КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-13-00131

НазваниеНанозимы «искусственная пероксидаза» для медицинской диагностики и терапии.

РуководительКарякин Аркадий Аркадьевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021  , продлен на 2022 - 2023. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-205 - Аналитическая химия

Ключевые словананозимы, наночастицы, берлинская лазурь, наноструктурированные катализаторы, гексоцианоферраты переходных металлов, электроанализ, иммуносенсоры, ДНК- (РНК-) сенсоры

Код ГРНТИ31.19.29 31.15.33


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на создание научных основ замены ферментов пероксидаз в диагностике (иммуно-ферментный анализ, ДНК- (РНК-) сенсоры) и применения пероксидазной активности в терапии, используя для этих целей нанозимы «искусственная пероксидаза». Иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоры, а также аналитические наборы на основе афинных взаимодействий являются неотъемлемой частью жизнедеятельности современного общества, поскольку используются в самых различных его сферах от медицины до сельского хозяйства. Таким образом, улучшение эксплуатационных свойств подобных аналитических устройств крайне актуально и лежит в русле тенденций развития современного общества. Для генерации аналитического сигнала эти устройства используют метки, самой распространенной из которых является фермент пероксидаза. Современной быстро развивающейся областью науки является синтез нанозимов – наночастиц, имитирующих активность ферментов. Самому термину «нанозимы», пожалуй, немногим более 5-и лет. Их использование наиболее актуально для замены ферментов в различных областях науки и техники, позволяющее решить основные проблемы использования ферментов: природная невысокая стабильность и высокая цена. Для создания нанозимов, очевидно, нужны высокоэффективные катализаторы. Международным научным приоритетом руководителя предлагаемого проекта вот уже 25 лет является основанный на берлинской лазури наилучший (в тысячи раз превосходящий платину и по активности, и по селективности) электрокатализатор восстановления пероксида водорода, той самой реакции, которую катализирует фермент пероксидаза. Предлагаемый проект будет основан на одном из результатов завершающегося проекта РНФ 16-13-00010: каталитический метод синтеза наночастиц берлинской лазури и создание на его основе нанозимов «искусственная пероксидаза»; статья опубликована в наиболее престижном химическом журнале: M.A. Komkova, E.E. Karyakina, A.A. Karyakin. Journal of the American Chemical Society 140 (2018) 11302, IF = 14.3. Последнее обеспечивает не только научную новизну, но и мировой приоритет предлагаемых исследований. Созданные нанозимы характеризуются каталитической константой, до нескольких тысяч раз превосходящей каталитическую константу природного фермента пероксидазы. Кроме высокой каталитической активности, синтезированные наночастицы обладают свойствами, присущими природным ферментам: специфичностью (отсутствием оксидазной активности – восстановления молекулярного кислорода), а также способностью функционировать в физиологических растворах. Созданные нанозимы не содержат благородных металлов, поэтому их стоимость по сравнению с ферментами ничтожна. Нанозимы обладают стабильностью неорганических материалов, которая недостижима для ферментов. Для создания научных основ замены пероксидаз в диагностике, а также использования пероксидазной активности в терапии предлагается решение следующих задач: - исследование нанозимов «искусственная пероксидаза» физическими и физико-химическими методами, установление структурно-функциональных взаимосвязей; - изучение каталитических свойств и механизма действия нанозимов «искусственная пероксидаза» в реакции восстановления пероксида водорода; - синтез композитных наночастиц ядро-оболочка для стабилизации нанозимов на основе берлинской лазури оболочкой гексацианоферрата никеля; - синтез сверхмалых нанозимов с размерами на уровне ферментов (4-6 нм); - электрохимический синтез нанозимов «искусственная пероксидаза»; - осаждение нанозимов «искусственная пероксидаза» на электроды и исследование электрокаталитических и аналитических свойств полученных электродов; - синтез нанозимов с функциональными группами для создания коньюгатов с биомолекулами; - включение нанозимов «искусственная пероксидаза» в липосомы с целью создания противовоспалительных лекарств; - синтез коньюгатов нанозимов «искусственная пероксидаза» с антителами и ДНК (РНК) для иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоров; - создание с использованием нанозимов «искусственная пероксидаза» иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоров на электрохимической платформе, пригодных к использованию «у постели больного». Комплексность решаемых задач подтверждает использование разнообразных физических и физико-химических методов, а также вовлечение в проект различных областей знания: нанотехнологий (синтез и исследование наночастиц), катализа (каталитический синтез, ферменто-подобная активность наночастиц), биохимии и молекулярной биологии (синтез коньюгатов наночастиц с антителами, ДНК, РНК), аналитической химии и медицинской диагностики (иммуно-ферментные тест-системы, ДНК- и РНК-сенсоры и электроаналитические системы на их основе).

