Аннотация результатов, полученных в 2019 году
СОКРАЩЕНИЯ. ПТП-противотуберкулезные препараты, МИК – минимальная ингибирующая концентрация, МЛУ-множественная лекарственная устойчивость, ШЛУ – широкая лекарственная устойчивость, SNP-single nucleotide polymorphism (ОНП-однонуклеотидный полиморфизм), NGS-next generation sequencing, WGS-whole genome sequencing. Геномный анализ штаммов ранней древней сублинии генотипа Beijing и определение кластер-специфических мутаций. Первоначальная коллекция геномов (fastq) извлеченных из GenBank, Broad Institute, GMTV включала 3089 образцов, в том числе - 521 геном из Восточной и Юго-Восточной Азии (Япония, Китай, Корея, Вьетнам, Таиланд), и 1067 российских образцов. Из них, 117 геномов были отнесены к ранней древней сублинии с кодоном mutT4-48 дикого типа. Они представляли следующие страны и регионы: 27 – Корея, 20 - Россия, 28 - Китай, 36 - Япония, 1 - США, 5 - неизвестного происхождения. Филогенетический анализ SNP, охватывающих весь геном, подразделил все геномы ранней древней сублинии Beijing на 10 монофилетических клад: 5 клад принадлежали к подгруппе с интактным RD181, а другие 5 клад - к ветви с делетированным RD181. Профили 24-VNTR и сполиготипирования были получены для российских штаммов, и эта информация служила для корреляции ранее идентифицированных кластеров VNTR ранней древней сублинии Beijing с кладами на основе NGS, Кроме того, in silico сполиготипирование было сделано для всех геномов, включенных в древо. Это показало, что большинство изолятов имело профиль Beijing SIT1 (сигналы с 35 по 43), в то время как 4 изолята имели сполигопрофиль SIT269 (сигналы с 37 по 43). Для крупной ветви на древе, включающей только российские множественно-лекарственно устойчивые штаммы 1071-32-кластера были определены кластер-специфические ОНП (без учета генов резистентности). Суммируя, в межгенных участках было – 15 ОНП, в генах PE_PGRS и PPE – 10 (1 нонсенс, 6 миссенс в т.ч. две –со значимой заменой аминокислоты, и 3 сиинонимичные мутации), в других генах – 96, в том числе– синонимичных – 40, несинонимичных – 54, нонсенс – 2. Согласно функциональной категории, 96 мутаций выявлены в кодирующих участках. Их них, для мутаций, приводящих к значимым заменам аминокислот (индекс значимости 3 и 4), гены были в следующих категориях: Промежуточный метаболизм и дыхание – 6, Процессы, связанные с клеткой и клеточной стенкой - 4, Консервативные гипотетические белки - 2, Липидный метаболизм - 1. Метод детекции высокорезистентного кластера (1071-32-cluster ранних древних Beijing) в формате ПЦР в реальном времени. (эта часть плана выполнена раньше, чем запланировано) Выбор был сделан среди синонимичных мутаций с нулевым индексом значимости, представляющихся наиболее филогенетически нейтральными. На основе выявленных SNP, специфических для высокорезистентного кластера разработан метод детекции данного кластера в формате ПЦР в реальном времени с использованием LNA-модифицированных зондов. Метод находится в процессе оценки трех таких SNP, для выбора наиболее оптимального и последующей валидации на локальных коллекциях. Подача Заявки на патент запланирована на 1-й квартал 2020 года. Характеристика российских и зарубежных популяций Mycobacterium tuberculosis для выявления штаммов древней сублинии генотипа Beijing. Характеристика уральской коллекции M. tuberculosis Генотипирование выявило преобладание изолятов генотипа Beijing как среди впервые выявленных больных 75,8% (50/66), так и ранее пролеченных пациентов 83,7% (36/43). Генотип Beijing также доминировал в группах ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных больных туберкулезом. Beijing B0/W148 и Beijing 94-32 были преобладающими кластерами и были выделены у 50,0% (33/66) и 22,7% (15/66) впервые выявленных пациентов соответственно. Генотипирование изолятов Beijing по двум MIRU-VNTR локусам: MIRU26 и QUB26, позволило идентифицировать девять групп. Самая большая из них включала 39 изолятов группы Beijing B0/W148 и характеризовалась семью повторами в обоих локусах. Интересно, что 11 изолятов Beijing B0/W148 характеризовались необычными (для этого кластера) двумя повторами в локусе QUB26 (обозначены для краткости как «QUB26/2»). Большинство изолятов кластера Beijing94-32 характеризовались пятью повторами в MIRU26 и восемью повторами в QUB26. Сполиготипирование изолятов non-Beijing подразделило их на девять SIT принадлежащих четырем генетическим семействам. Из них SIT35/Ural был самым крупным кластером и включал 9 (8,3%) изолятов. Сполиготипы SIT 262/Урал; SIT 42, SIT252, SIT254 / LAM; SIT334/Т1; SIT182/Haarlem; SIT402/Unknown были представлены одним или двумя изолятами. Среди ВИЧ-положительных пациентов только SIT35/Ural был обнаружен в 4 (9,5%) случаях. Кластер Beijing B0/W148 объединял только МЛУ, ШЛУ и полирезистентные изоляты. Все 11 изолятов B0/W148 QUB26/2 имели сходный профиль мутаций, связанных с резистентностью к изониазиду (katGS315T), рифампицину (rpoBS531L), этамбутолу (embBM306V) и аминогликозидам (eis-g10a). У трех изолятов также были обнаружены мутации устойчивости к фторхинолонам, а именно: gyrAD94G, gyrAA90V и gyrBI525L. Изоляты non-Beijing были в основном чувствительны к противотуберкулезным препаратам. Изоляты МЛУ были обнаружены только в семействе Ural у SIT35 и SIT262, но SIT35 включал также и чувствительные изоляты. Только один изолят c ШЛУ (SIT252 / LAM) был обнаружен среди изолятов non-Beijing. Выводы. В настоящем исследовании мы охарактеризовали популяционную структуру M. tuberculosis на территории Новоуральска. Генотипирование позволило выявить доминирование изолятов наиболее известного в России варианта M. tuberculosis, кластера Beijing B0/W148, на долю которого приходится высокий процент случаев МЛУ-ТБ среди новых случаев туберкулеза. Характеристика популяции M. tuberculosis в Бурятии: необычная структура с присутствием раннего древнего кластера Beijing ДНК 381 штамма M. tuberculosis генотипировали по 24 локусам MIRU-VNTR согласно протоколу сайта MIRU-VNTRplus http://www.miru-vntrplus.org/ и областям RD 105, 207 и181. Генотип Beijing составлял большинство штаммов (64,1% 216/337 в 2010-2014 и 75% в выборке из 44 изолятов 2019 г.). Штаммы без делеций в RD 105/207 были идентифицированы как LAM – 16,9% (57/337); Ural – 7,4% (25/337); T-3,9 % (13/337). Общая доля наиболее распространенных субтипов Beijing – CC1 и CC2/W148, была ниже, чем в Иркутской области и Саха (Якутии) (Жданова С., и др., 2017). Эти два субтипа составили суммарно 56,0% штаммов Beijing (121/216), что не является характерным для структуры популяции МБТ, циркулирующих на территории России (Mokrousov I. et al., 2012; 2015). Описанная структура штаммов Beijing носит отличный от других территорий вид в связи со значимым присутствием других, характерных для Бурятии вариантов возбудителя. В исследуемой выборке субтип Beijing MIT642 (ранняя древняя сублиния Beijing), обнаружен в 15,4% (52/337), Этот субтип встречался среди изолятов, полученных от впервые выявленных больных ТБ (3,4% - 24/186), так и у пациентов с повторными случаями лечения (7,0% - 28/147). При этом частота его выявления среди больных с первичным и хроническим ТБ, значимо не отличалась (χ2=0,2,35; р=0,125). Национальная принадлежность больных туберкулезом, вызванным субтипом Beijing MIT 642, не имела значения: значимые различия в частоте обнаружения в группе славян (20/159) и бурят (8/70) отсутствовали (χ2= 0,001 с поправкой Иейтса, р>0,05). Такое равномерное распределение штаммов субтипа Beijing MIT 642, может говорить о его давней циркуляции, что позволившей распространиться ему в обеих этногруппах. Профили Beijing MIT 642, которые присутствовали только в единичных случаях в коллекциях из других регионов России (Mokrousov I. et al., 2015), можно рассматривать как эндемичные для Забайкалья (Бурятия и Забайкальский край). Наличие единого для разных этнических групп резервуара инфекции определяют и общие кластеры MIRU-VNTR-24 профилей штаммов Beijing MIT 642. Высокий уровень кластеризации (CR=0,73) выявлен наряду с обнаружением двух крупных групп с идентичными профилями 224233342644425173343732 (24 штамма) и 224233342644425173343832 (13 штаммов). При этом все профили по 24 MIRU-VNTR локусам были отнесены к клональному комплексу BL7 (Merker M. et al., 2015), включающему предковые (=древние) формы генотипа Beijing. Характеристика коллекции M. tuberculosis в Эстонии Выборку для исследования составили штаммы M. tuberculosis полученные от 161 впервые выявленного больного туберкулезом в 1999 г. Анализ коллекции 1999 года был проведен для анализа динамических изменений и будет дополнен анализом новой коллекции. В результате генотипирования 28,6% (46 из 161) штаммов M. tuberculosis были отнесены к генотипу Beijing. Кластеры Beijing B0/W148 и 94-32 были идентифицированы в 13,7% (22/161) и 8,7% (14/161) случаях; соответственно. Из 161 штамма M. tuberculosis лекарственной чувствительностью обладали 106 (65,8%), МЛУ была выявлена у 23 (14,8%) штаммов. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) выявлена у 78,3% (18/23) штаммов генотипа Beijing и соответственно у 21,7% (5/23) штаммов других генетических семейств. МЛУ чаще обладали штаммы кластера В0/W148 (68,2%, 15/22), чем другие штаммы Beijing (13,0%, 3/23, P = 0,0006). У 115 штаммов non-Beijing идентифицирован 31 сполиготип (SIT) разных генетических линий: T (24,2%), Haarlem (17,4%), Ural (14,3%), LAM (11,8%), X (0,6%). Четыре изолята имели новые сполиготипы, не найденные в SITVIT_WEB. Один изолят (SIT11) был отнесен к EAI3-IND. Структура популяции M. tuberculosis в Албании: место и роль российских эпидемических генотипов Албания является балканской страной с умеренной/низкой заболеваемостью туберкулезом (ТБ) и очень низкой распространенностью лекарственно-устойчивого ТБ. Мы проанализировали общенациональную многолетнюю коллекцию Mycobacterium tuberculosis, чтобы выявить возможные динамические тенденции развития туберкулеза в Албании с акцентом на лекарственную устойчивость и эндемичные / эпидемические клоны в т.