Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. В 2019 году исследовали влияние фотопериода на рост и состояние молоди атлантического лосося возраста 1+, которая искусственно выращивалась на Выгском рыбоводном заводе (Республика Карелия). На этапе сеголеток (0+, декабрь 2018г.) рыбы из контрольной и экспериментальной групп (световой режим 24С:0Т) были помещены в новые бассейны в количестве по 1054 особей: 1 и 2 бассейны – рыбы из контрольной группы (средняя масса рыб 4,2 г) , 3 и 4 бассейны – рыбы, которые росли под постоянным освещением (средняя масса рыб 4,2 г). В зимнее время рыбы из бассейнов 1,2,3 содержались без дополнительного освещения, а в бассейне 4 был установлен режим постоянного освещения 24С:0Т, но только с одной лампой. Далее, 18 мая 2019 года экспериментальные бассейны № 2, 3 и 4 были оборудованы двумя светодиодными светильниками (Aquael led dysmart led sunny, 6W, 6500K). В бассейнах № 2, 3 и 4 освещение было постоянным - 24С:0Т (24 часа), бассейн № 1 был контрольным - без дополнительного освещения. В начале исследования рыбы в каждом бассейне были помечены с помощью чипов (FelixcanSL, Испания). Для этого рыбы были усыплены при помощи гвоздичного масла. После измерения (масса, длина), рыбе вводили чип с индивидуальным номером. Чипировали особей среднего размера в пределах массы 4-5 грамм. Средняя масса отобранных для наблюдения рыб в каждом бассейне была приблизительно одинаковой (4,13 ± 0,03 г. - 4,62 ± 0,04 г.). Измерение массы рыб, температуры и содержание кислорода проводили ежемесячно. Молодь из опытных бассейнов с постоянным освещением на протяжении всего периода исследований имела заметно более высокие значения массы тела по сравнению с особями из контрольного бассейна. В мае-августе 2019 г. отбирали пробы молоди атлантического лосося возраста 1+ для проведения биохимического анализа. Было изучено около 100 биохимических и молекулярно-генетических показателей, отражающих процессы роста и развития молоди лосося. Липиды и их жирнокислотные компоненты. В мае у годовиков лосося, содержащихся в опытном бассейне с непрерывным режимом искусственного освещения по сравнению с таковыми из других бассейнов отмечены достоверно повышенные значения индексов ХС/ФЛ и ТАГ+ЭХС/ФЛ+ХС, указывающие на увеличение степени микровязкости биомембран и повышенное накопление в них запасных липидов по отношению к структурным. Также у них по сравнению с контрольными вариантами отмечено снижение олеиновой 18:1n-9 и 20:1n-9 ЖК и повышение незаменимой α-линоленовой ЖК, 18:3n-3, и минорной 18:4n-3 ЖК, а также индекса 16:0/18:1n-9, что свидетельствует о повышении интенсивности метаболизма липидов. В июне совместное влияние факторов среды - повышение температуры (до 12°С в июне от 2°С в мае) и постоянное освещение вызвали у рыб из всех опытных бассейнов снижение индекса ХС/ФЛ, контролирующего вязкость и текучесть мембран, и индекса соотношения суммы запасных липидов к структурным ТАГ+ЭХС/ФЛ+ХС. При этом не установлено изменений по содержанию отдельных липидов (в % сухой массы). В июне у мальков из опытных бассейнов по сравнению контрольным вариантом отмечено также повышение минорных МНЖК - 22:1n-11, 20:1n-9 и 20:1n-11ЖК, которые, как известно, синтезируются de novo зоопланктоном (копеподами, особенно морскими видами) и в организм рыб поступают с искусственным кормом. При этом в июне особи из опытных бассейнов (особенно в №3) имели и более высокую массу. В июле у молоди из опытных бассейнов сохраняется сравнительно высокое значение индекса ТАГ+ЭХС/ФЛ+ХС. При этом у молоди из опытных бассейнов (особенно из бассейна № 4) при повышении температуры среды до 20оС отмечено достоверное снижение (относительно контроля) ОЛ за счет ХС, ТАГ, ЭХС и индекса ХС/ФЛ, что, как было показано нами ранее при изучении роста и развития молоди лосося в естественной среде обитания, характерно для процесса смолтификации. Снижение у рыб индекса ХС/ФЛ указывает на увеличение проницаемости биомембран (снижению микровязкости), в результате чего повышается функциональная активность клеточных рецепторов, скорость транспорта ионов, метаболитов и воды при использовании энергии запасных ТАГ и ЭХС, содержание которых у молоди из опытных бассейнов также снизилось. Также у них снизилось содержание эссенциальных арахидоновой 20:4n-6 и эйкозопентаеновой 20:5n-3 ЖК. Известно, что фотопериод оказывает наиболее сильное влияние на смолтификацию, регулируя ее процесс у проходных лососевых рыб. В августе у рыб во всех бассейнах, включая контрольный, произошло повышение как ОЛ, так и всех их компонентов. Однако у годовиков лосося из опытных бассейнов № 3 и 4, по сравнению с таковыми из контрольных, отмечено снижение ФЛ (за счет ФИ, ФЭА, ФХ), ХС, ТАГ, ЭХС, а также минорной 20:1n-9 ЖК и повышение значений индексов ХС/ФЛ, ТАГ+ЭХС/ФЛ+ХС. Специфичность изменений показателей липидного метаболизма в августе и более высокий темп их роста, возможно, связаны