КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-75-10112

НазваниеРоль инсулиноподобного фактора роста 2 и связывающих его белков в молекулярных механизмах памяти

РуководительБаль Наталья Вячеславовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2021 

КонкурсКонкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-106 - Нейробиология

Ключевые словаПамять, консолидация, реконсолидация, инсулиноподобный фактор роста 2, ИФР-2, Igf2, синаптическая пластичность, угашение памяти

Код ГРНТИ34.15.43


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Память – это способность живых организмов сохранять и воспроизводить информацию. В ходе формирования память превращается из нестабильной (лабильной) формы в стабильную – этот процесс называется консолидацией памяти. При предъявлении условного стимула после обучения происходит реактивация памяти, которая на некоторое время также становится лабильной. После реактивации, в зависимости от условий напоминания, память может сохраняться или даже усиливаться, и позднее вновь стать стабильной – этот процесс обозначают термином «реконсолидация памяти». При многократном напоминании без подкрепляющего сигнала (подачи пищи, воды, электрокожного раздражения) происходит угашение памяти. Какие молекулярные и клеточные процессы лежат в основе процессов консолидации, реконсолидации и угашения? Основные исследования на молекулярном и клеточном уровне, которые проводились многие десятилетия, касались в первую очередь изучения формирования памяти. Так, были открыты ранние гены, которые экспрессируются в первые минуты и часы после обучения, и которые запускают синтез поздних генов, изменяющих структурно-функциональные свойства нейронов, причем эти изменения могут сохраняться в течение длительного времени. В течение последних двух десятилетий накапливаются экспериментальные данные о молекулярных процессах, происходящих при напоминании и реконсолидации/угашении памяти, однако эти данные пока разрозненные и не образуют стройную картину. Появление новых методов исследования экспрессии генов привело к обнаружению фактора, играющего важную роль в образовании памяти – инсулиноподобного фактора роста 2 (ИФР-2, Igf2). Это белок, для которого ранее было показано участие в развитии организма и в онкологических процессах, ранее привлекал мало внимания нейробиологов. Однако в последнее время накапливаются данные о том, что Igf2 и связывающие его белки (Igfbp - Insulin-like growth factor-binding protein) и рецепторы играют важную роль как в формировании, так и в угашении памяти. Этот белок можно отнести как к ранним генам, так и к поздним, поскольку в некоторых работах показывают его увеличение как через 1 час, так и через 20 часов после обучения. В предварительных пилотных экспериментах на небольшой группе мы также обнаружили недостоверное увеличение экспрессии Igf2 в гиппокампе крыс через час после обучения в модели условно-рефлекторного страха. По литературным данным, внутримозговое введение Igf2 приводит к усилению памяти, тогда как блокада его экспрессии с помощью введения антисмысловых олигонуклеотидов нарушает формирование памяти. В одной из работ показано изменение экспрессии Igf2 и Igfbp7 при обучении и угашении памяти. Кроме того, показано изменение уровня Igf2 и Igfbp2 в мышиной модели болезни Альцгеймера. Несмотря на отдельные работы, систематического морфофункционального Igf-связывающих белков в формировании и модификации