ч. происходящие из стран бывшего СССР. После Второй мировой войны Албания тесно взаимодействовала с Советским Союзом в 1948–1960 годах и с Китаем в 1960–1970-х годах и имела ограниченные связи с другими странами до 1990-х годов. Мы предположили, что такая демографическая история могла повлиять на популяционную структуру M. tuberculosis в Албании. 745 изолятов, собранных в 2007–2011 гг., были разделены на 107 сполиготипов и 353 MIRU-типа. На основании филогенетического анализа MIRU-VNTR изоляты были отнесены к следующим линиям / семействам: Lineage 2 (5 изолятов Beijing), Lineage 3 (1 CAS-Delhi) изолят) и, Lineage 4 (Cameroon, Uganda, Ghana; NEW-1-related; Ural, Haarlem, LAM, S, TUR; и неклассифицированные изоляты). Большинство изолятов (454/745) были промежуточно расположены на глобальном дереве VNTR и не группировались с каким-либо референтным профилем; они были отдаленно связаны с семействами Lineage 4, и мы определили их как «неклассифицированные изоляты L4». Значительно более высокая доля лекарственной устойчивости наблюдалась для (i) генотипа Beijing по сравнению со всеми другими изолятами (60%, P=0,008), (ii) «неклассифицированных L4» по сравнению со всеми другими изолятами (13,9%, P=0,04) и (iii) SIT2936 по сравнению с другими «неклассифицированными L4» (34,3%, P=0,0006). Большинство изолятов LAM (33/49) и Beijing (3/5) принадлежали к типам VNTR, характерным для России и стран бывшего Советского Союз На основании кластеризации 24-MIRU-VNTR 5 изолятов были отнесены к генотипу Beijing. Три штамма имели особые профили Mlva, которые привлекли внимание в последние годы. Один восприимчивый штамм имел тип Mlva 94-32 и, таким образом, принадлежал к среднеазиатско-русской кладе, которая широко распространена в странах бывшего СССР и связана с МЛУ в Центральной Азии. Два других штамма Beijing принадлежали к кластеру Mlva 1071-32, который недавно был описан как высокоустойчивый генотип в России в пределах ранней древней сублинии Beijing (Мокроусов и др., 2019). Этот тип также был описан в предыдущем албанском исследовании (Tafaj et al., 2009), в Греции (Ioannidis et al., 2017), и в Сербии (Merker et al., 2015). Однако два из трех албанских штаммов были лекарственно-чувствительные. Учитывая специфичность типов Mlva 94-32 и 1071-32 для России и бывшего СССР, эти изоляты могли попасть в Албанию или недавно с мигрантами из стран бывшего СССР или из Советского Союза в более ранний период. Албанские изоляты были в основном чувствительны и, следовательно, не могли произойти из МЛУ-ассоциированных изолятов, циркулирующих в настоящее время в странах бывшего СССР и среди мигрантов бывшего СССР в Греции. Напротив, в 1948-1960 гг. имело место тесное взаимодействие и обмен между Албанией и Советским Союзом, когда тысячи албанцев учились в Советском Союзе (Krisafi, 2015). Соответственно, представляется правдоподобным, что эти штаммы были завезены в Албанию 70-80 лет назад, в дальнейшем распространялись в тех же условиях общественного здравоохранения, что и местный пул штаммов, и, как местные штаммы, в основном остались чувствительными к антибиотикам. Наши результаты подчеркивают специфическую природу популяции M. tuberculosis в Албании, в которой преобладают местные и неклассифицированные генотипы в Lineage 4, а также характерны европейские генотипы и эпидемически значимые клоны, происходящие из стран бывшего Советского Союза. В то же время эти импортированные клоны остаются лекарственно-чувствительными. Анализ генотипа Beijing в центральной Америке: возможная связь со странами бывшего СССР или Восточной Азии Целью исследования было охарактеризовать наиболее распространенный кластер генотипа Beijing в провинции Колон (Панама). ДНК 42 изолятов M. tuberculosis (г. Колон, Панама, 2018 г.) была подвергнута генотипированию по 24 локусам MIRU-VNTR (плюс 4 гипервариабельных локуса) и полногеномному секвенированию на платформе MiSeq. Для сравнения использовали глобальную коллекцию NGS (> 9000 загруженных геномов) и базы данных MIRU-VNTR (> 8000 изолятов [Mokrousov, 2015; Merker et al., 2015]). Доминирующий в Панаме кластер внутри генотипа Beijing принадлежал современной сублинии генотипа Beijing (NTF::IS6110, мутация в ogt12) и ее ветви Asian African 3, эндемическому и мало распространенному генотипу в Восточной Азии, также описанному в южной части Африки. На основании 24-MIRU-VNTR типирования и сравнения с базами данных, панамские штаммы генотипа Beijing были отнесены к трем близкородственным типам Mlva (MIRU-VNTRplus): 19 изолятов – тип 1048-33, 2 изолята - тип 1048-32, 1 изолят – тип 342-33. При сравнении с глобальной выборкой 24-MIRU Beijing (4987 изолятов) (Merker et al., 2015, Mokrousov, 2015) эти три типа были представлены в странах Восточной Азии, и в южной части Африки. УЧАСТИЕ В КОНФЕРЕНЦИЯХ: 2 пленарных доклада: 5th International congress of Moroccan Association of Microbiology (Ifrane, Morocco); VIII Конгресс Национальной Ассоциации Фтизиатров (Санкт-Петербург). 