с используемым световым режимом (24С:0Т). Следует особо отметить, что обнаруженные в течение всего экспериментального периода (с мая по октябрь) более высокие и близкие значения индекса ТАГ+ЭХС/ФЛ+ХС у молоди из опытных бассейнов (2,55-2,60 против 1,96-2,38 в контрольном), указывают на поддержание стабильности в соотношении запасных и структурных липидов, способствующей, вероятно, более высоким темпам роста рыб. Сравнительно высокие значения этого индекса (2,59) у молоди лосося из опытных бассейнов в октябре согласуются с повышенной их массой (33,51 г.) в этот период. В рамках настоящего эксперимента показано, что одним из основных признаков смолтификации является достижение мальками определенных, модальных размеров, что было установлено у рыб в июле, при этом происходит снижение запасных липидов – ТАГ, ЭфХС. Однако, следует отметить, что мальки в июле пока еще не достигли окончательной физиологической сформированности: повышения типичных для морских рыб, 22:6n-3 и 20:5n-3 ЖК, роста коэффициента 16:0/18:1n-9, характеризующего интенсивность их метаболизма, снижения МНЖК (в основном олеиновой 18:1n-9 ЖК), которые активно используются молодью при полной смолтификации, что было показано нами ранее при изучении смолтификации у дикой молоди. Ферменты углеводного обмена. Молодь лосося из опытного бассейна № 4, которая непрерывно находилась при постоянном освещении на протяжении всего периода отбора проб и в предшествующий зимний период отличалась от молоди из других бассейнов сравнительно низким уровнем активности цитохромоксидазы ЦО (фермент аэробного метаболизма углеводов) и альдолазы, отражающей уровень использования углеводов в гликолизе. При этом активность альдолазы в мышцах рыб из этого бассейна была несколько ниже в мае, июле и августе, что согласуется с изменениями в содержании запасных липидов (ТАГ) и указывает на использование их в энергетическом обмене. Более низкий уровень аэробного обмена в мышцах не был связан с изменениями темпов роста этих рыб, которые, наоборот, были выше, поэтому можно предположить участие этого фермента в адаптационных перестройках мышечного метаболизма, связанных с постоянным искусственным освещением в течение года. Реакция рыб из второго бассейна на введение постоянного освещения с мая 2019 года со стороны энергетического обмена выражалась в увеличении активности ЛДГ в мышцах по сравнению с контролем. Введение постоянного освещения с мая 2019 (бассейны 2 и 3) способствует продлению периода роста рыб в осенний период, сопровождаемому увеличением активности ЦО в мышцах по сравнению с контролем в этот период. Несмотря на различия в уровне активности ферментов аэробного и анаэробного обмена между молодью из контрольных и опытных бассейнов, динамика активности этих ферментов остается одинаковой, что указывает на то, что дополнительное освещение не влияет на характер регуляции аэробного и анаэробного обмена в течение выростного периода. Экспрессия генов регуляторов мышечного роста. Молодь лосося возраста 1+ из опытных бассейнов № 3 и 4, которая росла при постоянном освещении в предшествующее лето, в мае отличалась более высоким уровнем экспрессии мРНК мышечных белков (MyHC, MyoG, MyoD1b, а также MSTN-1b), что согласуется и с более высокой массой этих рыб в начале мая. Характер изменения уровня экспрессии гена миозина (MyHC) у рыб из контрольного бассейна отличался от такового у рыб из остальных бассейнов, растущих в условиях постоянного освещения с мая. В то время, как у рыб из контрольного бассейна экспрессия MyHC снижалась к августу, у остальных – оставалась на одном уровне. Эти результаты согласуются с более низкими темпами роста рыб из первого бассейна. Исследование показало, что существуют определенные сезонные паттерны в одновременной экспрессии нескольких мышечно-специфических генов. Для всех исследуемых бассейнов было характерно увеличение уровня экспрессии мРНК MyoG и снижение уровней экспрессии мРНК генов Myf5 и MyoD1b. В целом полученные данные показывают, что дополнительное освещение влияет на регуляторные механизмы роста мышц у рыб. Таким образом, результаты изучения биохимического статуса (липидов и их классов и фракций, жирных кислот, ферментов углеводного обмена и экспрессии генов мышечного роста) у молоди атлантического лосося возраста 1+ , выращиваемой в течение мая - октября в искусственных условиях, свидетельствуют о том, что в условиях светового режима 24С:0Т (особенно в бассейне № 4) повышение (по сравнению с контролем) размерно-весовых характеристик молоди сопровождается количественными и качественными изменениями исследуемых биохимических показателей, свидетельствующими об адаптационных метаболических перестройках в организме при использовании вышеназванного фотопериода. Эти показатели можно рассматривать в качестве дополнительных индикаторов степени готовности годовиков лосося к смолтификации (готовности к переходу в морскую среду обитания) в сроки, сопоставимые с природными популяциями. 