памяти в настоящее время проведено не было, есть лишь несколько работ, посвященных роли только Igf2, поэтому данный проект актуален для получения новых данных о физиологии и патофизиологии мозга. Кроме того, практически отсутствуют работы о функции Igf-связывающих белков в мозге, хотя показана их экспрессия в мозге. Для исследования роли инсулиноподобного фактора роста 2 и связывающих его белков в механизмах нормальной работы памяти и при нарушении памяти будут проведены следующие эксперименты: Июль 2018-июнь 2019 года 1) Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мозга на Igf2 и Igf-связывающие белки с помощью специфичных антител. Будет проведено изучение колоколизации изучаемых белков с нейрональными и глиальными маркерами. 2) Проведение поведенческих экспериментов с обучением и напоминанием на грызунах с последующим сбором материала для измерения уровня экспрессии изучаемых генов с помощью количественного ПЦР на разных временных точках после обучения и напоминания. 3) На основе морфологических данных и измерения уровня экспрессии генов после обучения и напоминания будут выбраны как минимум два IGF-связывающих белка, наиболее интересных для данного исследования, для которых будут подобраны последовательности для производства плазмид и вирусов для РНК-интерференции. Для каждого гена будут подобраны минимум две последовательности, для каждой из которых будет сконструирована плазмида – вектор для сборки вирусов. 4) Будет сконструированы два вектора для подавления синтеза гена Igf2 и один вектор для его сверхэкспрессии. Анализ работоспособности вирусных конструкций будет проводиться с помощью вестерн-блоттинга со специфичными антителами. Июль 2019 – Июнь 2020 1) Сборка вирусов и проверка работоспособности генетических конструкций для подавления синтеза выбранных Igf-связывающих белков с помощью вестерн-блоттинга 2) Проведение исследований роли Igf2 и Igf-связывающих белков после подавления его синтеза и сверхэкспрессии в морфологии и функционировании пресинаптических и компонентов после in utero электропорации конструкций во 2-3 слои мозга крыс: анализ количества пресинаптических областей на длину отростка нейрона с помощью генетически-кодируемого маркера пресинапсов синаптофизина, конъюгированного с зеленым флуоресцентным белком GFP. Для функционального исследования пресинаптической функции вместе с изучаемой плазмидной конструкцией в нейроны будет введен светочувствительный канал (ChR2), вызывающий деполяризацию клетки. Сочетание электрофизиологической записи от постсинаптической клетки со световой стимуляцией трансфицированной клетки позволит получит данные о роли белков в синаптической передаче. 3) Морфологическое исследование локализации мРНК изучаемых генов в срезах мозга с помощью новейшей чувствительной методики RNAScope. 4) Выбор и отработка модели нарушения памяти при патологии головного мозга (при гипоксии, фармакологическом или стрессовом воздействии). Июль 2020-Июнь 2021 1) Проведение исследования роли Igf2 и Igf-связывающих белков в регуляции работы постсинапсов и в синаптической пластичности после инъекции полученных ранее вирусов в гиппокамп. 2) Проведение исследования роли Igf2 и Igf-связывающих белков в консолидации, реконсолидации и угашении памяти с помощью внутримозговых инъекций вирусов. 3) Изучение роли сверхэкспрессии и подавления синтеза Igf2 в развитии патологии в модели нарушения памяти, выбранной на 2-м году выполнения проекта.

