согласно которой абиотическая стабильность в природной среде может стимулировать хаотическую динамику планктона и тем самым усиливать вредоносные цветения водорослей. Анализ базы данных по фитопланктону южной части прибрежной зоны Балтийского моря за три десятилетия (1988-2016 гг.) выявил 15 случаев «красных приливов» динофлагеллят, в каждом из которых доминировали виды рода Prorocentrum, главным образом, миксотрофный потенциально токсичный вид Prorocentrum cordatum (синоним P. minimum). Применение двух оригинальных подходов: синхронизированного подхода и анализа абиотической стабильности методом смещенных данных, позволило показать, что, вопреки имеющимся представлениям, стабильность основных физико-химических параметров в прибрежных экосистемах может быть весьма значительной на протяжении периода времени от одной до пяти недель. Установлено, что цветения динофлагеллят в Балтийском море обычно приурочены к периодам с повышенной стабильностью значений температуры воды и pH, а также концентрации общего азота, ионов нитрита, нитрата и аммония. Впервые статистически доказано, что именно абиотическая стабильность, а не просто критические абсолютные значения физико-химических параметров среды, может служить стимулом для формирования вредоносных цветений динофлагеллят (Telesh, Schubert, Skarlato; Estuarine, Coastal and Shelf Science, Q1; статья на рецензировании). Оценены условия сосуществования двух видов инвазийных, широко распространенных, а также экологически, социально и экономически значимых планктонных организмов в Балтийском и Черном морях: миксотрофных динофлагеллят Prorocentrum cordatum и их потенциальных потребителей – неретических копепод Acartia tonsa, служащих излюбленной пищей для промысловых пелагических рыб. Мета-анализ доступных опубликованных данных показал, что в Балтийском море популяции обоих видов продолжают увеличивать свою численность, тогда как в Черном море численность P. cordatum стабилизировалась к 2005 году, а популяция A. tonsa продолжает сокращаться. Впервые установлено, что основные параметры среды, необходимые для успешного развития популяции P. cordatum, сходны с таковыми для размножения A. tonsa, а периоды времени, в течение которых популяции обоих видов достигают максимального размера, в значительной мере совпадают. В то же время, оптимальный температурный диапазон для развития A. tonsa (15–28 °C) несколько шире, чем для P. cordatum (17–25 °C), а величины наиболее благоприятной солености для A. tonsa (15–22‰) и P. cordatum (6–10‰) сильно различаются. Эти результаты позволяют заключить, что в настоящее время экологические ниши A. tonsa и P. cordatum в прибрежных водах и Балтики, и Черного моря перекрываются лишь частично. Следовательно, в нынешних условиях регулирование «цветений» P. cordatum вследствие их потребления копеподами A. tonsa маловероятно. Между тем, процессы эвтрофирования морских прибрежных вод и изменение климата способны сдвинуть равновесие в фитопланктоне в сторону преобладания потенциально токсичных видов водорослей, формирующих вредоносные цветения. Поэтому полученные нами данные важны для разработки алгоритма прогнозирования сроков наступления и мощности «красных приливов» динофлагеллят P. cordatum, оценки их влияния на пелагические пищевые сети, включая развитие популяций промысловых видов рыб, а также для определения перспектив контроля «красных приливов» посредством выедания динофлагеллят планктонными рачками-копеподами при изменении абиотических характеристик среды (Telesh, Khanaychenko, Skarlato, 2020; https://www.zin.ru/journals/protistology/num14_3/telesh_protistology_14-3.pdf ). Проанализированы опубликованные данные о разнообразии стратегий питания миксотрофных динофлагеллят и начат анализ значения гетерогенности способов питания этих организмов для динамики роста их популяций методом численного моделирования. Разработан подход для экспериментальной оценки внутрипопуляционной гетерогенности динофлагеллят в отношении стратегий питания. Этот