Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Синтезированы новые магнитные наноматериалы (МНМ) на основе суперпарамагнитных материалов с высокой намагниченностью насыщения и ярко выраженной нелинейностью зависимости намагниченности от магнитного поля сравнительно небольших величин (< 200 Э). Выявлены условия синтеза, при которых можно получать “цепочечные” структуры из магнитных наночастиц (МЧ) в единой оболочке. Установлено, что подобные структуры демонстрируют увеличенный нелинейный отклик на комбинаторных частотах при воздействии возбуждающими низкочастотным и высокочастотным магнитным полем. Разработаны компактные MPQ-регистраторы нового поколения на основе современной элементной базы и оптимизированных алгоритмов математической обработки сигналов для удобства проведения биофизических исследований с малыми животными in vivo с применением МНМ. В частности, для неинвазивного мониторинга МНМ непосредственно в теле лабораторных животных in vivo разработаны регистраторы с оптимизированными внешними индукционными зондами. Созданные экспериментальные устройства позволили провести эксперименты по выбору МНМ и конъюгатов на их основе для доставки лекарственных препаратов; исследовать связывание наночастиц с химическими покрытиями и комплементарными молекулами тканей и клеток; реализовать неинвазивный метод долговременного исследования биодеградации различных МНМ в индивидуальном организме животного in vivo. Оптимизирован второй тип MPQ-регистраторов, предназначенных для детекции МНМ, используемых в качестве магнитных наномаркеров для мультиплексной биохимической in vitro диагностики. Созданные MPQ-регистраторы адаптированы для одновременного измерения ультрамалых концентраций сразу трех биологически активных веществ (БАВ) на основе третичных аминов в моче пациентов. Для решения этой задачи были также разработаны гибридные функционализированные МЧ путём их конъюгации с разнообразными антителами, а также с комплексами «белок-носитель/БАВ». Установлены оптимальные протоколы конъюгации МЧ с распознающими биомолекулами, позволяющие достичь высокой воспроизводимости (на уровне менее 5%) связывания у разных партий синтезированных магнитных конъюгатов с комплементарными молекулами и их комплексами с белком-носителем, размещенных на иммунохроматографических тест-полосках. В большинстве экспериментов в качестве белка-носителя использовался бычий сывороточный альбумин (БСА). Наиболее важные с точки зрения социальной значимости результаты получены по разработке магнитометрических методов измерения ультрамалых концентраций и обнаружения следовых количеств БАВ на примере трех гаптенов (морфина, фентанила и метамфетамина) в стандартизированных образцах мочи человека (Detectabuse®).Такие образцы откалиброваны компанией Biochemical Diagnostics, Inc. (CША) с применением самых передовых лабораторных методов, а также были дополнительно исследованы в сертифицированной лаборатории ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Разработаны магнитометрические методы быстрого высокочувствительного измерения ультрамалых (следовых) концентраций таких гаптенов в образцах мочи человека. Важно, что разработанная методика позволяет исключить взаимодействие с перечисленными соединениями в их чистом виде и основана на использовании только стандартных антител и коммерческих реагентов «антиген-белок-носитель». Во всех разработанных вариантах время магнитного иммуноанализа не превышает 20 минут. Особо отметим, что такой анализ не требует высокой квалификации персонала и может проводиться вне лабораторных условий средним медицинским персоналом. Разработаны три схемы конкурентного иммунохроматографического анализа (ИХА) с применением синтезированных гибридных МЧ и оптимизированных MPQ-регистраторов. Принцип реализации первого формата заключался в конкуренции антигена в образце с комплексами «МЧ/антиген-БСА» за ограниченное число сайтов связывания антител, предварительно нанесенных в качестве тестовой линии на тест-полоске. Количество связавшихся МЧ определялось с помощью MPQ-регистраторов. Установлено, что пределы детекции такого формата магнитного иммуноанализа составили 0,20 , 0,36 и 1,30 нг/мл для, соответственно, морфина, фентанила и метамфетамина. Во всем диапазоне измеренных концентраций стандартное отклонение измерений не превышало 7% для метамфетамина, 9% для морфина и 11% для фентанила. Кроме того, разработан второй высокочувствительный формат магнитного