Ожидаемые результаты
1. Будут получены морфологические данные о локализации инсулиноподобного фактора роста 2 Igf2 и нескольких Igf-связывающих белков и мРНК в головном мозге грызунов (в первую очередь, коре мозга и гиппокампе) с помощью методов иммунофлуоресценции и, впервые, с помощью новейшего метода детекции РНК RNAScope. 2. Будут созданы вирусные конструкция для подавления синтеза Igf2 и Igf-связывающих белков, а также конструкция для увеличения экспрессии Igf2 в мозге. Полученные конструкции будут использоваться для экспериментов с исследованием функции изучаемых генов в стабилизации и дестабилизации памяти в поведенческих экспериментах, вирусная конструкция для увеличения экспрессии Igf2 будет протестирована на модели нарушения памяти при патологии. Полученные результаты будут соответствовать мировому уровню исследований, данные о влиянии сверхэкспрессии Igf2 на нарушение памяти могут быть основой для разработки терапевтических подходов для восстановления памяти при патологии. 3. Будут получены новые данные о роли Igf2-связанной системы в регуляции работы пресинаптического и постсинаптического компонентов синаптической передачи с помощью современных методов оптогенетики, in utero электропорации, конфокальной микроскопии. 4. Будут получены новые данные об изменении экспрессии генов при стабилизации и дестабилизации памяти в коре больших полушарий мозга и гиппокампе с методов секвенирования нового поколения, ПЦР в реальном времени и биоинформатической обработки. Полученные результаты будут соответствовать мировому уровню работ в этой области. 5. На основе полученных данных будет сформирована теоретическая пространственно-временная модель участия Igf2-связанной системы и других генов в стабилизации и дестабилизации памяти.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Инсулиноподобный фактор роста 2 (ИФР-2) - это белок, продуцируемый различными клетками, который может оказывать как дистальное действие через кровь, так и локальное действие на близлежащие клетки. ИФР-2 обладает мощным митогенным эффектом, в связи с чем изучается его роль в физиологических и патологических процессах в организме. ИФР-2 играет большую роль в эмбриональном развитии, однако в настоящее время появляются данные о том, что данный фактор играет роль и в постнатальном развитии, в том числе в нервной системе. В настоящее время некоторыми исследователями показано, что инсулиноподобный фактор роста 2 играет важную роль как процессах “взрослого” нейрогенеза в зубчатой фасции гиппокампа, так и в процессах формирования синапсов в нервной системе. Кроме того, существуют данные о том, что ИФР-2 играет важную роль в обучении, однако таких данных не очень много, и выполнены они на ограниченном спектре поведенческих методик . В настоящей работе проводилось исследование экспрессии мРНК ИФР-2 и ИФР-связывающих белков после обучения и напоминания в модели контекстуального условно-рефлекторного замирания. Поскольку в областях СА1 и зубчатой фасции гиппокампа, по многим данным, физиологические процессы, связанные с активностью нейронов, проходят по-разному (в частности, нейрогенез во взрослом организме показан, в первую очередь, для зубчатой фасции гиппокампа), то было принято решение исследовать экспрессию этих генов в данных отделах мозга отдельно. Для этого была отработана методика физического разделения поля СА1 гиппокампа и зубчатой фасции под бинокуляром как для крыс, так и для мышей. Большая часть экспериментов была проведена на мышах, у которых анализировали уровень экспрессии мРНК ИФ-2Р и ИФР-связывающих белков через 1, 4 и 24 часа после обучения, а также через 1 час после напоминания на следующий день после обучения. Анализ экспрессии производился с помощью метода количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Было обнаружено снижение экспрессии мРНК ИФР-2 через 4 часа после обучения в зубчатой фасции гиппокампа, но не в поле СА1. В группе с активным контролем, в котором животным также предъявлялся новый контекст, но не производилось сочетания с электрокожной стимуляцией, также наблюдалось недостоверное снижение экспрессии мРНК ИФР-2 через 4 часа после посадки животного в новый контекст, что может свидетельствовать о том, что предъявление нового контекста само по себе, без сочетания с ударом тока, может влиять на экспрессию данного гена. Анализ уровня мРНК ИФР-связывающих белков не показал изменений после обучения, кроме гена Igfbp6. Мы обнаружили тенденцию к увеличению уровня Igfbp6 в поле СА1 гиппокампа в той же экспериментальной группе (после 4 часов после обучения).Igfbp6 обладает наибольшей аффинностью к ИФР-2 по сравнению с другими ИФР-связывающими белками (другие белки связывают также ИФР-1 с разной аффинностью), таким образом, можно предположить, что после обучения происходит изменение в ИФР-2-связанной системе. Полученные результаты требуют дальнейшей проверки и увеличения размеров экспериментальных групп, а также для проверки факторов, действующих на экспрессию исследуемых генов. Особенно это связано с тем, что мы получили другие результаты при обучении крыс. Крысы также были обучены в модели условно-рефлекторного страха, и в зубчатой фасции было обнаружено повышение уровня ИФР-2 через 1 час после обучения. Полученные различия могут объясняться как видовыми различиями, так и особенностями поведенческих протоколов. Дальнейшие исследования, надеемся, прольют свет на наблюдаемые различия. Кроме того, в первый год проведения проекта проведен ряд морфологических исследований по локализации ИФР-2 и некоторых ИФР-связывающих белков в мозге мышей. Обнаружена довольно сильная экспрессия белка ИФР-2 в телах и отростках некоторых нейронов дорсомедиального ядра гипоталамуса. Кроме того, показана слабая экспрессия ИФР-2 в некоторых клетках поля СА1 гиппокампа и зубчатой фасции. Однако, иммуногистохимические методы требуют валидации для исключения разного рода кросс-реактивности, поэтому данная работа будет продолжена для исследования обнаруженных морфологических данных. Также нами были сконструированы плазмиды для сверхэкспрессии белка ИФР-2, а также для подавления его экспрессии с помощью РНК-интерференции. Полученные плазмиды после нескольких этапов верификации будут использованы как для производства лентивирусных частиц, так и для электропорации в мозг эмбрионов, доставки нужных последовательностей в исследуемые участки мозга для изучения физиологических функций ИФР-2 на разных уровнях организации - как на уровне синаптической передачи между нейронами, так и на уровне поведения.