2. В октябре 2019 г. при выполнении проекта в природных условиях были отловлены производители атлантического лосося (р. Сума бассейна Белого моря), проведена биохимическая характеристика зрелой, готовой к оплодотворению икры лосося. Показано, что большинство показателей липидного и ЖК метаболизма, а также активность ферментов углеводного обмена преднерестовой икры атлантического лосося имеют характерные для, исследуемой нами ранее зрелой икры диких популяций, значения. Результаты вариационного анализа исследуемых показателей в неоплодотворенной икре лосося указывают на наличие биохимической разнокачественности. При этом, подтверждена стабильность (отсутствие достоверных различий между индивидуальными пробами икры) общих ФЛ, а также индексов (n-3)/(n-6) ПНЖК и 20:4(n-6)/20:5(n-3), что позволяет обсуждать генетическую детерминированность отдельных метаболических реакций липогенеза и его сопряженность с общим ходом пластического обмена. Гистоморфологическая оценка состояния зрелых яйцеклеток также демонстрирует состояние "нормы". Установленные аномалии (в строении и структуре оболочек) описаны для очень небольшой доли яйцеклеток. 3. На рыбоводном заводе подготовлена экспериментальная площадка (бассейны, оборудование и др.) для проведения экспериментов по влиянию лазерного излучения на рост и развитие молоди лосося. Икру лосося оплодотворили и заложили на инкубацию в контрольные и экспериментальные бассейны. В экспериментальные бассейны помещали икру, обработанную лазером. Проведено облучение партии икры рыб низкоинтенсивным электромагнитным излучением (гелий-неоновый лазер (ГН-40). Исследования влияния лазерного излучения на рост и развитие икры, личинок и молоди лосося запланированы на 2020-2021 г.г. Страница проекта РНФ в сети Интернет: http://biochemistry.krc.karelia.ru/section.php?plang=r&id=3573

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном году проведены экспериментальные работы на Выгском рыбоводном заводе ФГБУ «Карелрыбвод» (п. Сосновец Беломорского района, РК) по влиянию на рост и развитие икры атлантического лосося: 1 - электромагнитного облучения (He-Ne лазер, 0,63 мкм, 1,5*10-2 Дж/см2,) на стадии дробления икры; 2- различных световых режимов: круглосуточное освещение (LD 24:0); 12 часов свет: 12 – темнота (LD 12:12); имитированное естественное освещение (LD Natural); контрольный – обычные условия освещения завода без дополнительного освещения. Все остальные условия содержания для всех бассейнов каждой возрастной группы были одинаковыми. Кроме того, дополнительно к плану, заявленному на 2020 г., в октябре 2020 г. была собрана икра популяции атлантического лосося реки Индёра (бассейн Белого моря), оплодотворена и перевезена на форелевое хозяйство (район Ладожского озера), одна партия икры на стадии дробления облучена лазером, вторая служила как контроль. Результаты этого эксперимента будут отражены в отчете 2021 г. и проанализированы в сравнительном аспекте с аналогичными результатами, полученными в 2019-2020-2021 г.г. для лосося, выращиваемого на Выгском рыбоводном заводе. В отчете представлены результаты ихтиологических наблюдений, биохимических и молекулярно-генетических исследований: общих липидов (ОЛ), общих фосфолипидов (ФЛ), моноацилглицеринов (МАГ), диацилглицеринов (ДАГ), триацилглицеринов (ТАГ), эфиров холестерина (ЭХС), холестерина (ХС), свободных жирных кислот (СЖК), отдельных фосфолипидных фракций – фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилсерина (ФС), фосфатидилинозитола (ФИ), лизофосфатидилхолина (ЛФХ), сфингомиелина (СФМ) жирных кислот (ЖК) общих липидов, активности ферментов цитохромоксидазы (ЦО), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), 1-глицерофосфатдегидрогеназы (1-ГФДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), альдолазы в икре на стадии бластулы и активности ферментов ЦО, ЛДГ, альдолазы и уровня экспрессии генов мышечных белков MyHC, MyoG, MyoD1, Myf5, MSTN в мышцах сеголеток. Полученные результаты. 3. Анализ ихтиологических наблюдений молоди лосося в первый год жизни свидетельствует о стимулирующем влиянии лазерного излучения малой мощности на развитие рыб. Личинки лосося, выращенные из оплодотворенной икры, облученной лазером на этапе дробления, имели повышенные показатели весового роста и низкие показатели смертности по сравнению с контролем (2,6 г- при «отходе» 0,07%, против 1,9 г при «отходе» 0,15% в контроле). Это подтверждается результатами исследования биохимических и молекулярно-генетических показателей состояния икры в начале эмбриогенеза (бластула) и сеголеток (0+) лосося. Обнаружено снижение содержания ОЛ, в том числе ДАГ, ТАГ, ХС и восков в опытных вариантах икры и молоди лосося. У сеголеток экспериментальной группы содержание ФЛ остается на сравнительно высоком уровне, а содержание минорных МАГ повышено. В целом, различия в липидном профиле