подход позволяет сочетать флуоресцентную микроскопию и мечение питательных субстратов, в том числе, организмов-жертв, стабильными изотопами азота и углерода, с анализом методом масс-спектрометрии вторичных ионов в наномасштабе (NanoSIMS). Исследовано влияние недостатка азота и фосфора на внутрипопуляционную гетерогенность P. cordatum. Показано, что в культурах с дефицитом фосфора и одновременным недостатком азота и фосфора через 2 недели культивирования появляется субпопуляция клеток с удвоенным содержанием ДНК. Выдвинуто предположение, что дефицит фосфора способствует смещению в жизненном цикле P. cordatum в сторону диплоидной фазы (Калинина, Бердиева, Ломерт, Скарлато, 2020; https://lomonosov-msu.ru/file/event/5934/eid5934_attach_3cc70d7689293d6f66224f2ee9c80ae92493d7cb.pdf ). В ходе экспериментального исследования индуцирован переход к фаготрофии у армированных динофлагеллят P. cordatum в условиях ограничения источника фосфора в среде культивирования, с использованием криптофитовых водорослей Teleaulax amphioxeia в качестве жертвы – объекта фаготрофии. Обнаружен эффект воздействия специфичных блокаторов цитоскелетных белков на частоту захвата жертвы динофлагеллятами. Показано, что обработка клеток P. cordatum ингибиторами, специфично воздействующими на организацию и функционирование актинового и микротрубочкового цитоскелета – цитохалазином D и нокодазолом, уменьшает частоту захвата жертвы клетками динофлагеллят. Так, в образцах, зафиксированных через 24 ч после начала совместного инкубирования P. cordatum и T. amphioxeia, доля клеток динофлагеллят, содержащих пищеварительные вакуоли с жертвой, была почти в два с половиной раза меньше контрольного уровня при обработке цитохалазином D и почти в пять раз меньше при обработке нокодазолом. Эти результаты указывают на участие кортикальных актиновых филаментов и микротрубочковых структур (в частности, пищевой трубки) в процессе фаготрофии у P. cordatum (Berdieva, Fel [Fedotova], Kalinina, Skarlato, Matantseva, 2020; https://www.zin.ru/journals/protistology/num14_3/berdieva_protistology_14-3.pdf ). Проведены исследования гетеротрофного питания «голых» (неармированных) динофлагеллят на примере Amphidinium carterae. Показан эндоцитоз в межвезикулярных порах в клеточных покровах этих организмов. Поглощение липофильного флуоресцентного красителя FM™ 1-43FX (ThermoFisher Scientific) наблюдали сразу после окрашивания, через 1 ч и через 2 ч. Обработка клеток A. carterae ацидотропным флуоресцентным красителем Lysosomal Staining Kit (ab112136, Abcam) выявила наличие в культуре отдельных особей с окрашенными вакуолями разного размера. Ведется проверка гипотезы о возможном поглощении бактерий клетками A. carterae. Впервые при помощи анализа большого количества транскриптомов различных видов динофлагеллят был выявлен консенсусный состав ионных каналов этих организмов. Показано, что динофлагелляты обладают чрезвычайно богатым разнообразием этих трансмембранных белков, включая ионные каналы, участвующие в кальциевой сигнализации и в восприятии клеткой разнообразных внешних стимулов. С помощью метода локальной фиксации потенциала в режиме «inside-out» определены биофизические характеристики потенциал-управляемых кальциевых каналов P. cordatum. На сферопластах этих динофлагеллят были зарегистрированы катионные токи с положительным потенциалом реверсии и зависимостью амплитуды и вероятности открытого состояния от мембранного потенциала. Полученные результаты показали, что динофлагелляты обладают широкими возможностями регуляции своего ионного транспорта, что может обеспечивать этим организмам конкурентные преимущества при меняющихся условиях среды. По результатам работы подготовлена рукопись статьи для журнала Algae (Q1). Установлено, что клетки динофлагеллят высокочувствительны к циркадному ритму. Показано, что P. cordatum реагируют на соленостный стресс как синтезом защитного белка гемоксигеназы-1 (HO-1/HSP32), так и изменением уровня транскрипции, с учетом смены дня и