Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В подотчетном году создана ДНК коллекция сортов смородины красной (выделено ДНК из 73 сортов), сортов смородины черной (выделено ДНК из 52 сортов), родственных видов (гибрид R.utiolarum xR.vulgare; сорт и формы крыжовника R. uva-crispa: 25-22-2, 2-257-2, 2-257-3, Юпитер). На небольшой выборке образцов протестировано 69 пар праймеров, из них 30 не опубликованных ранее. Подобраны оптимальные условия для амплификации 38 микросателлитных локусов, в т.ч. 34 ранее опубликованных и четырех не опубликованных ранее. После предварительного отбора по полиморфизму и размеру ПЦР продуктов на ПААГ, сформированы 5 мультиплексов (наборов) из 19 микросателлитных локусов (от 3х до 4х локусов в мультиплексе) для наиболее эффективного одновременного анализа генофонда путем капиллярного электрофореза на ABI Prizm Genetic Analyser: В подотчетном году получены данные о полиморфизме 9 микросателлитных локусов (g2L17, g2h21, E1001, G1k04 , е1021, g1L12, g2b20 , g2j08, g2g12) сортов красной смородины ( всего 73 шт.) и некоторых родственных видов визуализированные путем ПААГ. Основываясь на полученных данных с учетом четких фрагментов для одного генотипа было обнаружено от 1 (у сортов Натали, Уайт Грейп) до 6 гетерозиготных локусов (Новая Красная). Обнаруженные гетерозиготные локусы будут наиболее информативны для анализа потомства конкретных генотипов. На родителях гибридной семьи красной смородины, для которой в рамках проекта запланировано составление генетической карты групп сцепления, было протестировано (проведена амплификация и визуализация ПЦР продуктов путем разделения в агарозном и/или полиакриламидном гелях) 69 пар праймеров микросателлитных локусов. По 13 локусам с типичным микросателлитным профилем и наличием полиморфных фрагментов у родителей проведены анализы на всей гибридной семье (всего 138 гибридов). Гибридов, амплифицирующих аллели отсутствующие у обоих родителей (outcrosses) не обнаружено. Один из гибридов, вероятно, получен от самоопыления. У пяти гибридов в некоторых локусах амплифицируется более двух аллелей. В локусе G1K04 обнаружено распределение аллелей со значительным отклонением от теоретически ожидаемого. В подотчетном году была проделана работа по выявлению SNP маркеров с применением NGS. Цель использования NGS в нашей работе – обнаружение SNP маркеров для их последующего картирования в гибридной популяции, и таким образом, получение насыщенной генетической карты, которая позволит более точно локализовать локусы сцепленные с хозяйственно-полезными признаками. Для этого нами был использован подход секвенирования ДНК-библиотек с уменьшенной сложностью генома. Данный подход позволяет охарактеризовать большое количество локусов генома на больших выборках образцов за счет значительного уменьшения цены по сравнению с полногеномным секвенированием. В результате анализа литературных данных для анализа образцов картируемой популяции красной смородины среди различных методов секвенирования с уменьшенной сложностью генома был выбран метод GBS (Genotyping by sequencing). Готовая к секвенированию библиотека была отсеквенирована на 1 дорожке Illumina HiSeq 4000 (101 цикл с одной стороны фрагментов) В результате было получено 382 373 581 прочтений хорошего качества. Обнаружено более 5 тысяч SNP-маркеров. В подотчетном году получены фенотипические данные о гибридной семье (в т.ч. по признакам с контрастным проявлением у родителей): произведена бальная оценка состояния растения в весенний период, плодоношения, поражения мучнистой росой, поражения тлями; проведены замеры длины кисти (элемент продуктивности), оценен вес ягод, выравненность или не выравненность размеров ягод, визуально оценен окрас ягод, органолептически – вкус ягод, отмечен сухой или мокрый отрыв (важный параметр при выведении сортов пригодных к механизированной уборке), отмечено наличие некроза листьев в период плодоношения, замерена высота куста и др. По полученным данным опубликована статья в журнале цитируемом РИНЦ: Голяева, О. Д., Калинина, О. В., & Панфилова, О. В. (2018). НАСЛЕДОВАНИЕ ДЛИННОКИСТНОСТИ ГИБРИДНЫМИ СЕЯНЦАМИ СМОРОДИНЫ КРАСНОЙ ОТ ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННЫХ СКРЕЩИВАНИЙ.Современное садоводство–Contemporary horticulture, (4 (28)) (http://journal.vniispk.ru/pdf/2018/4/68.pdf). Принята к публикации статья в журнале Генетика (входит в базу данных Scopus): Пикунова А.В., Князев С.Д., Голяева О.Д., Бахотская А.Ю., Калинина О.В. Смородина. Исследования генома с применением ДНК-маркеров.