между опытными и контрольными вариантами обнаруживались в начале развития (бластула) и сохранялись у выклюнувшейся личинки (сеголетки, возраст 0+) лосося. Снижение содержания структурного липида – ХС у икры на стадии бластулы и у сеголеток 0+ при лазерном облучении может влиять на функциональную активность мембраносвязанных ферментных систем и рецепторов, на процессы ионной проницаемости биомембран для метаболитов, воды и кислорода, интенсивность которого особенно возрастает при активном питании на этапе сеголеток. Механизм лазерной биостимуляции включает активацию энергетики клеток при усилении синтеза АТФ в митохондриях, а также влияет на насыщение тканей кислородом, на что указывают результаты анализа активности ферментов углеводного и энергетического метаболизма. Уровень активности ЦО, Г6ФДГ, 1-ГФДГ в оплодотворенной икре на стадии бластулы, обработанной лазером, был достоверно выше по сравнению с контролем. Это указывает на то, что в результате обработки икры лазером имеет место интенсификация аэробного, пентозо-фосфатного пути и пути синтеза глицерофосфата. В ходе пентозо-фосфатного пути образуются пентозы, необходимые для синтеза нуклеиновых кислот и восстановительные эквиваленты НАДФН. Установлены различия между сеголетками из опытного и контрольного вариантов в экспрессии генов некоторых факторов регуляции миогенеза. Так, уровень эспрессии MyoG, MyoD1 был выше у сеголеток из контрольной группы. Этот результат позволяет предположить, что сеголетки могут отличаться между собой по типу процессов миогенеза (гиперплазии и гипертрофии). 4. Новые, дополняющие ранее полученные, результаты влияния различных световых режимов на рост и развитие молоди (сеголеток) лосося в период с августа по октябрь свидетельствуют о том, что введение в технологический процесс выращивания молоди круглосуточного освещения (LD24:0) оказывает положительный эффект на прирост массы и длины у сеголеток. Этот эффект наиболее ярко обнаружился в октябре при снижении температуры воды до 4,2-4,0оС. При других выбранных режимах (LD 12:12 и LD Natural) в этот период отмечено снижение темпов роста сеголеток (достоверно относительно контроля). Показатели липидного статуса личинок лосося из опытных и контрольных бассейнов изменялись в разной степени в зависимости от сезона (температура) и от режима фотопериода. Следует отметить, что наиболее важное значение имеет не просто общее количество структурных и запасных липидов, а их соотношение, а также изменение их доли в общих липидах (ОЛ). Более высокая скорость роста мальков при круглосуточном освещении совпала с повышенными показателями индексов ЭХС+воска+ТАГ/ФЛ+ХС и ЭХС+воска+ТАГ/ОЛ (до 2,9 и 0,68, соответственно), что свидетельствует об их высоком энергетическом потенциале по сравнению с таковыми при режимах LD12:12, LD Natural и контроле (2,76 и 0,66; 2,66 и 0,65; 2,48 и 0,65, соответственно), а также указывает на доминирующий рост запасных липидов по отношению к структурным и суммарным липидам. что влияет на активность мембранных ферментов и в целом на обменные процессы. Вариации индекса ХС/ФЛ у сеголеток (от 1,09 - в контроле до 0,92-1,03-0,98 при трех режимах фотопериода) свидетельствуют об участии этих структурных липидов в процессах адаптации и указывают на один из путей регуляции состояния микровязкости биомембран. Данный аспект связан, в основном, с повышением запасных ЭХС (в 1,64-1,72 раза), а также восков (при LD12:12 и «натуральный»), вариациями ТАГ и снижением в разной степени структурных ФЛ и ХС, что обеспечило сохранение энергетического потенциала у рыб в октябре, особенно при режиме LD24:0. Известно, что ЭХС являются важной формой депонирования ХС и долгосрочного энергетического источника (ЖК) в клетках печени, коры надпочечников, половых желез (Lochmann et al., 1995). Из этих депо холестерин используется для синтеза желчных кислот и стероидных гормонов (Лопухин и др.,1985). Снижение в октябре у сеголеток структурных липидов (ФЛ и ХС) при всех световых режимах (по сравнению с контролем), в большей степени вызвано влиянием фотопериода и в меньшей – температурного фактора, так как в контрольных вариантах отмечен их рост. Достоверное снижение запасных ТАГ у сеголеток осенью при режиме LD24:0 (по сравнению с контролем) можно объяснить усилением процессов деацилирования и положительной их корреляцией с ростом содержания СЖК, ДАГ и ФЛ. Известно, что СЖК и диацилглицерины (ДАГ) являются активными липидными компонентами, которые включаются в обменные реакции между структурными и запасными липидами и их направленность зависит как от внутренних, так и внешних факторов среды. В жирнокислотном спектре общих липидов сеголеток лосося в летне-осенний период доминировали моноеновые жирные кислоты (МНЖК). Выявляя и отслеживая динамику тех МНЖК, которые имеют пищевое происхождение, можно связать их повышение у личинок с положительным влиянием режимов фотопериода на процессы