Ожидаемые результаты
В результате проекта будут разработаны новые методы синтеза и получены новые нанозимы «искусственная пероксидаза» на их основе: стабилизированные для функционирования в щелочных растворах, сверхмалые (сравнимые по размеру с белками), содержащие функциональные группы для ковалентной пришивки к биомолекулам. Знание механизма действия, очевидно, позволит, с одной стороны, выбрать оптимальные условия применения нанозимов, и, с другой стороны, найти пути улучшения их каталитической активности. Будут синтезированы коньюгаты нанозимов с биомолекулами: антителами и ДНК (РНК). Для целей противовоспалительной терапии будут получены липосомы, содержащие нанозимы «искусственная пероксидаза»: как обычные полученные методом каталитического синтеза, так и стабилизированные гексацианоферратом никеля композиты ядро-оболочка. Все это позволит создать в заключение проекта электрохимические иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоры и аналитические системы, пригодных к использованию «у постели больного». Оценивая значимость результатов проекта, следует отметить, что применение ферментов в анализе биологических объектов основано, как правило, на их высокой специфичности. Например, глюкозооксидаза превращает только свободную глюкозу, не окисляя ни ее изомеров, ни олиго-сахаридов на ее основе. Такой специфичности по органическому субстрату вряд ли следует ожидать от нанозимов. Что же касается использования ферментов в качестве меток, то для них наряду с высокой активностью достаточна специфичность только к окислителю, и пероксидаза – яркий тому пример. Таким образом, нанозимы «искусственная пероксидаза» являются первыми и, возможно, единственными нанозимами, востребованными для медицинской диагностики. Научная значимость проекта также определяется развитием современной и быстро растущей области: самому термину «нанозим» порядка 5-и лет. Отметим, что синтезированные в (M.A. Komkova, E.E. Karyakina, A.A. Karyakin. Journal of the American Chemical Society 140 (2018) 11302) нанозимы «искусственная пероксидаза» являются первыми наночастицами, обладающими свойствами природного фермента: каталитической активностью, даже превосходящей на несколько порядков активность пероксидазы, и присущей этому ферменту селективностью (отсутствием катализа оксидазной реакции – восстановления молекулярного кислорода). Проект является мультидисциплинарным. Его результаты также важны для нанотехнологий, биохимии и молекулярной биологии, аналитической химии и упомянутой медицинской диагностики. Общественная значимость проекта определяется, главным образом, развитием диагностических систем. Иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоры, а также аналитические наборы на основе афинных взаимодействий используются в самых различных его сферах от медицины до сельского хозяйства. Таким образом, улучшение данных аналитических систем и устройств лежит в русле развития современного общества.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Изучение каталитических свойств и механизма действия нанозимов на основе берлинской лазури. Для изучения механизма действия нанозимов был применен формально-кинетический подход, принятый в ферментативной кинетике. За реакцией восстановления пероксида водорода, катализируемого нанозимами, следили по уменьшению концентрации восстановленной формы второго субстрата (или накоплению его окисленной формы) спектрофотометрически. Кинетика реакции восстановления Н2O2, катализируемой синтезированными нанозимами на основе берлинской лазури, исследована в присутствии наиболее используемых субстратов фермента пероксидазы. Механизм восстановления пероксида водорода, катализируемый нанозимами на основе берлинской лазури, описывается двустадийной схемой. Первой является обратимая стадия взаимодействия нанозимов с восстанавливающим субстратом, которая протекает по бимолекулярному механизму без образования комплекса. Окисление берлинского белого, восстановленной формы берлинской лазури, пероксидом водорода на второй стадии протекает необратимо. Соотношение прямой и обратной констант первой стадии определяется разностью потенциалов медиатора и берлинской лазури (PB|PW). Таким образом, нанозимы на основе каталитически синтезированных наночастиц берлинской лазури являются низкопотенциальной «искусственной пероксидазой» (≈0.15 В, Ag|AgCl), вплоть до 200 раз превосходящей по каталитической константе природный фермент даже в присутствии высокопотенциальных восстанавливающих субстратов. 2. Стабилизация нанозимов: синтез композитных наночастиц ядро-оболочка с ядром из каталитического материала (гексацианоферрат железа) и стабилизирующей оболочкой (гексацианоферрат никеля). С целью синтеза стабилизированных нанозимов ядро из каталитического материала – берлинская лазурь – покрывалась оболочкой гексацианоферрата никеля, изоструктурного берлинской лазури, но, хотя и каталитически неактивного, гораздо более стабильного механически и химически. Разработан протокол синтеза стабилизированных нанозимов. После инкубации в смеси солей никеля и гексацианоферрата диаметр наночастиц берлинской лазури возрастает. Размеры получаемых наночастиц, определенные с помощью метода динамического светорассеяния, составили от 40-50 нм до >100 нм, что подтверждается данными просвечивающей электронной микроскопии. Оптимальным для стабилизированных нанозимов является каталитический синтез наночастиц берлинской лазури диаметром ≈40 нм с последующим покрытием их слоем гексацианоферрата никеля до диаметра ≈80 нм. Стабильность полученных композитных наночастиц в нейтральной среде (pH 7.4), охарактеризованная константой инактивации, повышена на порядок по сравнению с нанозимами на основе берлинской лазури. Путем модификации поверхности рабочего электрода стабилизированными нанозимами разработаны сенсоры на пероксид водорода, определена их чувствительность и операционная стабильность. Эти исследования будут продолжены на 2 году выполнения проекта. 