ИХА, использующий тестовую линию из стрептавидина, а также конкуренцию конъюгатов «магнитная частица/антиген-белок-носитель» и свободных антигенов за ограниченное число сайтов связывания биотинилированных антител в анализируемом образце. Предел детекции фентанила в таком формате анализа составил рекордную для ИХA величину 0,05 нг/мл, что находится на уровне наиболее чувствительных лабораторных аналитических методов. Показано, что важным преимуществом этого метода измерения концентрации малых молекул является универсальность используемых стрептавидиновых тест-полосок. Для регистрации других гаптенов можно использовать те же универсальные тест-полоски, а исследуемые образцы необходимо инкубировать с соответствующими иммунорегентами для конкретного гаптена. Разработан и исследован также мультиплексный формат магнитного иммуноанализа, позволяющий одновременно проводить измерения ультранизких концентраций трех разных гаптенов в моче человека. Для его реализации три антитела наносились на соответствующие тестовые линии, а магнитные частицы, ковалентно связанные с конъюгатами гаптенов и БСА добавлялись к исследуемым образцам, куда затем помещались тест-полоски. После завершения миграции образца, сигналы с трех тестовых линий одновременно считывались трехканальным MPQ-регистратором. Данный формат продемонстрировал пределы детекции 0,60 нг/мл и 3,0 нг/мл для морфина и метамфетамина, соответственно. Разработанные способы измерения концентраций биологически активных веществ с применением магнитных наночастиц продемонстрировали целых ряд существенных преимуществ по сравнению с традиционным методами иммуноанализа, использующими оптические метки. В частности, разработанные магнитные способы не чувствительны к оптической плотности или цвету исследуемых образцов. Так, например, в исследованных случаях цвет мочи может сильно изменяться из-за болезни пациента, при приеме витаминов, лекарств или при употреблении определенной пищи и т. д., что затрудняет оптическое считывание окрашенных или флуоресцентных меток на традиционных ИХА тест-полосках. Разработанные методы можно использовать для измерения ультранизких концентраций малых молекул в непрозрачных и окрашенных биологических образцах, включая цельную кровь, мочу, слюну, молоко и др. Кроме того, продемонстрированные аналитические характеристики магнитных методов, такие как предел детекции, ширина динамического диапазона, малое время анализа и ряд других превосходят параметры существующих экспресс-методов и сравнимы с характеристиками самых передовых лабораторных трудоемких аналитических методов. Однако, разработанные методы существенно отличаются простотой и удобством. Сравнение аналитических параметров разработанных методов с наиболее передовыми технологиями проведено в опубликованном on-line приложении к статье Guteneva et al. Microchimica Acta, 186 (2019) 621, https://doi.org/10.1007/s00604-019-3726-9. По результатам, полученным в проекте, опубликована статья в журнале Microchimica Acta (импакт- фактор 5,479), входящем в первый квартиль Q1 в базах Web of Science и Scopus по данным http://www.scimagojr.com/, что, по условиям данного конкурса РНФ, засчитывается за 2 публикации. Кроме того, сделано 13 докладов на ведущих международных и всероссийских конференциях, 2 из которых - приглашённые, 8 устных и 3 постерных.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе проведённых исследований существенно расширены сферы научных применений высокочувствительных магнитных методов измерений и новых наноматериалов для решения актуальных задач биосенсорики и биомедицины. Экспериментальные прототипы MPQ-регистраторов (сокращение термина Magnetic Particle Quantification, введенного авторами проекта в англоязычных публикациях), были адаптированы для проведения междисциплинарных исследований в кооперации с биологами, химиками и медиками. Были оптимизированы методы неинвазивной регистрации динамики магнитных наноматериалов (МНМ) в реальном времени для проведения экспериментов на лабораторных животных in vivo. Результаты тестирования разработанных магнитных методов и прототипов устройств включены в публикацию Nikitin et al. Nature Biomedical Engineering, 4 (2020) 717–731 (Q1, импакт-фактор 18,952). За счет их применения был проведен большой объем измерений биораспределения разнообразных МНМ, кинетики частиц в живом организме, позволивший исследовать принципиально новый эффект, способный изменить парадигму использования