Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект нацелен на исследование молекулярно-функциональных характеристик эндометриальных мезенхимных стволовых клеток человека (эМСК), культивируемых в модельных 3D системах. Задача проекта – обеспечить фундаментальную основу для создания на основе эМСК ткане-подобных клеточных структур, пригодных для использования в регенеративной медицине. Исследования ведутся в двух направлениях: разработка и характеристика трехмерных (3D) моделей клеточного роста с использованием скаффолдных и безскаффолдных технологий, а также изучение возможности манипулирования пролиферативно-дифференцировочным и секреторным потенциалом эМСК в составе 3D систем с помощью специально разработанных протоколов обработки клеток ростовыми факторами. В 2019 г. году в рамках первого направления работы основное внимание было уделено получению новых линий эМСК, а также изучению характеристик эМСК, культивируемых в безскаффолдных 3D системах – клеточных сфероидах. Были получены и охарактеризованы 2 новые линии эМСК из десквамированного эндометрия здоровых доноров. В поисках новых источников для расширения лабораторной коллекции культур МСК, в рамках сотрудничества с Национальным медицинским исследовательским центром акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова, были охарактеризованы 3 линии МСК хориона, полученные сотрудниками центра от здоровых доноров. Отработана методика формирования клеточных сфероидов с использованием техники висячих капель. Анализ свойств эМСК, собранных в сфероиды, показал, что клетки в сфероидах сохраняют экспрессию поверхностных маркеров и дифференцировочный потенциал, повышают экспрессию генов плюрипотентности (Nanog, Sox2), а также генов противовоспалительных, про-ангиогенных и ростовых факторов (TSG-6, EP2, HGF, VEGF). Установлено, что секреция фактора роста эндотелия VEGF увеличивается в десятки раз по сравнению с клетками монослоя. Проанализирована реакция клеток, культивируемых в сфероидах, на различные виды стрессовых воздействий: окислительный, тепловой и генотоксический стресс. Обнаружено, что культивирование клеток в условиях 3D приводит к изменению характера ответа эМСК на стресс: отмене типичной для 2D эМСК активации путей стресс-индуцированного старения и стимуляции путей, инициирующих апоптотическую гибель клеток, что повышает трансплантационную безопасность клеточного материала в сфероидах. Проведенные исследования позволяют рассматривать эМСК-сфероиды как источник трансплантационного материала, обладающего про-ангиогенными и противовоспалительными свойствами, потенциально пригодный для использования в регенеративной медицине. В рамках программы проекта по изучению влияния различных ростовых факторов на функциональный профиль эМСК в 3D системах и исследованию митогенных сигнальных каскадов эМСК, в текущем году основное внимание было уделено изучению ответа эМСК на обработку ростовыми факторами – лигандами рецептора эпидермального фактора роста (EGF) – и особенностей EGF-рецептор-зависимого митогенного сигналинга. Обнаружено, что в эМСК уровень экспрессии EGFR сравним с таковым в постоянных линиях трансформированных клеток HeLa и A549, оверэкспрессирующих рецептор. Тем не менее, в отличие от этих клеток, лиганды рецептора, EGF и TGF-alpha, стимулируют пролиферацию эМСК, но не вызывают трансформацию клеток. Показано, что EGF и TGF-alpha одинаково ускоряют пролиферацию эМСК. Кроме того, в тесте зарастания раны оба лиганда в равной степени стимулировали подвижность клеток. Обнаружено, что рецептор в эМСК активирован в течение по крайней мере 40-60 мин после стимуляции эндоцитоза (существенно дольше, чем в HeLa), при этом активация сохраняется и после полной интернализации рецептора с поверхности в эндосомы. При этом, активация МАР-киназы демонстрирует высокий уровень вплоть до самых поздних сроков эксперимента, а в предварительных опытах с использованием ингибитора ТК EGFR, несмотря на подавление активности рецептора, активация МАР-киназы сохранялась на поздних сроках. Проведен анализ эндоцитозного пути, стимулируемого в эМСК действием EGF и TGF-alpha. Показано, что оба лиганд-рецепторных комплекса (ЛРК) в эМСК ведут себя одинаково, что существенно отличается от судьбы этих комплексов в трансформированных клетках линий HeLa и А549. Несмотря на эффективную интернализацию, колокализация обоих ЛРК с маркером ранних эндосом ЕЕА1, маркером поздних эндосом Rab7 и маркером поздних эндосом и лизосом Lamp1 существенно ниже, чем в HeLа. При этом деградация рецептора под действием обоих лигандов существенно замедлена по сравнению с таковой в клетках HeLa и практически не наблюдается в течение 2-3 часов после стимуляции эндоцитоза. В течение этого времени в клетках эМСК можно выделить три субпопуляции EGFR-cсодержащих везикул: минорная популяция, колокализующаяся на ранних (до 20 - 30 мин) стадиях эндоцитоза с ЕЕА1, что определяет их дальнейшую деградацию в Lamp1-положительных лизосомах; более многочисленная фракция везикул (20 - 60 мин), несущих, наряду с рецептором, тетраспанин CD63 (что позволяет предположить вступление этих везикул на путь секреции, т.