3. Синтез сверхмалых нанозимов «искусственная пероксидаза» с размерами на уровне размеров ферментов (4-6 нм). Осуществлен синтез наночастиц берлинской лазури размером 4-5 нм в трехфазных системах вода/октан/ПАВ путем восстановления смеси феррицианида и хлорида железа (III) с использованием анилина в качестве восстановителя. Получено распределение ультрамалых наночастиц берлинской лазури частиц по размерам методами динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии. Средний диаметр частиц составил 4.4±0.3 нм. Ультрамалые наночастицы БЛ стабилизированы в водном фосфатно-цитратном буферном растворе (рН 5.0) путем включения в мицеллы Triton X-100. Исследована каталитическая активность ультрамалых наночастиц берлинской лазури, получены kcat/KM ≈ 0.36*10-3 с-1M-1 по ТМБ и kcat/KM ≈ 0.65 с-1M-1 по H2O2. Эти работы также будут продолжены на 2 году выполнения проекта. 4. Электрохимический синтез нанозимов «искусственная пероксидаза» с ис- пользованием проточных электродов. Для регулируемого электрохимического синтеза нанозимов на основе берлинской лазури разработана проточная ячейка типа wall-jet с возможностью интеграции сменных электродов на основе графитового войлока. Показана возможность потенциостатического синтеза наночастиц берлинской лазури в системе, при этом размер частиц регулируется задаваемым потенциалом. Возможность синтеза наночастиц электрохимически позволяет достичь большей воспроизводимости свойств материала, чем в случае химического осаждения. С другой стороны, такой подход масштабируем и пригоден для массового производства препаратов электроактивных наночастиц. Электрохимически синтезированные наночастицы берлинской лазури имеют узкое распределение по размерам. Для всех синтезированных образцов каталитическая активность в реакции восстановления Н2O2 в присутствии тетраметилбензидина превосходит таковую для фермента пероксидазы из корней хрена. Для частиц с диаметром 135 нм kкат составляет ≈ 7500 с-1, что в 35 раз выше, чем для пероксидазы. 5. Осаждение нанозимов «искусственная пероксидаза» на электроды для изучения их электрокаталитических свойств в сравнении с обычными электродами, модифицированными берлинской лазурью. Покрытия на основе иммобилизованных нанозимов на основе берлинской лазури обладают высокой электроактивностью. В редокс-процессе задействована вся толщина покрытия, при этом доля электроактивного материала определяется размером частиц, при увеличении последнего доля экспоненциально приближается к 25%. Предложенный способ иммобилизации нанозимов на поверхности электрода прост, позволяет контролировать размер наносимых частиц и, как результат, плотность и морфологию электроактивного покрытия. Развитая морфология поверхности сенсоров на основе наночастиц берлинской лазури позволяет достичь чувствительности по отношению к Н2О2 (0.85±0.05 А·М-1·см-2, n=3, P=0.95), на 30 % превосходящей таковую для сенсоров на основе пленок БЛ. Время единичного измерения с помощью таких сенсоров и биосенсоров не превышает 10 с, а линейный диапазон определяемых концентраций H2O2 охватывает 4 порядка величины: от 2·10-7 до 1·10-3 М. Коэффициент чувствительности биосенсора на лактат в периодическом режиме тестирования, составляет 210 ± 20 мА·М-1·см-2, что в 2 раза выше чувствительности аналогичного биосенсора, модифицированного пленкой БЛ. Результаты работы опубликованы: Vokhmyanina Darya V., Andreeva Ksenia D., Komkova Maria A., Karyakina Elena E., Karyakin Arkady A.‘Artificial peroxidase’ nanozyme – enzyme based lactate biosensor. Talanta, 2020, 208, 120393 DOI: 10.1016/j.talanta.2019.120393 6. Исследование наночастиц «искусственная пероксидаза» физическими и физико-химическими методами. Фазовый состав каталитически синтезированных наночастиц на основе берлинской лазури подтвержден методами рентгенофазового анализа, мессбауэровской спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Катализатор, синтезируемый в присутствии ряда органических мономеров, представляет собой композит берлинская лазурь/проводящий полимер. Гранулометрический анализ наночастиц берлинской лазури осуществлен методами динамического светорассеяния, растровой электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, полученные результаты согласуются. Частицы берлинской лазури имеют субмикро- и наноразмеры, а их диаметр можно контролировать на стадии синтеза. Гидратный состав НЧ БЛ установлен методом термогравиметрии. Высокий коэффициент экстинкции ε=4.85·104 М-1·см-1 наночастиц БЛ (определен методами спектроскопии и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой) позволяет рассматривать их в качестве потенциально применимых колориметрических меток для создания ДНК-/РНК-биосенсоров. 7. Аналитический обзор литературных источников. По материалам выполняемого проекта и проекта РНФ, успешно завершенного в 2018 году, и также основанного на применении электрокатализатора на основе Берлинской лазури авторы подают заявку на написание обзора литературы по теме “Берлинская лазурь: от высокоэффективного электрокатализатора восстановления пероксида водорода до нанозимов, побеждающих природный фермент пероксидазу” в редакцию журнала Успехи химии для публикации в 2020-21 гг. 8. Дополнительно к заявленному Плану работ на 1 год проекта разработан амперометрический способ детекции неэлектроактивных ионов и нейтральных молекул, альтернативный классической потенциометрии. Поскольку берлинская лазурь представляет собой ред-окс активный материал, обменивающийся катионами с раствором для компенсации заряда, ее целесообразно использовать в качестве сенсора на катионы щелочных металлов. Для детекции неэлектроактивных ионов в качестве альтернативы традиционной потенциометрии предложена амперометрия в проточно-инжекционном режиме. Отклик сенсора представляет собой пару разнонаправленных пиков (катодный и анодный) в проточно-инжекционном режиме и один пик в режиме постоянного потока аналита. Сравнительные исследования показали, что проточно-инжекционном режиме аналитически значимым является первый пик. По своим аналитическим характеристикам амперометрический режим превосходит потенциометрический: соотношение сигнал-шум повышается в 20-25 раз. Результаты исследования опубликованы: Zavolskova Marina D., Nikitina Vita N., Maksimova Ekaterina D., Karyakina Elena E., Karyakin Arkady A. Constant Potential Amperometric Flow-Injection Analysis of Ions and Neutral Molecules Transduced by Electroactive (Conductive) Polymers Analytical Chemistry, 2019, 91, № 12, 7495-7499 DOI 10.1021/acs.analchem.9b00934 9. Подготовлено к публикации 5 статей (Q1), из них две уже опубликованы. 10. Подготовлена к защите кандидатская диссертация аспирантки Карповой Е.В. (защита 18 декабря 2019 г.). Участники работ по гранту приняли участие в 5 конференциях в РФ и за рубежом, также в конкурсах и выставках, отмечены премиями и стипендиями.