усвоения корма, в составе которого присутствуют эти ЖК. В составе суммарных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) у сеголеток 0+ лосося повышена доля физиологически значимой 22:6n-3 ЖК и ее содержание в отношении ЖК-предшественников. Полученные результаты могут указывать на регуляцию процессов биосинтеза ПНЖК в части синтеза и расходования физиологически значимых и эссенциальных ЖК в ряду «20:5n-3, эйкозапентаеновая кислота → 22:5n-3, докозапентаеновая кислота → 22:6n-3, докозагексаеновая кислота» у сеголеток при данных режимах освещения. Причем состав и содержание липидов (в большей степени запасных) у рыб в условиях искусственного разведения может модулироваться уровнем и специфическими особенностями липидов, которые поступают в составе корма, а также активностью ферментов (липогенеза). Повышенные уровни активности ЛДГ обнаружены у рыб из бассейнов с естественным (LD Natural), и постоянным режимами освещения (LD 24:0) в августе. Самые высокие значения активности ЦО установлены в мышцах сеголеток, выращиваемых при постоянном освещении. Наиболее высокая активность альдолазы наблюдалась у рыб, выращиваемых при LD Natural (в августе и сентябре) и LD 12:12 (в сентябре), по сравнению с таковой у рыб из контрольной группы (без дополнительного освещения). Наблюдалась сезонная динамика в активности ферментов, схожая для рыб, выращиваемых при разных режимах освещения. На протяжении всего эксперимента изменения уровней активности ЛДГ и альдолазы имели схожий (сезонный) характер - более высокие значения показателей отмечались в сентябре, по сравнению с августом, и более низкие - в октябре, по сравнению с сентябрем, что связано со снижением темпов роста в октябре. В августе установлены различия между группами сеголеток по уровню экспрессии мРНК MyHC . При этом у рыб, выращиваемых при имитированном естественном режиме (LD Natural), уровень экспрессии этого гена был выше по сравнению с таковым у сеголеток при постоянном освещении (LD 24:0). При этом уровень экспрессии MyoG и MSTN1a также были выше у рыб при режиме (LD Natural). В другие месяцы различий в экспрессии гена тяжёлой цепи миозина MyHC у рыб, выращиваемых при разных режимах, установлено не было. Поскольку в сентябре-октябре различий в экспрессии мРНК MyHC установлено не было, а темпы роста были выше у рыб при постоянном освещении, то можно сделать предположение, что рыбы отличаются по соотношению процессов синтеза-распада белка, и у рыб при режиме LD 24:0, вероятно, преобладают процессы биосинтеза. Сезонная динамика экспрессии генов имеет сходство у личинок для всех режимов освещения, а именно – повышение экспрессии MyoG и MyoD1a, снижение Myf5 и MyoD1b к концу октября. Эти результаты указывают на существование сезонных паттернов в процессах регуляции миогенеза. Таким образом, результаты изучения влияния исследуемых физических факторов (электромагнитное облучение икры на стадии раннего дробления, определенный режим фотопериода) на рост атлантического лосося в период раннего развития свидетельствуют об увеличении темпов роста и выживаемости (низкой смертности) личинок, что обусловлено метаболическими изменениями их биохимического статуса. Экспериментальные данные дают основание сделать предположение о том, что подбором оптимальных значений температуры, фотопериода и электромагнитного воздействия в ранний период развития можно добиться наилучшего роста молоди лосося, готовой к выпуску и это может способствовать снижению потерь рыбоводной продукции при искусственном воспроизводстве. Эффекты воздействия исследованных физических факторов, обнаруженные для сеголеток, повышают адаптивные способности молоди лосося и могут отразиться на ее дальнейшем развитии (сеголетка-пестрятка-смолт), повлиять на процессы регуляции потребления пищи, ее эффективную конвертацию и метаболизм и, в конечном счете, - на сроки смолтификации рыб, готовность смолтов к переходу в морскую среду, что имеет большое практическое значение для пополнения природных популяций лосося. Информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: 1. 5 июля 2020 г. Луч света в царстве атлантического лосося на открытом портале «Научная Россия» https://scientificrussia.ru/articles/luch-sveta-v-tsarstve-atlanticheskogo-lososya 2. 28 июля 2020 г. О реализации проекта РНФ 19-14-00081 на странице КарНЦ РАН Вк https://vk.com/karrc?w=wall-165130519_2202 3. 04 августа 2020 г. Карельские биологи изучают, как сохранить атлантического лосося в водоемах на сайте Российского научного фонда (РНФ) https://rscf.ru/news/biology/luch-sveta-v-tsarstve-atlanticheskogo-lososya/?sphrase_id=79756 4. 05 августа О реализации проекта РНФ 19-14-00081 на странице РНФ Вк https://vk.com/rnfpage?w=wall-107824202_3544 5. Персональная страница проекта на сайте лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН http://biochemistry.krc.karelia.ru/section.php?plang=r&id=3573