к CD63 считается маркером экзосом); наиболее многочисленная субпопуляция везикул, не колокализующихся ни с одним из маркеров транспортных путей в течение всего эксперимента. Показано также, что уровень ацетилирования микротрубочек сравним с эМСК и HeLa, и не влияет на характер перемещения общего пула эндосом. Помимо программы фундаментальных исследований, в 2019 г. инициирована программа по разработке технологий создания скаффолдов из природных и синтетических материалов, заселенных эМСК. Отработана методика по созданию целюллозного скэффолда с адгезивной поверхностью, модифицированной коллагеном IV, обладающего необходимыми параметрами для культивирования в его составе мезенхимных стволовых клеток человека.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект направлен на определение морфофункциональных характеристик и молекулярно-генетических особенностей эндометриальных мезенхимных стволовых клеток человека (эМСК), культивируемых в модельных 3D системах. Основная задача проекта – обеспечить фундаментальный задел для разработки тканеподобных клеточных структур, потенциально пригодных для использования в регенеративной медицине. В 2020 году исследования велись в двух направлениях: а) характеризация эМСК, культивируемых в различных 3D условиях – в виде клеточных сфероидов, а также внутри целлюлозных и полилактидных скаффолдов; б) изучение возможности манипулирования пролиферативно-дифференцировочным и секреторным потенциалом 3D эМСК с помощью специально разработанных протоколов обработки клеток ростовыми факторами в различных комбинациях. В 2020 г. году в рамках первого направления работы основное внимание было уделено анализу молекулярно-функциональных характеристик и оценке терапевтического потенциала эМСК, культивируемых в различных 3D-системах. На первом этапе были отработаны методы по заселению культурами эМСК скаффолдов на основе целлюлозы и полилактида. Далее была проведена сравнительная характеристика свойств эМСК, культивируемых в виде клеточных сфероидов и внутри пористых целлюлозных матриц. Обнаружено, что в обеих 3D моделях эМСК сохраняют основные фенотипические признаки мезенхимных клеток и способность к тканеспецифической децидуальной дифференцировке, характерной для эндометриальных клеток. В то же время, клетки, культивируемые в разном 3D окружении, характеризуются различной пролиферативной и секреторной активностью. Клетки в составе сфероидов не пролиферируют, находясь в состоянии блока в G0/G1-фазе клеточного цикла, и жизнеспособны в течение не более одной недели, в то время как клетки, населяющие целлюлозные скаффолды размножаются и способны поддерживать свою жизнеспособность в течение как минимум одного месяца. В то же время, клетки в составе сфероидов активно секретируют про-ангиогенные и противовоспалительные факторы (TSG-6, HGF, VEGF), в то время как секреторная активность эМСК внутри целлюлозных матриц сравнима с секреторным потенциалом монослойных культур. Обнаруженные нами специфические свойства эМСК при культивировании в сфероидах позволяют надеяться на их высокий терапевтический потенциал при использовании в регенеративной медицине. Для оценки перспектив терапевтического использования эМСК-сфероидов был проведен ряд тестов in vitro и in vivo, подтверждающих способность эМСК сфероидов стимулировать регенерацию тканей. Про-ангиогенные свойства эМСК в сфероидах были доказаны в экспериментах по 3D ко-культивированию с клетками эндотелиальной природы (HUVEC). Обнаружено, что при ко-культивировании эМСК поддерживают жизнеспособность эндотелиальных клеток. Показано, что HUVEC образуют выросты и тубулярные структуры внутри сфероидов, состоящих из смешанной культуры эМСК-HUVEC, в то время как контрольные сфероиды, состоящие из монокультур HUVEC, не формируют подобных сетей. Кроме того, в модельных опытах по зарастанию раны in vitro, установлено, что эМСК в сфероидах секретируют факторы, стимулирующие миграционную активность клеток. Наконец, эксперименты по оценке терапевтического потенциала эМСК-сфероидов in vivo доказали, что трансплантация эМСК-сфероидов стимулирует заживление кожных ран на теле экспериментальных животных, причем введение суспензии эМСК-сфероидов оказывается более эффективным, чем введение суспензии