 

Публикации

1. Андреева К.Д., Вохмянина Д.В., Карякин А.А. Stabilized lactate biosensors based on composite alkoxysilane-Nafion membranes Proceedings of the 15th International Students Conference “Modern Analytical Chemistry”Prague, 19—20 September 2019 edited by Karel Nesměrák. -- 1st edition. -- Prague : Faculty of Science, Charles University, 2019. - 285, pp.155-159 (год публикации - 2019).

2. Вохмянина Д.В., Андреева К.Д., Комкова М.А., Карякина Е.Е., Карякин А.А. ‘Artificial peroxidase’ nanozyme – enzyme based lactate biosensor Talanta, 208, с. 120393 (год публикации - 2020).

3. Завольскова М.Д., Никитина В.Н., Карякин А.А. DC amperometric flow-injection analysis of ions and neutral molecules transduced by electroactive polymers Proceedings of the 15th International Students Conference “Modern Analytical Chemistry”Prague, 19—20 September 2019 edited by Karel Nesměrák. -- 1st edition. -- Prague : Faculty of Science, Charles University, 2019. - 285, pp.167-173 (год публикации - 2019).

4. Завольскова М.Д., Никитина В.Н., Максимова Е.В., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Constant Potential Amperometric Flow-Injection Analysis of Ions and Neutral Molecules Transduced by Electroactive (Conductive) Polymers Analytical Chemistry, 91, № 12, с. 7495-7499 (год публикации - 2019).

5. Королев А.И. Стабилизированный биосенсор на основе берлинской лазури для определения концентрации глюкозы в биологических жидкостяхдоклад XXIX Менделеевская школа-конференция молодых ученых, г. Иваново, Ивановский государственный химико-технологический университет ,Россия, Россия, 21-27 апреля 2019, стр.58 (год публикации - 2019).

6. Никитина В.Н., Завольскова М.Д, Карякин А.А. Flow-injection dc amperometry as an alternative to potentiometry for electroactive polymer supported sensors Matrafured 2019 International Conference on Chemical Sensors Будапешт, Венгрия, 2019. — P. 37–37., стр.37 (год публикации - 2019).