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1.Результаты рыбоводно-ихтиологических и биохимических исследований свидетельствуют о том, что облучение малыми дозами монохроматического излучения гелий-неонового лазера (1.5∙10-2 Дж/см2) оплодотворенной икры атлантического лосося на этапе ранней бластулы оказывает стимулирующее влияние на адаптивные способности рыб в раннем онтогенезе, способствует увеличению темпов роста и выживаемости молоди (сеголеток), что в конечном счете приводит к снижению потерь рыбоводной продукции при искусственном воспроизводстве. Это особенно важно при заводском воспроизводстве рыб, так как их эмбриональное и постэмбриональное развитие не всегда протекает в благоприятных условиях. Икра лосося была облучена на этапе бластулы и было показано, что масса тел одновозрастных зародышей была достоверно больше, а смертность ниже, чем в контрольном варианте. Анализ динамики смертности и процессов роста лосося на втором году жизни в 2021 году показал, что молодь из экспериментальных бассейнов за период выращивания имела более высокую среднюю массу, а смертность рыб была значительно ниже (почти вдвое). На фоне отсутствия достоверных изменений в содержании ОЛ в процессе эмбриогенеза атлантического лосося в опытной и контрольной группах, количество ОЛ у личинки после выклева достоверно выше у экспериментальной группы (35,27% сухого вещества), за счет ТАГ и ХС (16% и 4,3%), по сравнению с контролем (30,67%, 10 и 3,4% сухого вещества). Личинки до и после выклева из экспериментальной группы характеризуются большими депо энергетических липидов, которые обеспечивают процессы адаптации и формирование компенсаторных реакций к изменению среды. Следует ожидать лучшую «стрессоустойчивость» или резистентность таких личинок к изменению факторов среды в виду их обеспеченности энергоемкими липидами. Интересно, что т.н. «разнокачественность» по липидному статусу у экспериментальной группы личинок снижена по сравнению с контролем, что может свидетельствовать о снижении амплитуды вариаций количественных значений липидов, что, в конечном счете, приводит экспериментальную группу к гомогенности. Качественный состав липидов у личинок экспериментальной группы также характеризуется более «выигрышным» набором универсальных липидов, таких как ЭфХС, обеспечивающих многообразие других функций липидов (регуляторная, информационная, биоэффекторная и др.) для реализации программы роста и развития личинки. ЖК-профиль атлантического лосося в эмбриогенезе и раннем постэмбриональном развитии характеризовался доминированием ПНЖК, за счет n-3 ПНЖК, за которыми «следовали» МНЖК и НЖК. Анализ тепловой карты, построенной на основании ключевых индивидуальных ЖК, указывает на ведущую детерминирующую роль 18:1(n-9), 22:6(n-3), 16:0 и 20:5(n-3) ЖК, содержание которых изменяется в процессе развития икры и личинок обеих групп, но для «экспериментальных» личинок, переходящих на экзогенное питание (сеголеток) установлен сравнительно более высокий уровень 22:6(n-3) и 18:1(n-9) ЖК. Выявлена выраженная метаболическая активность путей обмена липидов и ЖК-компонентов сеголеток из экспериментальной группы, а также «умение» включать нужные процессы конвертации в условиях эндогенного дефицита эссенциальных (n-3) ПНЖК, что является залогом дальнейшей успешной реализации программы смолтификации лососевых рыб при смене образа жизни с пресного на морской. Впервые был проведен масс-спектрометрический анализ протеома икры лосося на стадии бластулы, который выявил для образцов из контроля и опыта (облучение лазером) 131 белок, из которых 48 были достоверно идентифицированы минимум по двум пептидам (включая гомологичные) с использованием программы MaxQuant и базы данных UniProt с ограничением по видовой принадлежности (сем. Salmonidae). Используя язык программирования R для разведочного и статистического анализа данных, было установлено, что доминирующим белком (в количественном отношении) является Phosvitin, основной фосфопротеин икры. Качественных различий в протеоме икры лосося контрольной и облученной лазером групп на исследуемой стадии развития не установлено. При этом, с помощью метода стандартизации данных по z-оценке выделено 10 белков, количественное содержание которых изменялось между контрольными и опытными группами. У опытной группы икры лосося отмечены снижение концентрации Pentaxin и повышение Cathepsin D и Alpha-1-antitrypsin homolog. Опираясь на данные кластерного анализа для контрольных и опытных образцов икры по показателям изменения содержания всех 48 белков и по отобранным 9 белкам (в данном анализе исключили белок фосфитин, в виду его высокой концентрации), можно предположить, что эффект воздействия лазерного облучения на икру лосося на стадии бластулы затрагивает метаболические процессы с участием данных белков. МС-спектрометрический анализ протеома сеголеток выявил 2018 белков, из которых 49 были уникальными для контрольной группы, а 39 – для опытной. Из 2018 идентифицированных белков мышц сеголеток значимому количественному изменению подвергались 70 белков. Применив метод стандартизации данных по z-оценке из 2018 белков выделено 7 белков (в основном принадлежащих к группе белков-гистонов), концентрация которых была максимальной в опытной и контрольной группах. Все 7 выделенных белков изменяют свою концентрацию в образцах при воздействии лазерного излучения. Лазерное излучение оказывает сильный эффект на содержание гистоновых белков, участвующих в конденсации хроматина, а также на «мышечные» и «энергетические» белки, участвующие в структурных, двигательных и энергетических процессах. Результаты изменения активности ферментов энергетического и углеводного обмена (ЦО, ЛДГ, 1-ГФДГ, Г6ФДГ, альдолазы) в икре, облучённой лазером и в личинках лосося после выклева также свидетельствуют о положительном эффекте обработки икры лазером на стадии бластулы. Показано усиление аэробного обмена и интенсификации процессов биосинтеза. В частности, в икре на стадии бластулы в опытной группе, уровень активности ЦО был выше в 1,5 раза (p<0,05), уровень активности 1-ГФДГ - в 1,4 раза (p<0,05), по сравнению с контрольной группой, а у личинок из экспериментальных бассейнов сразу после выклева активность ЦО была в 1,6 раза (p<0,05) выше, чем у особей из контрольной группы. При этом коэффициент ЛДГ/ЦО (отношение анаэробного и аэробного синтеза АТФ) у личинок, выклюнувшихся из икры, обработанной лазером, был ниже такового у личинок из контрольной группы в 1,5 раза (p<0.05). По мере развития личинок и при переходе их на экзогенное питание у рыб в обеих группах наблюдалось достоверное повышение уровней активности всех исследуемых ферментов, что, вероятно, связано как с необходимостью поддержания высокого уровня метаболизма, направленного как на энергообеспечение физической активности, так и на процессы биосинтеза. Данные по суммарному отходу икры и личинок лосося за инкубационный период (октябрь 2020 - июнь 2021) указывают на низкий (в 1,5 раза ниже) отход в экспериментальной группе по сравнению с контролем, что свидетельствует о том, что электромагнитное облучение икры способствует снижению смертности. 2.Результаты исследований по влиянию электромагнитного излучения на рост и развитие икры и личинок лосося, развитие которых проходило в условиях Выгского рыбоводного завода (бассейн Белого моря) согласуются с данными, полученными в аналогичном исследовании на форелевом хозяйстве ООО «Мусталахти» (бассейн Ладожского озера). На стадии бластулы одну партии икры обработали лазером (He-Ne лазер, 0,63 мкм, 1,5*10-2 Дж/см2). Личинки лосося на этом хозяйстве проклюнулись уже в декабре (на Выгском заводе - в апреле, а переход на личинки на экзогенное питание был отмечен 1 июня), что, несомненно, связано с температурными условиями региона. Смертность личинок после выклева в опытной группе отсутствовала (в контрольном варианте - 10%). После выклева личинок лосося и их перехода на экзогенное питание, также как и ранее в эксперименте, проведенном на Выгском заводе, установлено, что масса и длина сеголеток была достоверно выше (в 1,6 раза) по сравнению с контролем. На биохимический анализ были отобраны пробы икры на этапах дробления-ранней бластулы, пигментации глаз, выклева и перехода личинок на экзогенное питание. Установлено, что количество ОЛ на стадии бластулы в экспериментальной группе незначительно, но достоверно снизилось (в 2 раза), за счет ФЛ (преимущественно ФХ), а также ДАГ, ТАГ и ХС по сравнению с контролем, в то время как индексы интенсивности липидного обмена (ТАГ/ФЛ, ЭХС/ХС) были выше в 1,5 раза, что указывает на интенсификацию липогенеза в сторону повышения расходования липидов для поддержания процессов пластического обмена. Сходный результат получен и для икры лосося, облученной на стадии бластулы, инкубация которой проходила в бассейнах Выгского рыбзавода. Сеголетки экспериментальной группы отличались от контрольных особей пониженным содержанием ОЛ за счет ТАГ и ФЛ, более низким значением индекса ХС/ФЛ, пониженным содержанием олеиновой и пальмитиновой кислот (основных ЖК-компонентов энергетических липидов), повышенным содержанием эссенциальной ДГК по сравнению с ЭПК, пониженным количеством АРА (арахидоновой кислоты). Известно, что тканевые пулы АРА происходят из пищи и пищевой линолевой кислоты, которые трансформируются в нее в процессе элонгации – десатурации. Повышенная чувствительность биомембран к внешнему воздействию, в том числе электромагнитному, связана, прежде всего, с прямым воздействием этого фактора на физико-химические свойства липидов, которые создают особое микроокружение для нормального функционирования мембраносвязанных ферментов. Так, одной из функций мембран является их участие в биоэнергетических процессах и, прежде всего, в продуцировании АТФ на внутренней мембране митохондрий. Транспорт протонов в этом процессе во многом связан