эМСК, культивируемых в монослое. В рамках программы проекта по изучению влияния различных ростовых факторов на функциональный профиль эМСК в 3D системах и исследованию митогенных сигнальных каскадов эМСК, в текущем году основное внимание было уделено изучению ответа эМСК на обработку ростовыми факторами – лигандами рецептора эпидермального фактора роста (EGF) – и особенностей EGF-рецептор-зависимого митогенного сигналинга. Обнаружено, что если в иммортализованных клеточных линиях HeLa и A549 комплексы рецептора с EGF деградируют в лизосомах, а рецептор в комплексе с TGF-alpha – рециклирует на мембрану, и при этом ни один из ростовых факторов не стимулирует пролиферацию клеток, то в эМСК оба лиганда интернализуются и остаются в составе эндосом, но не вступают ни на путь лизосомной деградации, ни рециклирования в течение нескольких часов после интернализации. При этом оба лиганда в одинаковой мере стимулируют пролиферацию эМСК. Установлено, что эти эффекты не связаны с дефектами деградационного компартмента в эМСК. Более того, эМСК демонстрировали наличие даже большего количества везикулярных структур с гидролитической активностью, чем клетки HeLa. Полученные данные об особенностях организации эндоцитоза EGFR в 2D эМСК позволяют предполагать, что длительная активация МАРК- и Akt-каскадов, стимулируемых в эМСК лигандами EGFR – EGF иTGF-alpha, – может быть связана с длительной стадией пребывания активированных рецепторов в популяции незакисленных эндосом, не созревающих в мультивезикулярные тела. Был начат анализ взаимосвязей между тремя нативными лигандами рецептора EGF - EGF иTGF-alpha, и наименее изученного амфирегулина (AREG). Этот лиганд вовлечен в эстрогеновый сигналинг, а потому особенно интересен с точки зрения эндометриального происхождения культур эМСК. Оказалось, что AREG, в отличие от EGF, не влияет на пролиферацию эМСК, в то время как в клетках HeLa ускоряет ее. Также AREG не влияет и на миграцию эМСК. Кроме того, в отличие от первых двух лигандов, AREG не вызывает интернализацию рецептора EGF. Эти эффекты опосредуются тирозинкиназой рецептора. Изучение паракринной активности в 2D эМСК в контроле и после длительного культивирования с лигандами EGFR показало, что контрольные эМСК не секретируют EGF, TGF-alpha, но секретируют AREG. При этом под действием EGF в эМСК начинает секретироваться TGF-alpha и увеличивается секреция AREG. Также секреция AREG усиливается под действием TGF-alpha. Эти аутокринные петли являются рецептор-зависимыми, так как подавляются в присутствии ингибитора тирозинкиназы рецептора AG1478. Таким образом под действием лигандов EGFR в эМСК запускаются аутокринные петли обратной связи. Важной задачей является анализ функционирования этой аутокринной сети в эМСК, культивируемых в 3D-геометрии.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проект направлен на определение морфофункциональных характеристик и молекулярно-генетических особенностей эндометриальных мезенхимных стволовых клеток человека (эМСК), культивируемых в модельных 3D системах. Основная задача проекта – обеспечить фундаментальный задел для разработки тканеподобных клеточных структур, потенциально пригодных для использования в регенеративной медицине. В 2021 году исследования велись в двух направлениях: а) характеризация эМСК, культивируемых в 3D системах – клеточных сфероидах и скаффолдах синтетического и природного происхождения, заселенных эМСК или эМСК-сфероидами; б) изучение возможности манипулирования пролиферативно-дифференцировочным потенциалом эМСК с использованием ростовых факторов, лигандов рецептора эпидермального фактора роста В 2021 г. году в рамках первого направления работы основное внимание было уделено анализу молекулярно-функциональных характеристик и оценке терапевтического потенциала эМСК, культивируемых в различных 3D-системах. Нам удалось разработать стандартизированную технологию формирования эМСК-сфероидов контролируемого размера, основанную на использовании сред, не содержащих компоненты животного происхождения. Регенеративный потенциал сфероидов, полученных с использованием отработанного метода, доказан в опытах по заживлению кожных ран экспериментальных животных, что позволяет расценивать разработанную методику как потенциально пригодную для использования в регенеративной медицине. Помимо этого, был проведен комплексный мониторинг перестройки паттерна генной экспрессии при переходе от 2D к 3D системе культивирования клеток в сфероидах – обнаружены признаки мезенхимно-эпителиального перехода, активации интегрированного ответа на стресс, дифференцировки клеток в децидуальном направлении, а также получены данные, свидетельствующие об эпигенетической регуляции