7. Шавокшина В.А., Андреев Е.А., Карякин А.А. Sensing element based on poly(3,4-(1-azidomethylethylene)dioxythiophene) as electroactive layer of electrochemical DNA sensors Proceedings of the 15th ISC Modern Analytical Chemistry ▪ Prague 2019 Edited by Karel Nesměrák, Faculty of Science, Charles University, Prague, pp.8-14 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Скриннинг органических соединений как восстановителей смеси соли железа (III) и феррицианида для синтеза нанозимов. Синтез нанозимов за счет восстановления смеси соли железа (III) и феррицианида органическими соединениями. Был осуществлен синтез наночастиц с использованием в качестве восстановителей для смеси соли железа (III) и феррицианида предшественников проводящих полимеров: пиррола, анилина, тиофена, а также их производных. Включение проводящего полимера в состав наночастиц берлинской лазури, помимо функционализации, приводит к стабилизации катализатора. Наибольшую операционную стабильность, заметно превосходящую таковую не только для нефункционализированных наночастиц, но и для пленок берлинской лазури, демонстрируют нанозимы на основе самодопированного полианилина (полимера 3-аминофенилборной кислоты). Одной из наиболее удобных функциональных групп для последующей конъюгации с биомолекулами является азид (клик-реакцией азид-алкинового циклоприсоединения). Для функционализации азидо-группами осуществлен синтез нанозимов с использованием азидометил-ЭДОТа (азидометил-этилендиокситиофена) в качестве восстановителя феррицианида железа (III). Функционализация наночастиц подтверждена методом рамановской спектроскопии. 2. Заключительная оптимизация методов синтеза нанозимов, разрабатываемых в течение первого года проекта (электрохимический, ядро-оболочка, сверхмалых нанозимов). 2.1. Проведена заключительная оптимизация условий электрохимического синтеза нанозимов «искусственная пероксидаза». Размер наночастиц, синтезируемых в проточной ячейке типа wall-jet с интегрированным электродом на основе углеродного волокна, определяется в основном концентрацией реагентов и восстановительным потенциалом. При этом увеличение концентрации солей и снижение потенциала приводят к уменьшению диаметра наночастиц (до 50-60 нм). Заключительная оптимизация условий электрохимического синтеза позволила синтезировать нанозимы с каталитической константой, до 200 раз превосходящей kкат для пероксидазы из корней хрена. Будучи простым и безреагентным, электрохимический подход также позволяет осуществлять контроль размера нанозимов на стадии синтеза, что делает его перспективным для задач биотехнологии. 2.2. Стабилизированные нанозимы ядро-оболочка были синтезированы путем экспонирования наночастиц берлинской лазури (БЛ) в растворы, содержащие ионы никеля (Ni2+) и ферроцианида ([Fe(CN)6]3‒) для покрытия гексацианоферратом никеля (NiГЦФ). В качестве стабилизатора получаемых наночастиц использовали гексаметафосфат натрия. Стабильность нанозимов ядро-оболочка в нейтральных pH, характеризуемую оптической плотностью при 700 нм (берлинская лазурь), судя по константе инактивации, удалось повысить почти на порядок, в частности, для частиц диаметром ≈120 нм kin (БЛ) = 2.4∙10-3 с-1, kin (БЛ-NiГЦФ) = 3.1∙10-4 с-1. Сенсоры на пероксид водорода (методика их создания на основе наночастиц разработана в течение первого года выполнения проекта) в случае использования нанозимов ядро-оболочка также характеризуются значительно более высокой операционной стабильностью. Так в жестких условиях мониторирования 1 мМ пероксида водорода для сенсоров на основе наночастиц БЛ-NiГЦФ время полуинактивации в 3 раза выше, а константа инактивации в 5 раз ниже, чем для сенсоров на основе наночастиц берлинской лазури. 2.3 Проведена оптимизация условий синтеза сверхмалых нанозимов на основе берлинской лазури в системах обращенных мицелл (октан/АОТ/вода). Синтез проводили каталитическим способом: к мицеллярной смеси, содержащей соли гексацианоферрата железа (III) и хлорида железа (III), добавляли мицеллярный раствор восстановителя – анилина. Методом динамического светорассеяния определен средний диаметр наночастиц в мицеллярной среде: 4.7±0.5 нм, что подтверждено просвечивающей электронной микроскопией. Получить нанозимы сверхмалых размеров (7 нм) в водном растворе возможно после однократного осаждения ацетоном из мицеллярной системы и ресуспендирования в фосфатно-цитратном буферном растворе при рН 5.0. 3. Исследование полученных нанозимов физическими и физико-химическими методами. Фазовый состав наночастиц берлинской лазури, стабилизированных гексацианоферратом никеля (частицы типа «ядро-оболочка»), исследовали методом ИСП МС. Для образцов с высоким содержанием ГЦФ никеля соотношение Fe:Ni стремится к 1. Согласно данным просвечивающей электронной микроскопии, образцы с высоким и низким содержанием гексацианоферрата никеля состоят из слабокристаллических зерен со средним размером 7-20 нм. Для обоих образцов зерна агрегированы в более крупные частицы размером 40-150 нм. Согласно данным локального рентгеноспектрального анализа, соотношение Fe и Ni для стабилизированных наночастиц с d = 40 нм составляет около 13, для наночастиц с d = 115 нм – около 3. Предположительно синтез наночастиц типа «ядро-оболочка» протекает как путем адсорбции ГЦФ никеля на поверхности наночастицы БЛ, так и путем агрегации с коллоидными частицами ГЦФ никеля, образующимися в реакционной смеси. Наночастицы большого диаметра с высоким содержанием ГЦФ никеля представляют собой агломераты наночастиц берлинской лазури, покрытых тонким слоем ГЦФ никеля, и наночастиц ГЦФ никеля. 4. Исследование каталитических свойств полученных нанозимов. Зависимость начальной скорости каталитической реакции от концентрации субстратов практически всегда имеет вид функции Михаэлиса. Интегральная кинетика указывает на замедленный выброс продукта (окисленной формы восстанавливающего субстрата). Кинетический механизм действия нанозимов состоит из стадий: присоединения восстанавливающего субстрата, окисления полученного комплекса пероксидом водорода (необратимая каталитическая стадия) и выброса окисленной формы восстанавливающего субстрата. Каталитические константы скорости для низкопотенциальных субстратов катехола, пирогаллола и ферроцианида калия составляют 2.6±0.1∙107 М-1с-1, 1.3±0.1∙108 М-1с-1 и 1.9±0.1∙108 М-1с-1, соответственно, и превосходят константу скорости взаимодействия активного центра пероксидаз с H2O2: (1–2)∙107 М-1с-1. Однако для пероксидаз скорость-лимитирующей является реакция Соединения II с электрон-донорными субстратами, протекающая, как минимум, на порядок медленнее. Таким образом, скорость-лимитирующая стадия реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами, как минимум в 100 раз превосходит таковую для реакции с участием пероксидаз. Для нанозимов типа «ядро-оболочка» каталитическая константа примерно в 2-2.5 раза ниже. Однако в нейтральных растворах ее значение для нестабилизированных наночастиц уменьшается на 50 % за 5 часов, в то время как нанозимы «ядро-оболочка» сохраняют до 80% ее величины в течение 50 часов. 5. Исследование органических пероксидов как субстратов нанозимов «искусственная пероксидаза». Каталитическая активность НЧ БЛ снижается в ряду пероксидов: пероксид водорода – пероксид мочевины – пероксид метилэтилкетона – трет-бутилгидропероксид – гидропероксид кумола. Установлено, что для небольших по размеру пероксидов (пероксиды водорода и мочевины) каталитическая реакция имеет место по всему объему наночастиц, восстановление больших пероксидов (трет-бутилгидропероксид, гидропероксид кумола) протекает только на поверхности нанозимов. Также установлено, что нанозимы не только каталитически активнее пероксидазы из корней хрена, но и более селективны к пероксиду водорода. Так для наночастиц (dср = 68 нм) коэффициенты селективности превышают таковые для пероксидазы хрена до 4 раз. Разрабатываемые нанозимы, таким образом, могут применяться в системах бесферментного определения пероксидов и биохимическом анализе. 6. Включение нанозимов «искусственная пероксидаза» в липосомы с целью создания противовоспалительных лекарств. Показана принципиальная возможность совместного включения каталитически синтезированных наночастиц БЛ (d = 50 нм) и миРНК в липосомы. Согласно данным динамического светорассеяния, диаметр гибридных наночастиц составляет около 100 нм. Включение наночастиц в липидный слой незначительно блокирует транспорт веществ, а каталитическая активность меняется не более чем на 30 %. Установлено, что каталитически синтезированные наночастицы БЛ, а также частицы типа «ядро-оболочка» на основе БЛ, стабилизированной гексацианоферратом никеля, не цитотоксичны. Проведены предварительные эксперименты, подтверждающие возможность аккумуляции наночастиц в клетках (AML12) и снижения таким образом уровня активных форм кислорода. 7. Синтез конъюгатов нанозимов с ДНК. С целью создания безреагентных электрохимических ДНК/РНК-сенсоров предложено использовать наночастицы берлинской лазури, функционализированные азидо-группами, позвляющими осуществить биоконъюгацию клик-реакцией азид-алкинового циклоприсоединения. На примере фрагмента гена HULC с использованием флуоресцентных меток установлено, что в полученных конъюгатах на один нанозим приходится в среднем 10-15 олигонуклеотидных фрагментов. Дзета-потенциалы нанозимов подтверждают протекание процесса биоконъюгации. Получены биоконъюгаты с различной удаленностью каталитической метки «искусственная пероксидаза» от 5′ конца (от 5 до 70 нуклеотидов). Показано, что электроактивность нанозимов в составе биоконъюгатов сохраняется. Таким образом, заложены основы использования нанозимов «искусственная пероксидаза» в качестве редокс/электрокаталитических меток. 8. Подготовка обзорной научной статьи. Исполнителями проекта получено приглашение подготовить к публикации главу в издании Comprehensive Inorganic Chemistry III (Elsevier). 9. Патентный поиск и подготовка патента. Получен патент на изобретение «Биосенсор на основе мембран полиалкоксисилана с повышенным коэффициентом чувствительности», 2 731 411, 2 сентября 2020 г. 10. Подготовка публикаций в высокорейтинговых журналах. На втором этапе настоящего проекта опубликовано 4 статьи в журналах Q1. Подготовлены к публикации 3 статьи: по механизму действия нанозимов, по электрохимическому синтезу нанозимов и по суперстабильным нанозимам «ядро-оболочка». 11. Участие в научных конференциях. Результаты работ по проекту представлены на трех Международных и Всероссийских научных конференциях, в том числе 71st Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry (Белград, Сербия). Конференции ESEAC-20 и Фрумкинский Симпозиум, указанные в плане, перенесены на 2021 год из-за коронавируса. 12. Участие студентов в научных конкурсах. Исполнители проекта получили награды за победы в научных конкурсах.