1 устный доклад: International Workshop "Next generation sequencing and bioinformatics tools for Mycobacterium tuberculosis drug resistance detection and epidemiological analysis" (Санкт-Петербург). 2 стендовых доклада: 40th Annual Congress of European Society of Mycobacteriology (Valencia, Spain); 50th World Conference on Lung Health (Hyderabad, India). СТАТЬИ Umpeleva T, Belousova K, Golubeva L, Boteva T, Morozova I, Vyazovaya A, Mokrousov I, Eremeeva N, Vakhrusheva D. Molecular characteristics of Mycobacterium tuberculosis in the “closed” Russian town with limited population migration // Infection Genetics and Evolution. Under Minor revision. Tafaj S, Mokrousov I, Borroni E, Trovato A et al. Peculiar features of the Mycobacterium tuberculosis population structure in Albania // Infection Genetics and Evolution. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2019.104136 In press.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью исследования является комплексный анализ биологических свойств новых высокорезистентных и потенциально эпидемических генотипов Mycobacterium tuberculosis для оценки их вирулентности, устойчивости, эволюционной истории и прогноза на будущее. Мы бы хотели подчеркнуть многовекторность проекта при логической взаимосвязи всех его компонентов. В 2020 году исследования велись по следующим крупным направлениям. - первичная характеристика новых региональных коллекций методами генотипирования (VNTR, сполиготипирование) для определения структуры всей популяции на уровне семейств, сублиний генотипов и субтипов в т.ч. для выявления российских кластеров ранних древних сублиний Beijing 1071-32 и 14717-15. - Полногеномный и филогенетический анализ штаммов древних сублиний Beijing (1) для выявления филогенетических нейтральных SNP-маркеров крупного резистентного российского кластера 1071-32 и (2) для определения SNP, приводящих к значимым аминокислотным заменам на основе анализа in silico, прежде всего в генах вирулентности, адаптации, синтеза клеточной стенки. Сборка и аннотация геномов штаммов двух кластеров и их депонирование. - Разработка метода РТ-ПЦР детекции Beijing 1071-32 и скрининг ретроспективных коллекций ДНК и анализ глобальной базы геномных данных генотипа Beijing для выявления Beijing 1071-32. Включение новых геномных данных в более полный филогенетический анализ для оценки времени возникновения кластера 1071-32. - Изучение скорости роста штаммов Beijing 1071-32 и 14717-15 в модели in vitro - Изучение вирулентности и летальности штаммов Beijing 1071-32 и 14717-15 в мышиной модели. Филогенетический анализ глобальной выборки штаммов ранней древней сублинии генотипа Beijing из России, Восточной и Юго-Восточной Азии локализовал российские изоляты в два монофилетических кластера со 100% бутстрап-поддержкой, которые соответствовали кластерам на основании VNTR-типирования, обозначаемым как Mlva 1071-32 и 14717-15, согласно международной номенклатуре MIRU-VNTRplus.org. Эти кластеры относились к сублиниям ранних древних Beijing 1 (интактный локус RD181) и 2 (del_RD181), соответственно. Все российские изоляты были множественно- или широко лекарственно-устойчивыми (МЛУ/ШЛУ) и имели определенный филогеографический аффинитет: кластер 1071-32 был выявлен в штаммах Европейской части России и Западной Сибири, тогда как кластер 14717-15 – в штаммах из Западной и, преимущественно, Восточной Сибири. Для более крупного российского кластера Beijing 1071-32 были определены кластер-специфические SNP, из которых 96 было в кодирующих последовательностях. На основе оценки индексов значимости замен, было выявлено 14 мутаций, приводящих к гипотетически значимым аминокислотным заменам. Далее влияние наиболее значимых мутаций на белковые структуры оценивали с помощью структурного анализа in silico и на основе оценки электростатического потенциала вокруг мутировавших аминокислот. В результате, значительного влияния на структуру и функцию для большинства исследованных аминокислотных замен выявлено не было. Помимо генетических полиморфизмов, приводящих к функционально значимым мутациям, описанным выше, для кластера Beijing 1071-32 также были выявлены филогенетические SNP, т.