ночи. Методом проточной цитометрии было оценено распределение клеток по фазам клеточного цикла G0/G1, S и G2/M в дневных и ночных культурах P. cordatum. Измерение скорости синтеза ДНК и РНК методом анализа включения 3H-тимидина и 3H-уридина, соответственно, показало, что репликационная активность клеток в ответ на соленостный стресс значительно увеличивалась днем; транскрипционная активность динофлагеллят, напротив, повышалась в ночное время. Полученные результаты показывают, что значительное увеличение синтеза нуклеиновых кислот и белка оксидативного стресса HO-1/HSP32 клетками P. cordatum может служить биомаркером пресса окружающей среды – например, изменения солености. Это позволяет сделать вывод о том, что изученные параметры имеют высокий потенциал для прогностического моделирования изменений внешней среды, благоприятных для формирования вредоносных «красных приливов» динофлагеллят, особенно тех, которые образуются инвазийными потенциально токсичными видами в условиях критической солености Балтийского моря и других европейских морей России (Печковская, Князев, Скарлато, Филатова, 2020; https://lomonosov-msu.ru/file/event/5934/eid5934_attach_3cc70d7689293d6f66224f2ee9c80ae92493d7cb.pdf ; Печковская, 2020; https://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2020/data/19223/106439_uid440341_report.pdf ; Pechkovskaya, Knyazev, Skarlato, Filatova; Journal of Experimental Marine Biology and Ecology; статья на рецензировании). В 2020 г. коллективом опубликованы 6 публикаций, в том числе 3 статьи и 2 тезисов докладов в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science (Core Collection) или Scopus; среди них 1 статья в общенаучном журнале Q1 (Scientific Reports, IF=4.011). Публикационные показатели реализации проекта в 2020 г. превысили заявленные плановые значения.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проникновение чужеродных водных организмов в новые местообитания в наши дни служит одним из важнейших драйверов изменения биогеографии видов, что усугубляется массовыми вредоносными цветениями водорослей в морских прибрежных акваториях и множественными преобразованиями в экосистемах вследствие интенсивного воздействия на них хозяйственной деятельности человека. Для концептуального моделирования инвазий потенциально токсичных динофлагеллят в моря европейской части России в 2021 г. в рамках проекта были проанализированы вредоносные цветения этих микроорганизмов (красные приливы) в Балтийском море. Были оценены тренды видового состава, численности и биомассы фитопланктона на фоне долговременной динамики физико-химических характеристик среды. Выдвинута, проверена и подтверждена на многолетних данных (1988-2016 гг.) гипотеза, согласно которой стабильность основных абиотических характеристик среды (а не просто их критические абсолютные величины) может стимулировать хаотическую динамику планктона и, таким образом, способствовать усилению вредоносных цветений водорослей в аборигенных местообитаниях и их распространению в новые биотопы. Стабильность одиннадцати физико-химических параметров (температуры воды, солености, pH, прозрачности по диску Сэкки, а также концентрации хлорофилла «а», общего фосфора, общего азота, нитрита, нитрата, аммония и соотношения общего азота к общему фосфору) была определена с использованием двух подходов: традиционного синхронизированного подхода и оригинального метода оценки смещенных данных, разработанного в рамках данного проекта. Впервые статистически доказано, что вопреки существовавшим ранее представлениям стабильность основных абиотических параметров в прибрежных водных экосистемах Балтийского моря может быть значительной на протяжении периода времени от одной до пяти недель. В то же время, установлено, что высокая адаптабельность к внешним стрессорам и пластичность стратегий пищевого поведения изученных доминирующих видов миксотрофных динофлагеллят, включая Prorocentrum cordatum (синоним P. minimum), а также их значительная внутрипопуляционная