 

Публикации

1. Вохмянина Д.В., Королев А.И., Могильникова М.А., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Биосенсор на основе мембран полиалкоксисилана с повышенным коэффициентом чувствительности -, 2 731 411 (год публикации - ).

2. Карпова Е.В., Карякин А.А. Noninvasive monitoring of diabetes and hypoxia by wearable flow-through biosensors Current Opinion in Electrochemistry, том. 23, October 2020, стр.16-20 (год публикации - 2020).

3. Карпова Е.В., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Wearable non-invasive monitors of diabetes and hypoxia through continuous analysis of sweat Talanta, том: 215, номер статьи: 120922 (год публикации - 2020).

4. Карпова Е.В.,Лаптев А.И.,Андреев Е.А., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Relationship Between Sweat and Blood Lactate Levels During Exhaustive Physical Exercise ChemElectroChem, т. 7, вып. 1, с.191-194 (год публикации - 2020).

5. Комкова М.А., Зарочинцев А.А., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Electrochemical and sensing properties of Prussian Blue based nanozymes “artificial peroxidase” Journal of Electroanalytical Chemistry, том 872, номер статьи: 114048 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Исследование физико-химических и каталитических свойств сверхмалых нанозимов. Проведено всестороннее исследование сверхмалых нанозимов (d = 4-5 нм), синтезированных каталитически в обращенных мицеллах в течение предыдущих этапов проекта, физико-химическими методами (оптическими, электрохимическими). Установлено, что синтез нанозимов в системе обращенных мицелл при степени гидратации 10 позволяет получать структуры с диаметром менее 8 нм. На рамановском спектре нанозимов, синтезированных в обращенных мицеллах, наблюдаются пики соответствующие колебаниям характеристических групп в структуре берлинской лазури (БЛ). Уширенный пик при 1500 см-1 на спектре композитных наночастиц БЛ-полианилин следует отнести к структуре последнего. При этом колебания, соответствующие поверхностно-активному веществу (ПАВ), отсутствуют, свидетельствуя о полном удалении ПАВ при отмывке нанозимов. Сверхмалые нанозимы иммобилизовали на поверхности электрода путем адсорбции. На циклических вольтамперограммах наблюдается пара пиков при потенциале 0.12 В (отн. ХСЭ), соответствующая редокс-переходу берлинская лазурь/берлинский белый. Электроды с иммобилизованными сверхмалыми нанозимами были протестированы в режиме амперометрической детекции пероксида водорода. Малый размер частиц катализатора обеспечивает высокую чувствительность детекции Н2О2 – (0.74 ± 0.09 А∙М-1∙см-2). Каталитические свойства сверхмалых нанозимов на основе берлинской лазури исследовали в системе обращенных мицелл. Показано, что зависимость начальной скорости реакции восстановления пероксида водорода от степени гидратации имеет максимум в диапазоне последней от 7 до 10, что соответствует условиям синтеза нанозимов. Начальная скорость реакции имеет гиперболическую зависимость от концентрации восстанавливающего субстрата (пирогаллол, гваякол), типичную для ферментативной кинетики. Найденные из этих зависимостей каталитические константы, в свою очередь, линейно зависят от концентрации пероксида водорода. Из тангенса угла наклона полученных линейных зависимостей представляется возможным определить бимолекулярную константу второй, скорость лимитирующей стадии (k2). Константы скорости k2 составили 63 M−1 с−1 для пирогаллола и 0.83 M−1 с−1 для гваякола. Для сверхмалых нанозимов, синтезированных в мицеллах, тангенс угла наклона зависимости наблюдаемой каталитической константы от диаметра наночастиц в билогарифмических координатах составил 2.6, что свидетельствует о протекании катализа не только на поверхности, но также в объеме частицы. Значения констант, полученных для нанозимов, как в водной, так и в мицеллярной системах, принадлежат одной зависимости. Таким образом, каталитические свойства сверхмалых нанозимов типичны для каталитически синтезированных наночастиц на основе берлинской лазури. 2. Исследование свойств гибридных наночастиц нанозим-миРНК, включенных в липосомы, для снижения активных форм кислорода в клетках. В течение заключительного этапа проекта продолжены работы, направленные на разработку противоопухолевых лекарств. Присутствие берлинской лазури в составе гибридных наночастиц призвано обеспечить снижение уровня активных форм кислорода (АФК) в поврежденных клетках, а также способствовать повышению эффективности РНК интерференции, защищая миРНК от деградации. Установлено, что наночастицы на основе БЛ могут накапливаться в клетках гепатоцитов мыши (AML12). При этом нанозимы даже в высокой концентрации (до 100 мкМ БЛ) не оказывают влияния на митохондриальную активность клеток и не цитотоксичны. Методом проточной цитометрии с использованием красителя дихлорфлуоресцеина показано, что при введении нанозимов в культуру клеток наблюдается значительное (на 70 %) снижение уровня АФК. Показана принципиальная возможность совместного включения каталитически синтезированных нанозимов различного размера (30 нм и 120 нм) и миРНК в липидные частицы. Согласно данным динамического светорассеяния, размер гибридных наночастиц составляет 100-140 нм и определяется размером липидной оболочки. Включение нанозимов в состав липосом подтверждено методом электронной криомикроскопии. Увеличение дзета-потенциала наночастиц берлинской лазури после формулирования также косвенно подтверждает включение нанозима в липосомы. Исследована кинетика реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами в составе гибридной частицы. Каталитическая константа для наночастиц, включенных в липосомы, закономерно снижается, а константа Михаэлиса – увеличивается, по сравнению с таковыми для свободных нанозимов. Тем не менее, снижение каталитической активности незначительно. Более того, предполагается, что при доставке в клетки липидная оболочка будет разрушаться, высвобождая нанозимы и миРНК непосредственно в цитоплазму. Таким образом, синтезированные гибридные наночастицы обладают высокой каталитической активностью в реакции восстановления Н2О2 и потенциально применимы для терапии двойного действия, а в перспективе позволят существенно снизить уровень АФК в очагах воспаления для повышения эффективности РНК интерференции. 