нанопрепаратов в биомедицине. Показано, что MPQ-метод обеспечивает уникальную комбинацию параметров детекции, таких как высокая чувствительность, неинвазивность, точность количественной детекции наноагентов в режиме реального времени с временным разрешением 2-3 секунды непосредственно в глубине тканей и сосудов для изучения фармакокинетики различных наноагентов в организме лабораторных животных in vivo. Использованные прототипы MPQ-устройств позволили существенно ускорить проведение разноплановых исследований МНМ in vivo и тщательных проверок обнаруженных закономерностей. Полученные данные лишены артефактов и ошибок, присущих традиционным методам, основанным на заборе крови, из-за сверхкороткого времени циркуляции (обычно около минуты или нескольких минут) наночастиц в кровотоке. Особенно важно, что метод MPQ позволил существенно сократить расход количества лабораторных животных при получении столь большого объема информации по кинетикам наночастиц в живом организме, что соответствует этическому принципу работы с животными «3R: Replacement, Reduction and Refinement» (Замена, Сокращение и Повышение качества). С помощью MPQ-регистраторов установлены основные факторы и закономерности, влияющие на время присутствия наночастиц в кровотоке животных in vivo, такие как размер частиц, дзета-потенциал, характер покрытия, объем инъекционной дозы и т.д. Исследованы способы продления времени полупериода циркуляции наноагентов в кровотоке для повышения вероятности достижения этими агентами своей цели в организме для создания новых подходов к медицинской диагностике и терапии, в частности, онкозаболеваний. Высокое временное разрешение и, в особенности, неинвазивность количественных измерений позволили регистрировать фармакокинетику частиц в каждом отдельном животном, а затем получить статистически значимые результаты с точки зрения биологических вариаций между животными. Одной из целей подобных исследований был поиск новых методов увеличения эффективности адресной доставки in vivo терапевтических нанопрепаратов, в том числе, интеллектуальных наноагентов нового поколения, способных «атаковать» клетки-мишени более селективно за счет анализа микроокружения. В частности, подобные инновационные наноагенты были исследованы в рамках данного проекта; результаты опубликованы в статье Cherkasov et al. ACS Nano, 14 (2020) 1792-1803 (Q1, импакт-фактор 14,588). С помощью MPQ-устройств был разработан и исследован инновационный универсальный метод, который позволяет существенно продлить время циркуляции в кровотоке разнообразных наноагентов за счет введения в организм малых доз противоэритроцитных антител. Экспериментально показано, что данный подход, названный авторами цитоблокадой мононуклеарной фагоцитарной системы, позволяет значительно (в 32 раза) увеличить время циркуляции в крови как МНМ, так и практически любых биомедицинских нанопрепаратов, повышая их терапевтическую эффективность. Экспериментально продемонстрирован целый ряд перспективных применений предложенной технологии. В частности, установлено кардинальное улучшение избирательной доставки наноагентов к клеткам-мишеням in vivo. При таком способе доставки наночастица идентифицирует клетку-мишень с помощью специфической молекулы, например антитела против клеточного рецептора CD4, который присутствует на T-клетках крови. Доставка лекарств к подобным клеткам может быть полезна для разработки новых методов лечения ряда аутоиммунных и других тяжелых заболеваний, например, лейкемии, выявления циркулирующих раковых клеток и т. д. Установлено, что применение технологии приводит к существенному увеличению эффективности доставки лекарственных препаратов к пяти видам солидных опухолей различной природы: от меланомы до рака молочной железы, включая два типа опухолей человека, привитых мышам. В частности, показано, что цитоблокада в 23 раза повышает результативность “активной” магнитной и направленной доставки химиотерапевтических препаратов в раковые опухоли у животных. Для этого использовалось градиентное магнитное поле для дополнительного удержания магнитных лекарственных агентов в опухоли, тем самым снижая системную токсичность. Это позволило провести эффективную терапию опухолей меланомы с помощью липосом, нагруженных магнетитом и доксорубицином (химиотерапевтическим препаратом). Всесторонне исследованы и различные аспекты безопасности данной технологии. Таким образом, используя разработанные магнитные методы и наночастицы, удалось изучить временную эволюцию МНМ после инъекции антител и на основании полученных данных подобрать оптимальные параметры проведения данной процедуры (доза, порядок введения, продолжительность эффекта, влияние на биораспределение и т.