е нейтральные мутации с нулевой значимостью аминокислотной замены. На основе двух таких SNP был разработан метод детекции штаммов beijing 1071-32 в формате ПЦР в реальном времени с использованием LNA-зондов. Метод был оптимизирован на ДНК штаммов с имеющимися геномными данными и известными аллелями в таргетных генах/позициях. Далее метод был использован для скрининга ретроспективных и новых коллекций ДНК из различных регионов РФ и ряда стран Восточной Европы, Азии, Африки и Южной Америки для возможного выявления штаммов данного кластера. Запланирована подготовка заявки на патент поэтому мы не приводим подробностей о точных позициях данных SNP и структуре праймеров и зондов. Проведен скрининг выявленных филогенетических SNP кластера Beijing 1071-32 в глобальной базе геномов Beijing, включающей более 6000 геномов (файлов fastq). В результате проведенного анализа, были выявлены дополнительные геномы (номера доступа) штаммов кластера 1071-32 – штаммы из стран бывшего СССР (Азербайджана, Грузии, Таджикистана), а также из Китая, которые могут быть предковыми по отношению к данному кластеру. Эти геномы были включены в дополнительный анализ для оценки времени происхождения резистентного кластера 1071-32. Выявлена значительно большая, чем ожидалась, дивергенция штаммов из стран б. СССР. Этот результат будет перепроверен и мы планируем повторить все этапы биоинформационной обработки файлов начиная с файлов fastq/vcf и вплоть до построения минимальной сети. Разработанный метод РТ-ПЦР для детекции кластера Beijing 1071-32 на основе 2 снипов (см выше) был использован для скрининга новых и архивных коллекций ДНК из разных регионов России (Урал, Сибирь, Северо-Запад) и зарубежных. Предварительные результаты показывают российскую специфичность данного кластера, в то время как его выявление в единичных изолятах в Албании и Греции вероятнее всего связано с иммигрантами из стран бывшего СССР (изоляты в Греции) и возможно, перемещениями между соседними балканскими странами (между северной Грецией и Албанией). Также была подтверждена 100% специфичность и чувствительность данного метода для детекции кластера Beijing 1071-32. Проведены сборка геномов 2 штаммов кластера 1071-32, их аннотация и депонирование в GenBank. Короткие прочтения штаммов были собраны de novo, сборщиком Bandage v. 0.8.1. Покрытие генома составляло 31,9 x. Полученные контиги были аннотированы с помощью Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP). Для штамма 2044 общая длина генома составила 4,339,788 п.н. Геном содержит 4088 генов, из которых 4037 являются кодирующими (CDSs), 3898 -белок-кодирующими генами, 51 генами РНК, 139 — псевдогенами. Среди 51 гена РНК - 45 генов тРНК, 3 -некодирующих РНК (ncRNAs). Параллельно с вышеописанным анализом, члены научной группы в Екатеринбурге, Омске и Иркутске провели сбор новых коллекций изолятов M. tuberculosis и их базовую характеристику для дальнейшего анализа и выявления штаммов генотипа Beijing, его древних сублиний и резистентных кластеров 1071-32 и 14717-15. Одновременно с геномным и филогенетическим анализом, описанным выше, были проведены исследования по изучению биологических свойств двух российских резистентных кластеров в моделях in vivo и in vitro. Исследование вирулентности клинических изолятов при моделировании туберкулезной инфекции у мышей C57BL/6. По итогам оценки вирулентности клинических МЛУ изолятов 396y (Beijing 14717-15-кластер, Бурятия) и 6691 (1071-32-кластер, Омск) в сравнении с референс-штаммом M. tuberculosis H37Rv можно утверждать, что оба исследованных клинических штамма способны вызывать при внутривенном инфицировании мышей туберкулезный процесс с преимущественным поражением легких. Показано наличие корреляции между показателями летальности зараженных мышей тем или иным штаммом МБТ и тяжестью патологических изменений в легочной ткани, а также бактериальной нагрузкой в легких и селезенке. По совокупности показателей тяжести течения туберкулезного процесса (выживаемости, динамики массы тела, биометрических показателей, степени распространенности в легких очагов специфического воспаления и уровню обсемененности легких и селезенки МБТ) вирулентность клинического штамма M. tuberculosis 6691 была существенно ниже вирулентности стандартизованного штамма M. tuberculosis H37Rv. Вирулентные свойства клинического штамма 396y были выражены сильнее, чем у M. tuberculosis щтамма H37Rv. Прежде всего, это зафиксировано по динамике летальности мышей, согласно которой массовая гибель мышей, как и 100% летальность зафиксированы раньше именно в группе животных, зараженных штаммом 396y. Согласуются с этими данными и результаты оценки обсемененности легких M. tuberculosis, считающейся интегральным показателем тяжести течения инфекции, поскольку уровень бактериальной нагрузки легких МБТ практически на всех сроках наблюдения уже развившегося заболевания (кроме последнего срока обследования), при использовании штамма 396y был значимо более высоким. Кроме того, при инфицировании мышей M. tuberculosis 396y максимальные значения биометрических показателей, как и практически все характеристики распространенности патологических изменений в легких, регистрировались раньше, чем в других группах Оценка различий в скорости роста штаммов двух резистентных кластеров древней сублинии генотипа Beijing. Результаты исследования параметров роста штаммов двух исследованных кластеров 1071-32 и 14717-15 показывают внутри каждой группы значительный разброс значений параметров