с составом мембранных липидов митохондрии. Многие ферменты энергетического обмена работают только в определенном по составу и физико-химическим свойствам липидном окружении, подтверждением этому служат данные об активности ферментов ЦО, ЛДГ, 1-ГФДГ, Г6ФДГ, альдолазы в икре, облучённой лазером, а после выклева - в мышцах личинок лосося. В частности, установлены различия между контрольной и экспериментальной группами икры по уровню активности 1-ГФДГ на стадии пигментации глаз. В икринках, облученных лазером, этот показатель был выше в 1,4 раза (p<0,05) по сравнению с таковым в контрольной группе, что может указывать на увеличение синтеза глицерофосфата, который может использоваться в синтезе структурных и запасных липидов. В мышцах рыб на личиночной стадии развития были выявлены различия по уровню активности ферментов некоторых путей окисления глюкозы. Так, у рыб из экспериментальной группы уровень активности ЛДГ был выше в 1,2 раза (p<0,05), а уровень активности Г-6-ФДГ – в 1,8 раза (p<0,05) по сравнению с таковыми показателями у особей из контрольной группы. Результаты могут указывать на то, что имеющиеся на данном этапе развития ресурсы (в том числе и за счет гидролиза желточного мешка) у личинок из экспериментальной группы, расходуются как на усиление процессов энергообеспечения, так и на процессы биосинтеза за счет интенсификации пентозо-фосфатного пути. 3.Результаты эксперимента, поставленного в 2021 г. на Выгском рыбоводном заводе, по совместному влиянию лазера и фотопериода LD 24:0 (Л+Ф) на молодь лосося (июнь-октябрь), обнаружили достоверные различия между опытными и контрольными группами сеголеток лосося по уровню активности ферментов аэробного и анаэробного обмена (ЛДГ, альдолазы, ЦО), которые наблюдались в мышцах уже в августе и согласовывались с данными по массе рыб в этот период. Можно предположить, что рыбы, подвергшиеся облучению на ранней стадии развития, в дальнейшем обладают большим адаптивным потенциалом на уровне энергетического обмена и за счет этого быстрее приспосабливаются к новым условиям освещения, тогда как сеголеткам из группы без облучения требуется для этого больше времени. Уже в августе также установлены различия между группами сеголеток по уровню экспрессии мРНК MyoG. Уровень экспрессии этого гена был выше в группе «Л+Ф» по сравнению с таковым у сеголеток в контрольной группе, содержащихся в бассейнах только с постоянным освещением «LD 24:0». Это может указывать на процессы регуляции мышечного роста у рыб из экспериментальных групп посредством гипертрофии мышечных волокон. Результаты изучения липидного статуса икры лосося позволяют сделать заключение о том, что облучение лазером икры на стадии бластулы имеет пролонгирующий и частично отложенный эффект, проявляющийся на более поздних стадиях развития (сеголетка), выражающийся в снижении метаболической и фенотипической разнокачественности молоди, а также в изменении липидного профиля (в пользу его качественных характеристик), интенсификации отдельных метаболических путей (конвертация (n-3)ПНЖК), значимых для реализации стратегии развития и поведения молоди при смене пресной среды на морскую. Установлено, что наибольшее количество ОЛ было у молоди группы «Л+Ф» (за счет ТАГ и ФЛ) и наименьшим – в контрольной группе (стандартная технология выращивания молоди). Наиболее значимой характеристикой ЖК-профиля молоди лосося группы «Л+Ф» являются высокие индексы конвертации 22:6(n-3)/20:5(n-3),а также повышенный уровень (n-3)ПНЖК. Подключение круглосуточного освещения к сеголеткам, выращенным из облученной икры, «поддерживает» способность молоди к биосинтезу (n-3) ПНЖК в зависимости от внутренних резервов и потребностей, а также от качества кормовой базы. Биологическая ценность 22:6(n-3) и 20:5(n-3) ЖК выше, чем 18:3(n-3) ЖК, что и стимулирует рост рыб. Известно, что отсутствие незаменимых ЖК в кормовом рационе рыб неизбежно приводит к замедлению их роста и низкой эффективности использования поступающей пищи, однако этими процессами можно «управлять» подбором физических факторов и их целевого применения на определенных стадиях раннего онтогенеза молоди лосося. Таким образом, данные рыбоводно-ихтиологических и биохимических показателей роста и развития оплодотворенной икры и молоди, развитие которых проходило в условиях стандартной технологии, а также при подключении круглосуточного искусственного света и облучения на стадии бластулы гелий-неоновым лазером низкой интенсивности (длина волны 632.8 нм) в оптимальном дозовом интервале (1.5∙10-2 Дж/см2), свидетельствуют о том, что исследуемые физические факторы оказывают влияние на биохимический статус икры и молоди лосося, следствием чего является повышение их массы, размеров, темпов роста, выживаемости и устойчивости к изменяющимся факторам среды. Можно полагать, что молодь, выпускаемая с рыбоводного завода, быстрее и успешнее адаптируется к переходу в морскую среду обитания.