д.). Результаты, полученные при помощи MPQ, хорошо коррелировали с данными современных аналитических методов, в том числе магнитно-резонансной томографии (МРТ), но выгодно отличались высоким временным разрешением, количественным характером измерений, высокой чувствительностью и нечувствительностью к эндогенным факторам. Развитые в ходе выполнения работ по проекту методы детекции, синтеза и конъюгации наночастиц с биораспознающими молекулами были использованы и для разработки быстрых форматов иммуно- и ДНК-анализов in vitro. В частности, разработан новый ультрачувствительный способ прямого (без амплификации или усиления реакции) измерения концентрации молекул РНК/ДНК на основе комбинации одноцепочечных фрагментов РНК и наночастиц золота, изложенный в статье Cherkasov et al. ACS Nano, 14 (2020) 1792-1803 (Q1, импакт-фактор 14,588). Достигнута рекордная чувствительность анализа вплоть до концентрации ДНК 30 фМ в чрезвычайно малом объёме пробы 20 мкл при быстром (15 минут) и простом для выполнения даже в полевых условиях иммунохроматографическом анализе. Достигнутый предел обнаружения при таком объеме пробы находится на уровне типичного выхода целевой ДНК из образца биопсии (0,5 амоль или 3 × 10e5 молекул), что представляется перспективным для разработки средств нового поколения для диагностики заболеваний. Разработанные наноагенты были подробно характеризованы как современными стандартными приборами (SEM, Nanoparticle Tracking Analysis, Imaging flow cytometry и т.д.), так и с помощью новых биосенсорных методик, разработанных в ходе работ по проекту. Продемонстрированный новый подход создания ультрачувствительных наносенсоров представляется перспективным для дальнейшего развития методов быстрой ДНК-диагностики, в том числе, и во внелабораторных условиях, например, непосредственно на месте оказания медицинской помощи, у кровати больного или в удалённых слабооснащённых фельдшерских пунктах. Развитые в ходе выполнения работ методы функционализации поверхности МНМ и методы выбора распознающих рецепторов с оптимальными константами ассоциации и диссоциации были адаптированы и использованы для разработки ряда других биосенсорных систем. В частности, одно из продемонстрированных перспективных направлений такого использования - всестороннее исследование и определение основных аналитических характеристик нового метода экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний путем высокочувствительного измерения в сыворотке крови человека обеих критически важных характеристик аутоантител: концентрации и нативных кинетических параметров, отражающих агрессивность аутоантител к тканям организма. Результаты этой работы опубликованы в статье Orlov et al. Biosensors & Bioelectronics, 159 (2020) 112187 (Q1, импакт- фактор 10,257). Впервые были исследованы кинетические характеристики связывания нативного антигена с антителами к тиреопероксидазе (анти-ТПО) и антителами к тиреоглобулину (анти-ТГ) в клинических образцах сыворотки крови пациентов. Практическая важность этой задачи связана с тем, что такие аутоантитела присутствуют у, соответственно, 90–95% и 70–80% пациентов с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы. Проведенные эксперименты впервые показали, что значения кинетической константы ассоциации аутоантител существенно (на порядок) различаются у разных пациентов. В то же время, кинетические данные не обнаруживают никакой корреляции с концентрацией аутоантител. На основе проведенных исследований клинических образцов пациентов был впервые предложен новый критерий для дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний, основанный на измерении не только концентрации аутоантител, но и их нативной кинетики связывания с антигеном. Все научные задачи и публикационные обязательства полностью выполнены. По результатам 2020 г. опубликовано 5 печатных работ, из них 3 – в научных изданиях первого квартиля Q1 с суммарным импакт-фактором 43,797. Нарастающим итогом полностью выполнены обязательства и в рамках двух лет проекта, в течение которых опубликовано 6 печатных работ, из них 4 – в журналах первого квартиля Q1 (каждая из которых по условиям конкурса засчитывается за 2) с суммарным импакт- фактором 50,029.