наблюдаемых перестроек клеточного фенотипа. При выполнении задач проекта, нацеленных на изучение свойств эМСК, культивируемых в различного типа скаффолдах, были охарактеризованы клетки, выращенные в матрицах из целлюлозы, полилактида и децеллюляризованной ткани матки животных. Обнаружено, что эМСК при культивировании на скаффолдах не отличаются по основным морфо-фенотипическим и молекулярно-генетическим характеристикам от клеток, культивируемых в 2D системе, однако значительно отличаются по своим пролиферативным и секреторным свойствам от эМСК в составе сфероидов. В отличие от эМСК в скаффолдах, клетки в сфероидах не пролиферируют, но обладают повышенной секреторной активностью. В эМСК-сфероидах усиливается секреция VEGF-А и индуцируется экспрессия рецепторов VEGF, а также увеличивается экспрессия генов секретируемых противовоспалительных факторов (HGF, TSG, EP2). Проангиогенный потенциал эМСК-сфероидов доказан в опытах in vitro и in vivo. Полученные результаты свидетельствуют о возможности создания сфероидальных систем сокультивирования эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и эМСК человека. В опытах in vitro показано, что сфероиды, полученные путем со-культивирования эМСК и HUVEC, при заключении в фибриновый гель образуют характерные капилляро-подобные выросты, формируя спруто-подобные структуры. Эксперименты in vivo указывают на возможность формирования люменизированной капилляро-подобной сети при подкожной трансплантации этих систем экспериментальным животным. Кроме того, полученные в 2021 г. результаты свидетельствуют о потенциальной значимости гибридных систем – скаффолдов, заселенных сфероидами эМСК, для развития фундаментальных и прикладных исследований в области регенеративной медицины. Гибридные системы могут применяться как ценный трансплантационный материал, а также использоваться для изучения поведения и свойств трансплантированных клеток, позволяя при извлечении скаффолдов из тканей экспериментальных животных-реципиентов получать информацию, необходимую для дальнейшего развития транспланталогии. В рамках программы проекта по изучению влияния различных ростовых факторов на функциональный профиль эМСК в 3D системах и исследованию митогенных сигнальных каскадов эМСК, в текущем году основное внимание было уделено изучению ответа эМСК на обработку ростовыми факторами – лигандами рецептора эпидермального фактора роста (EGF) – и особенностей EGF-рецептор-стимулируемого эндоцитоза и митогенного сигналинга. Обнаружено, что в эМСК два лиганда рецептора – EGF и TGF-α, - стимулируют пролиферацию и клеточную подвижность, тогда как третий лиганд, AREG (амфирегулин), подавляет пролиферацию и не влияет на подвижность. Интересно, что AREG демонстрировал ингибирование пролиферации только после 2х-недельной инкубации в ростовой среде, лишенной рН-чувствительного индикатора фенолового красного, обладающего эстроген-подобной структурой. Продемонстрировано, что эМСК способны секретировать AREG и TGF-α, но при различных условиях. Это свидетельствует о наличии аутокринных механизмов регуляции функционирования системы рецептора EGF в эМСК, возможно, позволяющих координировать корректное прохождение пролиферативной и секреторной фаз цикла развития эндометрия. Показано, что эффекты всех трех лигандов опосредуются рецептором, при этом EGF и TGF-α стимулируют его эндоцитоз, тогда как AREG не интернализуется. Выявлены особенности эндоцитоза рецептора EGF в эМСК, в частности, низкая солокализация комплексов рецептора с EGF и TGF-α с маркерами лизосомного пути, существование популяции не рециклирующих «долгоживущих» эндосом, содержащих активированный, фосфорилированный по мажорному сайту Tyr1068 рецептор, а также замедленная по сравнению с HeLa деградация интернализованных рецепторов рецептор. Оказалось также, что при заселении эМСК в 3D-скаффолд реакция клеток на лиганды рецептора EGF отличается от таковой в клетках, растущих в 2D-условиях, что необходимо учитывать при разработке протоколов манипулирования тканеподобными 3D-конструкциями, получаемыми для применения в регенеративной медицине. Таким образом, полученные в 2021 г. данные позволяют предполагать, что EGF-рецепторные комплексы в эМСК организуют сложную сигнальную сеть, работающую, в зависимости от связанного с рецептором лиганда, на разных стадиях жизненного цикла эндометрия. Очевидно также, что эта система работает совместно с другими рецепторными системами, в том числе гормональными. Полученные данные важны для создания оптимальных протоколов культивирования эМСК в условиях 3D при разработке тканеинженерных конструкций, клеточных продуктов и моделей тестирования лекарственных средств при патологиях эндометрия.