// Генетика. Принята в печать и будет опубликована в т.55, №9, 2019. Принята к публикации статья в журнале цитируемом РИНЦ: Калинина О.В., Бахотская А.Ю., Князев С.Д., Панфилова О.В. (Kalinina O.V., Bachotskaya A.U., Knuzev S.D., Panfilova O.V.) Калинина О.В., Бахотская А.Ю., Князев С.Д., Панфилова О.В. Оценка сортов смородины черной и красной селекции ВНИИСПК по устойчивости к мучнистой росе//Современное садоводство 2019 №3 . Принята к публикации статья цитируемая РИНЦ и включенная в перечень ВАК Калинина О. В., Голяева О. Д., Панфилова О. В (Kalinina O.V., Golyaeva O.D., Panfilova O.V.) Калинина О. В., Голяева О. Д., Панфилова О. В. СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ГИБРИДНОЙ СЕМЬИ СМОРОДИНЫ КРАСНОЙ БЕЛАЯ ПОТАПЕНКО × ОС 1426-21-80 ПО КАЧЕСТВУ ПЛОДОВ//Овощи России, принята к публикации, №4 (июль, август), 2019. Овощи России (2019 г.) Полученные результаты научного проекта по теме «ПОЛИМОРФИЗМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ КРАСНОЙ СМОРОДИНЫ (Ribes rubrum L.) ГЕНОФОНДА ВНИИСПК, ОРЕЛ» будут представлены на 7 конгрессе ВОГИС (проходящем 18-22 июня 2019). Таким образом, запланированный объем работ в подотчетном году выполнен полностью, заявленные результаты получены.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В подотчётном году получены первичные данные о полиморфизме 15 микросателлитных локусов (с ипользованием наиболее точного и воспроизводимого метода детекции – капиллярного электрофореза, осуществленного на приборе ABI Prizm Genetic Analyser) на ДНК 135 сортообразцов рода смородина из генколлекции ВНИИСПК, Орёл. На основании полученных данных проведен анализ внутрисортового (на примере нескольких сортов), межсортового и межвидового генетического полиморфизма смородин. Внутрисортового полиморфизма не обнаружено. 89% амплифицированных фрагментов являются редкими аллелям с частотой, равной или менее 0,2. Обнаружены так же уникальные аллели, амплифицируемые только на ДНК одного из протестированных сортообразцов. Методом кластерного анализа (UPGMA) была построена дендрограмма, в которой исследованные представители рода Ribes объеденились в два основных кластера смородины красной и смородины черной. Кластер смородины черной объединился на наиболее близком генетическом расстоянии с коэффициентом сходства 0,25, с высокой бутстреп поддержкой (БП) 98%. К кластеру чёрных смородин присоединился крыжовник на уровне генетического сходства 0,1, с БП 58%. Кластер смородины красной объединился на более дальнем нежели смородина черная генетическом расстоянии (0,16), с БП 98%, что говорит о большем разнообразии сортообразцов красной смородины вошедших в анализ. Отдельную ветвь в группе смородины красной представляет вид R.multiflorum, который присоединился к остальным образцам группы на наиболее отдаленном генетическом расстоянии, что свидетельствует о его отличии от всех проанализированных сортов красной смородины. Разработана система идентификации сортов, в т.ч. предложена система мультиплексирования микросателлитных локусов для одновременной детекции ПЦР продуктов (с учетом размеров фрагментов и красителей), подобраны сорта контроли, использование которых позволит сопоставлять данные полученные с некоторыми вариациями методической части, подобраны сведения о родословных и оригинаторах сортов. На основании данных о полиморфизме микросателлитных локусов составлены генетические паспорта сортов красной (8 штук) и чёрной (8 штук) смородины. Для всех сортов были получены уникальные профили. В качестве контролей для идентификации сортов чёрной смородины предложены достаточно востребованные в производстве сорта различных оригинаторов и различного происхождения Ben Conan (оригинатор SCRI, UK), Искушение (оригинатор ВНИИСПК, РФ), Чародей (Кокинский опорный пункт, РФ), а для идентификации сортов красной смородины сорта Газель (оригинатор ВНИИСПК, РФ, Чулковская × Маарсес Проминент) и Валентиновка (оригинатор ВНИИСПК, РФ, Роте шпетлезе × Йонкер ван Тетс). Данные о полиморфизме микросателлитных локусов генофонда, а так же элементы системы идентификации и паспортизации (идентификационная формула, оригинаторы, родословная) включены в базу данных. Проведен анализ потока аллелей через родословные близкородственных сортов. Получены фенотипические данные о гибридной семье Белая Потапенко х 1426-21-80 за 2019 г. по устойчивости к болезням и вредителям, компонентам продуктивности и др., в т.