гетерогенность препятствуют выявлению четких корреляционных связей физико-химической стабильности среды с интенсивностью красных приливов и вероятностью колонизации новых акваторий этими микроорганизмами. Вышеназванные особенности популяций динофлагеллят обеспечивают им экологическую успешность, однако они затрудняют математическое моделирование изучаемых процессов. Предложена концептуальная модель, иллюстрирующая роль сложных биотических взаимодействий в обеспечении инвазионного потенциала планктонных динофлагеллят (Telesh, Schubert, Skarlato, 2021; https://doi.org/10.1016/j.ecss.2021.107239 ). Функциональное значение внутрипопуляционной гетерогенности для экологической успешности динофлагеллят исследовали с помощью численного моделирования на основании модели Друпа (Droop, 1968, 1973), описывающей рост микроорганизмов в зависимости от внутриклеточного содержания лимитирующего субстрата – клеточной квоты. На примере миксотрофов, характеризующихся наибольшим разнообразием трофических стратегий, рассмотрен рост двух популяций микроорганизмов: гетерогенной и гомогенной по семи признакам, соответствующим семи различным способам получения азота. Результаты показали, что чем большим разнообразием стратегий питания обладают организмы, тем важнее внутрипопуляционная гетерогенность для динамики роста их популяций. Материалы находятся на стадии обработки, анализа и подготовки рукописи статьи. В серии экспериментов по индуцированию фаготрофии у голых динофлагеллят Amphidinium carterae показано, что добавление к культуре динофлагеллят клеток бактерий Klebsiella aerogenes увеличивает число клеток с пищеварительными вакуолями, окрашенными прижизненным флуоресцентным ацидофильным красителем. Максимальный уровень фагоцитоза (16.77±7.2%) наблюдали в культуре A. carterae, выращенной в условиях дефицита неорганических источников азота и фосфора. Установлено, что недостаток азота и фосфора в среде может рассматриваться как стимул, вызывающий переход к фаготрофии у динофлагеллят A. carterae. Выполнен биоинформатический анализ с целью исследования тонких механизмов, лежащих в основе поглощения динофлагеллятами питательных веществ. Найдены гомологи белков, контролирующих различные этапы и разные пути эндоцитоза у динофлагеллят A. carterae и P. cordatum. Выявлено наличие гомологов белков других эукариот, вовлеченных в эндоцитоз и формирование фагосом, включая эпсин, коронин, клатрин, белок адаптерного комплекса 2 и динамин, а также гомологов малых ГТФаз и белков, содержащих EH-домен, которые регулируют транспорт, созревание и рециклирование везикул. Результаты анализа показали, что два возможных пути поглощения веществ – клатрин-зависимый эндоцитоз и актин-зависимый фагоцитоз – могут быть задействованы в клетках P. cordatum и A. carterae. На основании полученных данных и опубликованных ранее сведений представлена обобщенная схема путей эндоцитоза и обеспечивающих их белков в клетках динофлагеллят (Berdieva, Kalinina, Fel, Skarlato, 2021; https://www.zin.ru/journals/protistology/num15_4/berdieva_protistology_15-4.pdf ). Исследования в рамках проекта показали, что в основе вариативности физиологии динофлагеллят лежит (среди прочего) высокое разнообразие ионных каналов, поскольку практически все физиологические процессы клетки так или иначе связаны с функционированием этих трансмембранных белковых комплексов. В свете того, что динофлагелляты являются главными продуцентами опасных токсинов в морских экосистемах (в частности, они вырабатывают сакситоксин и бреветоксин), долгое время оставался нерешенным вопрос о способах адаптации этих организмов к воздействию собственных вторичных метаболитов. Мы показали, что резистентность динофлагеллят по крайней мере частично может объясняться заменами отдельных аминокислотных остатков в белках FVCC и EukCat. Методами биоинформатики были исследованы фармакологические свойства ионных каналов динофлагеллят. Анализ первичной структуры вероятных потенциал-управляемых кальциевых каналов P. cordatum