3. Синтез биоконъюгатов нанозим-олигонуклеотид/нанозим-антитело и исследование каталитических и электрокаталитических свойств нанозимов в их составе. С целью применения в иммунохроматографии были синтезированы нанозимы различного размера, а также композитные наночастицы БЛ/полианилин (также с включением антраниловой и аминофенилборной кислот), БЛ/полиэтилендиокситиофен (ПЭДОТ), БЛ/азидометил-ПЭДОТ и его конъюгаты. Установлено, что независимо от размера частиц (30 или 100 нм), поверхностного потенциала (-25 мВ или 4 мВ), использования ПАВ (полиэтиленгликоль, белки), движения наночастиц или их конъюгатов с олигонуклеотидами вдоль нитроцеллюлозной мембраны не наблюдается. Таким образом, замена наночастиц серебра и золота на нанозимы берлинской лазури в иммунохроматографическом анализе не представляется возможной. С целью создания безреагентных электрохимических ДНК сенсоров на втором этапе проекта были синтезированы функционализированные азидо-группами наночастицы берлинской лазури. В ходе завершающего этапа проекта показана эффективность катализа реакции одновалентной медью по Мельдалю и Шарплессу (CuAAC или Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition). Установлено, что использование катализатора позволяет значительно повысить эффективность конъюгации и, как результат, в 5-10 раз увеличить чувствительность детекции меченых олигонуклеотидов. Методом флуориметрии контролировали количество олигонуклеотидов на поверхности нанозима. В дальнейшем использовали конъюгаты, содержащие 10-20 последовательностей. Электрокаталитическая активность конъюгатов в реакции восстановления пероксида водорода изучалась после их иммобилизации на поверхности электрода. Установлено, что максимальные коэффициенты чувствительности в случае коньюгатов (0.41 А∙М-1∙см-2) лишь незначительно уступают таковым для неконъюгированных наночастиц БЛ/азидометил-ПЭДОТ (0.45 А∙М-1∙см-2). Наблюдаемая каталитическая константа в реакции восстановления пероксида водорода в присутствии катехола для биоконъюгатов (3∙104 с-1) менее чем в 2 раза уступает таковой для свободных нанозимных меток на основе композита БЛ/азидометил-ПЭДОТ (5.5∙104 с-1). При этом наблюдаемая константа Михаэлиса увеличивается почти в 2 раза (до 7 мМ), что, вероятно, обусловлено ограниченной диффузией субстрата к поверхности нанозима в составе конъюгата. Для получения конъюгатов с антителами синтезировали нанозимы с амино- и карбоксильными группами. Использовали антитела европейского кролика (Oryctolagus cuniculus), выработанные к иммуноглобулинам полевой мыши (Apodemus agrarius), а также антитела домашнего осла (Equus asinus), к иммуноглобулинам европейского кролика. Реакцию биоконъюгации проводили с помощью дициклогексилкарбодиимида. 4. Разработка и испытание электроаналитических систем на основе ДНК(РНК)-сенсоров/иммуносенсоров с использованием биоконъюгатов нанозим-олигонуклеотид/нанозим-антитело. Поверхность графитовых электродов модифицировали электрополимеризацией азидометил-ЭДОТ, толщина покрытия от 50 до 300 нм. Сохранение азидо-функциональности подтверждено методом спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасной области. Редокс превращения известных медиаторов (ферри-/ферроцианид) на поверхности азидометил-ПЭДОТ в физиологических рН характеризуются значительно более высокими электрохимическими константами по сравнению с чистым электродом. Для создания ДНК- и иммуно-сенсоров олигонуклеотиды иммобилизовали на поверхности как азидометил-ПЭДОТ, так и нанозимов клик-реакцией, антитела коньюгировали с нанозимами карбодиимидным способом, на графитовой поверхности антигены и олигонуклеотиды закрепляли путем адсорбции. Регистрацию метки (нанозима) осуществляли по безмедиаторной реакции электровосстановления пероксида водорода. Показано, что специфическое взаимодействие, обусловленное гибридизацией комплементарных ДНК, приводит к увеличению чувствительности пероксидного сенсора по крайней мере на порядок. Определены градуировочные зависимости детекции олигонуклеотидов HULC, меченых нанозимами. Для электрода с азидометил-ПЭДОТ, снижающим неспецифическую сорбцию, минимальная детектируемая концентрация составила 0.1 нМ. Таким образом, разработанный подход пригоден для создания реальных ДНК сенсоров, работа которых, как предполагается, будет основана на гибридизации иммобилизованного на электроде и коньюгированного с нанозимом олигонуклеотидов с разными участками ДНК-мишени, которая, таким образом, будет приводить к иммобилизации электрокаталитической метки на электроде. Аналогично регистрировалась электрокаталитическая активность нанозима в отсутствии (неспецифическая сорбция) и в присутствии иммобилизованных антител. Возможно, ввиду экранирования белковыми молекулами прямой электрокатализ в данном случае оказывается неэффективным, поэтому в систему был добавлен медиатор (катехол). Показано, что специфическое связывание приводит к повышению чувствительности соответствующего пероксидного сенсора в 20 раз, таким образом, открывая перспективы создания реальных иммуно-сенсоров. Высокая электрокаталитическая активность разработанных нанозимов, а также возможность их ковалентной пришивки к биомолекулам (антителам и олигонуклеотидам) позволила разработать прототипы электрохимических иммуно- и ДНК сенсоров, которые позволят осуществлять экспрессную детекцию суб-наномолярных концентраций соответствующих аналитов. 5. Подготовка обзорной статьи и чтение пленарных лекций. Руководителю проекта было предложено написать обзорную статью для журнала Microchimica Acta (IF = 5.83, Q1), что было сделано по результатам проекта; обзор находится в печати. Руководитель проекта выступил с пленарными лекциями, посвященными результатам проекта на двух престижных международных конференциях. 6. Публикации в высокорейтинговых журналах. На третьем этапе по результатам проекта опубликовано 5 статей в журналах Q1: Journal of Physical Chemistry Letters (2) (IF = 6.475, Nature Index), Electrochimica Acta (IF = 6.9), Electrochemistry Communications (IF = 4.724), Dalton Transactions (IF = 4.39). 7. Участие в научных конференциях. Результаты работ по проекту представлены на Международных и Всероссийских научных конференциях: The Eighteenth International Symposium on Electroanalytical Chemistry (18th ISEAC), Changchun, China, XXVIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Cluj-Napoca, Romania, The 10th International Workshop on Surface Modification for Chemical and Biochemical Sensing, Warsaw, Poland, European Biosensor Symposium “EBS 2021 online”, Wildau, Germany. Студенты приняли участие в Международной научной конференции «Ломоносов-2021» (Москва, Россия). Конференции ESEAC-20 и Фрумкинский Симпозиум, указанные в плане, перенесены на 2022 год из-за коронавируса. 8. Участие студентов в научных конкурсах. Исполнители проекта получили награды за победы в научных конкурсах. 9. Защита курсовых и дипломных работ студентами химического факультета МГУ Под руководством участников научного коллектива выполнены и защищены с отличной оценкой 8 дипломных работ по аналитической химии, 4 дипломные работы отмечены аттестационной комиссией. Защищены 4 курсовые работы по аналитической и физической химии.