роста. Сравнение исследуемых групп показало, что некоторые различия между ними были только лишь по двум параметрам роста – длительности lag-фазы и точке максимального прироста флуоресценции (р=0,05). Штаммы кластера 1071-32 медленнее выходили из lag-фаз и в более поздние сроки имели максимальный прирост флуоресценции. Однако по интегральному параметру роста – коэффициенту r, характеризующему особенности кривой роста МБТ в целом, по критерию U группы между собой не различались, при слабой тенденции штаммов кластера 1071-32 к замедлению роста. ТАКИМ ОБРАЗОМ, Beijing 1071-32 – менее вирулентный и летальный, чем высоколетальный Beijing 14717-15, который в основном циркулирует в Бурятии. При этом на примере 1071-32 мы видим, что наличие многочисленных мутаций устойчивости действительно может привести к снижению выживаемости (fitness) и трансмиссивности штамма в целом т.к. этот кластер составляет незначительную долю популяции в большинстве регионов (кроме Омской области) хотя и достаточно широко распространен. Например, можно отметить его выявление в других странах, причем не только в странах бывшего СССР, но (вероятнее всего за счет мигрантов из б. СССР) – в Албании и Греции. Сравнение моделей прямого и непрямого анализа вирулентности in vivo и in vitro показывает, что показатель скорости роста для оценки патогенности и траснмиссивности не является достаточно информативным. Напротив, мышиная модель вирулентности выявила значимые различия изучаемых кластеров и определила бурятский кластер 14717-15 как высоковирулентный и высоколетальный, причем более летальный, чем известные эпидемические в России и Средней Азии генотипы Beijing B0/W148 и Beijing CAO. Данные высокорезистентные генетические кластеры отражают две парадигмы эволюции и адаптации. Сравнение с имеющимися данными по другим генотипам позволяет нам формулировать гипотезу о соотношении вирулентности и лекарственной устойчивости как основном факторе распространения патогенных респираторных бактерий.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году подана 1 заявка и подготовлена еще 1 заявка на патент на методы детекции резистентных кластеров. Результаты представлены на 4 международных конгрессах. Две статьи 2021 года отражены в Новостях РНФ https://www.rscf.ru/news/biology/shtamm-vozbuditelya-tuberkuleza-obnaruzhennyy-na-dalnem-vostoke-okazalsya-vysokoletalnym/ ; https://rscf.ru/news/biology/lekarstvenno-ustoychivyy-shtamm/ Целью исследования является комплексный анализ биологических свойств новых высокорезистентных и потенциально эпидемических генотипов Mycobacterium tuberculosis для оценки их вирулентности, устойчивости, эволюционной истории и прогноза на будущее. Мы бы хотели подчеркнуть многовекторность проекта при логической взаимосвязи всех его компонентов. В 2021 году (3-й заключительный год проекта) исследования велись одновременно по нескольким взаимосвязанным направлениям (филогеографический, филогенетический, биоинформационный анализ, моделирование ин силико, анализ патобиологических свойств в мышиной модели штаммов разных генотипов и сравнение с клинической значимостью применительно к человеческой популяции), объединение результатов которых позволило получить целостную картину эволюции и эпидемиологии значимых генотипов M. tuberculosis и сформулировать новые задачи для заявки на продоление проекта. В 2021 году исследования велись по следующим направлениям, по которым были получены результаты, имеющие мировой приоритет. - Полногеномный и филогенетический анализ штаммов древних сублиний Beijing для выявления филогенетических нейтральных SNP-маркеров резистентного российского кластера 14717-15 и для определения SNP, приводящих к значимым аминокислотным заменам на основе анализа in silico, прежде всего в генах вирулентности, адаптации, синтеза клеточной стенки. Сборка и аннотация геномов двух штаммов этого кластера и их депонирование. - Разработка метода быстрой ПЦР детекции Beijing 14717-15, скрининг ретроспективных и новых коллекций ДНК и анализ глобальной базы геномных данных генотипа Beijing для их выявления. - Изучение вирулентности и летальности в мышиной модели взятых в качестве сравнения штаммов другого значимого генетического семейства LAM (Latin American Mediterranean). - Оценка клинической значимости эпидемических и эндемических генотипов применительно к человеческой популяции на основе анализа исхода заболевания (диагноз и летальность). ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛАСТЕРОВ 1071-32 И 14717-15 В РАМКАХ ГЛОБАЛЬНОЙ ФИЛОГЕНИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ГЕНОМОВ В результате секвенирования в 2021 году дополнительной выборки 19 штаммов древних сублиний Beijing построена новая дендрограмма российской и глобальной выборки штаммов ранней древней сублинии Beijing (224 генома) из России, Китая, Японии, Кореи, Вьетнама и Таиланда. Штаммы из России попали в два обособленных кластера в разных ветвях дерева (РИС 2). Все российские штаммы были генотипически мультирезистентными (как минимум), а за счет дополнительных мутаций устойчивости многие (особенно в кластере 1071-32) были пред-ШЛУ (широко лекарственно устойчивые). Самый крупный из этих кластеров 1071–32 включал только российские изоляты из европейской и азиатской России. Все обладали устойчивостью к INH, RIF, STR, EMB из-за 6 мутаций в KatG315/335, RpoB450, RpoC485, EmbB497, RpsL43. Большинстве имело мутации в pncA, gyrA, rrs, eis, то есть были пред-ШЛУ. Исходя из количества SNP, разделяющих наиболее удаленные изоляты это кластера и основываясь на оценке скорости мутаций в геноме M. tuberculois (0.5 SNP/геном/год) мы предполагаем его возникновение в 1970-х годах. Относительно ближайшими соседями этих штаммов были штаммы из Таиланда. С учетом обособленности Омской области (где наибольший процент этого кластера в России) такое родство выглядит странным и требует дополнительного исследования. Российские изоляты меньшего кластера 14717-15 были из азиатской России. У них было две общие мутации устойчивости rpsL Lys88Arg katG Srr315Thr. Филогенетически ближайшими соседями были изоляты из Кореи, при этом российски изоляты как из Омска так и из Бурятии и один из корейских изолятов имели характерный сполигопрофиль SIT269 (производный от классического сполигопрофиля Beijing - SIT1). Это делает правдоподобной гипотезу о корейском происхождении этого кластера, или скорее его российского штамма – основателя. ПОДБОР SNP-МАРКЕРОВ НА ГЕНОТИП BEIJING 14717-15, РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА ЕГО ДЕТЕКЦИИ, И СКРИНИНГ КОЛЛЕКЦИЙ Анализ геномной варианбельности уникальной для отдельных изолятов и их кластеров выявил 40 специфических однонуклеотидных замен (SNP) специфических для высоколетального и высоковирулентного кластера штаммов Beijing 14717-15. Среди этих SNP мы выбрали нейтральную замену в гене Rv1293 101 Ala/Ala. Нейтральная мутация не подвержена риску естественного отбора и с учетом невероятности реверсии такая мутация особенно пригодна для испольтзования в качестве специфического маркера для генодиагностики. Анализ генного участка в котором расположена данная мутация выявил что в результате ее возникает сайт распознавания для эндонуклеазы рестрикции HhaI GCGC. Это создает возможность выявления данной мутации на основе ПЦР-амплификации фрагмента гена с последующей обработкой рестриктазой HhaI и разделением продуктов рестрикции в агарозном геле. ПОДГОТОВЛЕНА ЗАЯВКА НА ПАТЕНТ, которая будет направлена в Роспатент в декабре 2021 г. Дополнительно мы проверили c с использованием метода ПЦР-ПДРФ еще один SNP (Rv2161c Val(s)33Ala), также имеющий исключительно высокое значение PAM1, т.е. филогенетически нейтральный. Для его детекции была использована рестрикция с той же рестриктазой HhaI. Применение двух SNP усиливает надежность детекции именного данного кластера. Обе схемы ПЦР-ПДРФ были отработаны и оптимизированы в отношении условий ПЦР на изолятах с известными полногеномными секвенсами и профилями VNTR. Обе мутации были выявлены только у штаммов кластера Beijing 14717-15. Далее мы провели скрининг географических коллекций изолятов из различных российских регионов на наличие штаммов данного кластера. Метод детекции штаммов кластера Beijing 14717-15 на основании ПЦР-ПДРФ анализа двух специфических SNP был применен к коллекции ДНК изолятов из различных регионов Сибири и Дальнего Востока. Дополнительно проведен скрининг выявленных филогенетических SNP кластера Beijing 14717-15 в глобальной базе геномов Beijing, включающей более 6000 геномов (файлов fastq). Данная база была составлена из геномных данных, извлеченных из GenBank/ENA, в рамках нашей коллаборации с д-ром Joao Perdigao, Research Institute for Medicines, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa (Португалия). СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФИЛОГЕОГРАФИЯ. Сравнение географии субтипа 14717-15 с распространением другого изученного субтипа Beijing 1071-32 показывает большее распространение последнего, но в малой доле, за исключением Омской области. Подробный анализ филогеографии кластера Beijing 1071-32 был представлен в отчете за 2020 год. В целом, согласно анализу VNTR, изоляты из кластера Beijing 1071-32 в основном выявлялись в России с явно возрастающей распространенностью в Омске, Сибирь, но эти изоляты также присутствовали в других регионах России и странах бывшего Советского Союза в Средней Азии и Закавказье. За пределами бывшего Советского Союза изоляты Beijing 1071-32 были описаны в Сербии (Merker et al., 2015), Албании (Tafaj et al., 2020) и Греции (Ioannidis et al., 2017). Это балканские страны, но неизвестно, отражает ли этот факт уже местную циркуляцию этого штамма, а не независимый импорт из бывшего СССР. ДНК из Албании и Греции были доступны для этого исследования, и мы подтвердили, что они содержат все 9 мутаций, то есть 3 нейтральных SNP и 6 мутаций