из семейств FVCC и EukCat показал, что эти каналы не имеют (или имеют лишь часть) сайтов, определяющих высокую аффинность к тетродотоксину и сакситоксину, и поэтому весьма вероятно, что они не чувствительны по крайней мере к наномолярным концентрациям этих веществ. Разработана концептуальная модель, описывающая возможные пассивные потоки ионов (K+, Na+, Ca2+, H+, Cl-, NO32-, HCO3-) через ионные каналы плазматической и внутриклеточных мембран (мембран эндоплазматической сети, митохондрий, хлоропластов, кислых вакуолей, альвеол и сцинтиллонов) динофлагеллят и их связь с различными стимулами и сигнальными путями. Предложенная модельная схема выявляет репертуар ионных каналов клетки динофлагеллят и проливает свет на молекулярные основы физиологических процессов у этих микроорганизмов (Pozdnyakov, Matantseva, Skarlato, 2021; https://www.e-algae.org/ ; статья принята в печать 02.12.2021). Способность динофлагеллят адаптироваться к меняющимся условиям окружающей среды при заселении новых акваторий обусловлена также функционированием белков-цитопротекторов из семейства гемоксигеназ (HO-1 и HO-2), обеспечивающих эффективную защиту клеток от внешних стрессовых воздействий. В ходе исследования реакции P. cordatum на соленостный стресс получены белковые профили дневных и ночных культур этих жгутиконосцев. Установлено, что в ответ на кратковременный соленостный стресс при переводе клеток из контрольных условий (17 промилле) в условия пониженной солености (8 промилле) наблюдалось значительное увеличение интенсивности белковой полосы электрофореза на уровне 32-35 кДа. Методом иммуноблоттинга установлено, что эта полоса белкового фореза представлена гемоксигеназой (HO-1/HSP32). Наибольшее увеличение синтеза HO-1 наблюдали в условиях соленостного стресса в ночное время, что согласуется с результатами определения его влияния также и на тотальные уровни транскрипции у P. cordatum (Pechkovskaya, Knyazev, Skarlato, Filatova, 2021; https://doi.org/10.1016/j.jembe.2021.151545 ). Полученные данные позволяют считать увеличение синтеза стрессового белка-цитопротектора HO-1/HSP32 в ответ на изменение солености потенциальным биомаркером стресса. В этой связи был проведен филогенетический анализ последовательностей HO-подобных белков динофлагеллят и других организмов, обнаруженных в неаннотированных транскриптомах из базы данных MMETSP (Keeling et al., 2014). Установлено, что гомологи гемоксигеназ широко представлены в транскриптомах динофлагеллят. Показано, что последовательности гомологов, идентифицированные в этой базе, имели высокое сходство с последовательностями белков семейства HO других таксонов и содержали типичные консервативные мотивы. Сравнительный анализ двух филогенетических деревьев гомологов белков HO-1 и HO-2 показал, что оба дерева обладали разной топологией и были несопоставимы друг с другом, так что можно предположить, что эти два белка эволюционировали с разной скоростью (Pechkovskaya, Filatova, 2021; https://www.zin.ru/journals/protistology/num15_2/pechkovskaya_protistology_15-2.pdf ). Участники проекта в 2021 г. полностью выполнили план исследований и перевыполнили план по публикациям: опубликовали 5 статей в изданиях Web of Science или Scopus, в том числе 3 статьи в журналах категории Q1, что, согласно уточнению № 14 к п. 16.2. «Конкурсной документации», по формальным показателям соответствует публикации 8 статей (при плане 4 статьи). Исполнителями проекта в 2021 г. были защищены 1 кандидатская диссертация и 1 ВКР бакалавра; подготовлены 2 кандидатские диссертации и сданы кандидатские экзамены двумя соискателями. Результаты обнародованы в рамках приглашенной пленарной лекции на онлайн-конференции ECSA-58 (University of Hull, UK) и в серии научно-популярных статей в СМИ (https://www.rscf.ru/news/release/vpervye-dokazano-chto-opasnye-tsveteniya-vody-krasnye-prilivy-voznikayut-v-stabilnoy-srede/ ; https://www.gazeta.ru/science/news/2021/03/05/n_15698942.shtml ; https://nauka.tass.ru/nauka/10842393 ; и др.).