ч. по устойчивости к мучнистой росе на искусственном инфекционном фоне в полевых условиях. В подотчётном году получены фенотипические данные о генофонде красной смородины, задействованном в проекте. Проанализированы имеющиеся и полученые в ходе выполнения проекта многолетние фенотипические данные. Составлена первая в мире генетической карта смородины красной с применением микросателлитных и SNP ДНК-маркеров. В работе использована гибридная популяция, насчитывающая 139 гибридов, полученная от скрещивания сорта Белая Потапенко (Красный крест х Красная сибирячка) и гибридной формы 1426-21-80 (82-4-11 (Rote Spatlese х Чулковская) х 78-2-118 (Rote Spatlese х Маарсис Проминент)). Для выявления SNP маркеров был использован подход секвенирования ДНК-библиотек с уменьшенной сложностью генома (Genotyping by sequencing, GBS). Генетическую карту составляли с применением программы Join Map3/0, регрессионное картирование с использованием функции Kosambi. Построенная генетическая карта включает 8 групп сцепления с уровнем LOD 10, в которые вошло 299 ДНК-маркеров, в том числе 12 микросателлитных и 287 SNP маркеров, общая длина всех групп сцепления составила 741 сМ, средняя – 93 сМ. В семи из 8 полученных групп сцепления картирован хотя бы один микросателлитный ДНК-маркер. Для большинства локализованных нами на карте красной смородины микросателлитных локусов позиции соотносятся с положением на группах сцепления смородины чёрной (локусы e3-B02, g1-A01, g1-L12 размещаются на одной группе сцепления №5; локусы g2-J08, g2-B20, e1-O21, e1-O01 на полученной карте находятся каждый в отдельной группе сцепления 2, 3, 4, 6 соответственно), за исключением локусов, картированных у смородины чёрной на группе сцепления 1, которые в нашей работе не вошли ни в одну из составленных групп сцепления. Локус g2-J11 в наших исследованиях амплифицирует фрагменты в двух диапазонах, что позволяет предположить его дупликацию в геноме исследуемых образцов. Данный локус был картирован в двух группах сцепления смородины красной. Локализовано также 2 новых, ранее не картированных и не опубликованных микросателлитных локуса. В результате полногеномного поиска ассоциаций (GWAS – Genome wide association study) для которого были использованы данные о фенотипах 73 сортов красной смородины и их генотипах по 8583 SNP-маркерам (в программе Tassel 5 c использованием обобщенных линейных моделей с учетом популяционной структуры, статистически значимые маркеры были выявлены с учетом поправки Бонферрони) было выявлено 30 кандидатных маркеров, ассоциированных с признаком цвета ягод (P-value от 0 до E-7), 6 - ассоциированных с признаком длинны кисти (P-value от -8 до E-7) и 1 - ассоциированный с массой ягод 10 лучших кистей (P-value E-7). В результате QTL анализа обнаружено 507 кандидатных маркеров (здесь и далее учтены маркеры с уровнем значимости от ** - 0.05 и до ******* - 0.0001) хозяйственно-полезных признаков в картируемой популяции красной смородины (использовали непараметрический тест Крускал-Уоллиса в программе MapQTL 6.0). Выявлены кандидатные маркеры для следующих признаков: - интенсивность плодоношения (наибольшее число маркеров, а так же наибольшая статистическая значимость обнаружена для маркеров на хромосоме 8), - высота куста (наибольшее число маркеров, а так же наибольшая статистическая значимость обнаружена для маркеров на хромосоме 6), - средняя длина кисти без черешка, средняя длина кисти с черешком (Наибольшее число маркеров, а так же наибольшая статистическая значимость обнаружена для маркеров, локализованных на хромосоме 2 для обоих признаков), - масса ягод 10 лучших кистей (наибольшее число маркеров, а так же наибольшая статистическая значимость обнаружена для маркеров на хромосоме 2), - вес 10 лучших ягод лучших кистей (наибольшая статистическая значимость обнаружена для маркеров на хромосомах 3, 7.1 и 8), - количество ягод в 10 лучших кистях (наибольшая статистическая значимость обнаружена для маркеров на хромосомах 2, 7.2 и 8), - поражаемость американской мучнистой росой (наибольшая статистическая значимость обнаружена для маркера, локализованного на хромосоме 8 по данным 2018 года и для маркеров локализованных на 5 хромосоме по данным 2019 года) - поражаемость антракнозом (наибольшая статистическая значимость обнаружена для маркеров локализованных на хромосоме 8 по данным 2018 года и для маркеров на хромосоме 3 по данным 2019 года), - поражаемость септериозом (наибольшее число маркеров и наиболее статистически значимые маркеры были локализованы на хромосоме 8) Таким образом, в подотчётном году выполнены все запланированные работы и получены запланированные результаты.