устойчивости. Три изолята из Греции были получены от иммигрантов из бывшего СССР, а именно из Грузии, а два других - от пациентов из Греции. Пекинский генотип чрезвычайно редок в Албании, и ранее предполагалось, что эти изоляты в Албании могут быть связаны с соседней Грецией. Крупное европейское многоцентровое исследование лекарственно-устойчивого туберкулеза в ЕС десять лет назад выявило изоляты Beijing 1071-32 и обозначило их как европейский устойчивый кластер ECDC_10 (de Beer et al., 2014). Это дополнительно подчеркивает присутствие штамма Beijing 1071-32 MDR в ЕС и актуальность их отслеживания в более глобальном масштабе, не ограничиваясь Россией и другими странами бывшего Советского Союза. ОЦЕНКА ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ ГЕНОТИПА LATIN AMERICAN MEDITERRANEAN (LAM) В МЫШИНОЙ МОДЕЛИ. Сравнение с данными для эпидемических кластеров генотипа Beijing. Из 4 изученных штаммов (сполиготипов) ранее два были определены как эмерджентные, высокорезистетные и потенциально эпидемические, SIT266 – в Белоруссии и SIT252 – в Европейской части России. В то же время два других сполиготипа (SIT264, SIT254) не отмечены особыми патобиологическими свойствами. Ниже приведена таблица с информацией о штаммах и сполиготипах. При сравнении вирулентности клинических изолятов генетического семейства Latin American Mediterranean (LAM) 7074, 3929, 306 и 4542 и референтного оштамма M. tuberculosis H37Rv можно утверждать, что внутривенное введение всех исследованных клинических штаммов вызывает у инфицированых мышей генерализованный туберкулез с преимущественным поражением легких. По совокупности показателей тяжести течения туберкулезного процесса (выживаемости, динамики массы тела, биометрических показателей, степени распространенности в легких очагов специфического воспаления и уровню обсемененности легких и селезенки МБТ) вирулентность всех клинических штаммов M. tuberculosis (7074, 3929, 306 и 4542) была существенно ниже вирулентности референтного штамма M. tuberculosis H37Rv. Минимальная вирулентность при этом зафиксирована у трех низколетальных штаммов LAM 7074, 3929 и 4542 (все – МЛУ), умеренная - у штамма 306 (чувствительный). Сравнение результатов по штаммам LAM с ранее изученными нами штаммами древней и современной сублинии генотипа Beijing показывает четкую связь успешности эпидемических российских кластеров Beijing с их повышенной вирулентностью и летальностью. Для дальнейшего углубленного понимания полученных результатов на молекулярном уровне как организма-хозяина так и микроорганизма необходимо исследование методами системной биологии. Это запланировано в подаваемой нами заявке на продление гранта на 2 года. Влияние патобиологического разнообразия Mycobacterium tuberculosis на клинические проявления и летальный исход туберкулеза В популяции Mycobacterium tuberculosis в России преобладает печально известный генотип Beijing, основные эпидемические и эндемические варианты которого характеризуются противоположными свойствами лекарственной устойчивости и вирулентности. Мы изучили, как эти характеристики штамма могут повлиять на прогрессирование туберкулеза легких (ТБ) в отношении клинических проявлений и летального исхода. В коллекцию исследований вошли 548 изолятов M. tuberculosis, выделенных в 2013–2019 гг. от 548 пациентов с впервые выявленным туберкулезом легких в Омске, Западная Сибирь, Россия. Штаммы были подвергнуты тестированию на лекарственную чувствительность и генотипированию для выявления клонов, сублиний и подтипов (в пределах генотипа Beijing). Генотип Beijing выявлен у 370 (67,5%) изученных штаммов. Наиболее сильная связь с МЛУ была обнаружена для эпидемического кластера Beijing B0/W148 (современная сублиния) и двух недавно открытых нами кластеров 1071-32 и 14717-15 древней сублинии Beijing. Группа пациентов, инфицированных гипервирулентным и высоколетальным (на мышиной модели) кластером Beijing 14717-15, показала самый высокий уровень летального исхода (58,3%) по сравнению с Beijing B0/W148 (31,4%; P = 0,06), Beijing Central Asian/Russian (29,7%, P = 0,037) и штаммами non-Beijing (15,2%, P = 0,001). Кластер 14717-15 в основном включал изоляты от пациентов с инфильтративным, но не с фиброзно-кавернозным и диссеминированным туберкулезом. Напротив, группа, инфицированная кластером с низкой вирулентностью и МЛУ 1071-32, имела самый высокий уровень фиброзно-кавернозного ТБ, что, возможно, отражает способность этих штаммов к длительной выживаемости и хроническому течению процесса ТБ. В подгруппах пациентов, инфицированных современной сублинией Beijing и древним кластером 14717-15, преобладали пациенты в возрасте <44 лет, что, вероятно, коррелирует с активной продолжающейся передачей этих штаммов. В заключение, это исследование подчеркивает, что не только лекарственная устойчивость, но и вирулентность штаммов должны приниматься во внимание при внедрении персонализированной медицины и лечения туберкулеза.