 

Публикации

1. Карпова Е.В., Щербачева Е.В., Комкова М.А., Елисеев А.А., Карякин А.А. Core–Shell Nanozymes “Artificial Peroxidase”: Stability with Superior Catalytic Properties The Journal of Physical Chemistry Letters, v. 12, p. 5547–5551 (год публикации - 2021).

2. Карякин А.А. Glucose biosensors for clinical and personal use Electrochemistry Communications, v. 125, p. 106973 (год публикации - 2021).

3. Комкова М.А., Ветошев К.Р., Андреев Е.А., Карякин А.А. Flow-electrochemical synthesis of Prussian Blue based nanozyme ‘artificial peroxidase’ Dalton Transactions, v. 50, p.11385-11389 (год публикации - 2021).

4. Комкова М.А., Ибрагимова О.А., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Catalytic Pathway of Nanozyme “Artificial Peroxidase” with 100-Fold Greater Bimolecular Rate Constants Compared to Those of the Enzyme Journal of Physical Chemistry Letters, v. 12, p. 171-176 (год публикации - 2021).

5. Никитина В.Н., Максимова Е.Д., Завольскова М.Д., Карякин А.А. Flow injection amperometry as an alternative to potentiometry for solid contact ion-selective membrane-based electrodes Electrochimica Acta, v. 377, p. 138074 (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
Результатом проекта является синтез новых нанозимов «искусственная пероксидаза» для применения в различных сферах от промышленности до медицины. Особенно следует отметить полностью электрохимический синтез нанозимов, позволяющий создать непрерывный реактор, а также синтез стабилизированных нанозимов ядро-оболочка. Мелкосерийный синтез нанозимов не требует специального оборудования и уже налажен в лаборатории Химического факультета МГУ. Разработанный в результате проекта способ создания сенсоров и биосенсоров на основе каталитически синтезированных наночастиц берлинской лазури с одной стороны, существенно упрощает приготовление электродов, модифицированных берлинской лазурью, и, с другой стороны, приводит к улучшению их аналитических характеристик. Биосенсоры типа «энзим-нанозим», предложенные вместо не нашедших применение биферментных электродов, также просты в изготовлении и востребованы в охране окружающей среды, промышленности, медицине. В проекте большое внимание уделялось неинвазивной диагностике как будущему медицины. Мелкосерийное производство сенсоров и биосенсоров освоено и реализовано на площадке Технопарка МГУ. В сотрудничестве с лабораторией Сколтех – МГУ производится разработка лекарств терапии двойного действия путем дополнительного включения нанозимов в липосомы вместе с ми-РНК. Дополнительно к противоопухолевому действию действие нанозимов будет обладать противовоспалительным эффектом, снижая уровень активных форм кислород в клетке, что уже показано в данном проекте. Наконец, создан задел по замене фермента пероксидазы в качестве метки в ДНК- и иммуносенсорах на более дешевые и стабильные нанозимы. Это приведет к усовершенствованию и удешевлению соответствующих медицинских тестов.