 

Публикации

1. Рощин М.В., Ермакова Ю.Г., Ланин А.А., Чеботарев А.С., Кельмансон И.В., Балабан П.М., Жёлтиков А.М., Белоусов В.В., Никитин Е.С. Thermogenetic stimulation of single neocortical pyramidal neurons transfected with TRPV1-L channels Neuroscience letters, V.687, P.153-157 (год публикации - 2018).

2. Чеснокова Е.А., Зюзина А.Б., Баль Н.В., Винарская А.Х., Рощин М.В., Артюхов А.С., Дашинимаев Э.Б., Асеев Н.А., Балабан П.М., Колосов П.М. Experiments with Snails Add to Our Knowledge about the Role of aPKC Subfamily Kinases in Learning International Journal of Molecular Sciences, Том 20, №9. pii: E2117 (год публикации - 2019).

3. Швадченко А.М.,Ерлыченкова О.И., Винарская А.Х., Рощина М.А., Волобуева М.Н., Баль Н.В., Балабан П.М. GENE EXPRESSION REGULATION IN DENTATE GYRUS DURING MEMORY FORMATION ISN-ASN 2019 Meeting, - (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В течение второго года выполнения проекта мы проводили исследование динамики экспрессии Igf2, Igfbp6 и c-fos в вентральных отделах гиппокампа (зубчатой извилине и СА1 области) и прелимбической коре мозга на разных временных точках после обучения в модели условно-рефлекторного страха и после напоминания. Полученные результаты позволят составить более подробную картинку функционирования Igf2-связанной системы при формировании условно-рефлекторной реакции замирания на контекст, поскольку предполагается, что дорсальный гиппокамп связан с обработкой пространственной информации, в то время как вентральный гиппокамп вовлечен в обработку эмоциональных сигналов. Прелимбическая кора по многим данным, также участвуют в формировании ассоциативной связи между информацией о контексте и безусловным стимулом, поэтому исследование экспрессии исследуемых генов в данной области представляется интересной задачей для понимания механизмов памяти. Обнаружено, что экспрессия генов c-fos увеличивалась через час после помещения животного в обучающую камеру в левой и правой прелимбической коре в двух экспериментах из трёх, где базовый уровень экспрессии был низким. В эксперименте, где базовый уровень был высокий, в прелимбической коре изменений не наблюдалось. В других проанализированных структурах (зубчатая фасция и поле СА1 вентрального гиппокампа) c-fos повышался через час, но не через 4 часа после обучения во всех экспериментах независимо от базового уровня. Исследование экспрессии c-fos после напоминания через 24 часа после обучения и сбора образцов через час после напоминания не показало изменений ни по сравнению с пассивным контролем, ни по сравнению с группой без напоминания. Сильных изменений уровней Igf2 и Igfbp6 в данных структурах не обнаружено, хотя можно отметить некоторое снижение уровня экспрессии Igf2 на 4-часовой точке в экспериментальной группе по сравнению с активным контролем в вентральной зубчатой фасции и правой прелимбической коре. Анализ достоверности полученных результатов будет проводиться на третьем году эксперимента после обработки всех полученных образцов и учёта фактора базового уровня c-fos. Также отработана методика детекции молекул РНК в образцах мозга (RNAScope). В ходе работы удалось обнаружить экспрессию мРНК Igf2 в срезах гиппокампа и коры мозга, причём локализация внутри структуры позволяет предполагать нейрональную экспрессию (хотя это требует дополнительного анализа).

 

Публикации

1. Волобуева М.Н., Швадченко А.М., Иванова В.О., Баль Н.В. Expression of Igf2 and its binding proteins in the hippocampus during memory formation Human Gene Therapy, Vol. 30, No. 11 (год публикации - 2019).

2. Иванова В.О., Балабан П.М., Баль Н.В. Modulation of AMPA Receptors by Nitric Oxide in Nerve Cells International Journal of Molecular Sciences, Т.1, Выпуск 21(3). Стр: E981 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На 3м году выполнения проекта проводили эксперименты по изучению изменения экспрессии генов в отдельных областях гиппокампа мышей после обучения как с помощью полногеномного секвенирования транскриптома, так и с помощью ПЦР в реальном времени. Также проводили изучение экспрессии разных Igf-связывающих белков в разных отделах гиппокампа и в коре мозга. Далее мы изучали влияние сверхэспрессии Igf2 в мозге и в культуре нейронов на синаптическую пластичность и память. Для полногеномного секвенирования транскриптома было получено 2-3 образца из четырех отделов гиппокампа и из левой и правой прелимбической коры для контрольной группы и для группы, в которой образцы были собраны через час после обучения в модели контекстного условно-рефлекторного страха. После анализа полученных данных дифференциальная экспрессия генов была отдельно подсчитана для каждой исследуемой области мозга. Общей для большинства зон была повышенная экспрессия различных комбинаций немедленных ранних генов – в частности, экспрессия Arc была отмечена во всех 6 областях (хотя анализ с помощью ПЦР в реальном времени показал, что в левой вентральной зубчатой фасции изменения недостоверны), также обнаружено увеличение экспрессии немедленного раннего гена c-Fos во многих областях. Тем не менее, наиболее существенные изменения были отмечены лишь в двух участках: левой дорсальной CА1 зоне и правой прелимбической области коры. Также мы сравнили экспрессию гена c-Fos в разных отделах гиппокампа через час после обучения с помощью ПЦР в реальном времени на большей выборке животных для статистического анализа. Мы обнаружили, что предъявление новой обстановки вызывает увеличение экспрессии гена c-Fos во всех изучаемых отделах гиппокампа. Стоит отметить, что сочетание новой обстановки с электрокожной стимуляции не оказало дополнительного эффекта по сравнению с предъявлением только новой обстановки, поэтому статистический анализ проводился между контрольными мышами и мышами, которым был предъявлен новый контекст вне зависимости от сочетания с электрокожной стимуляцией. На предыдущем году выполнения проекта такой же эффект был обнаружен для левой и правой прелимбической коры. Анализ генной онтологии дифференциально экспрессируемых локусов в зоне дорсальной области СА1 показал преобладание среди них рибосомных генов, а также таких значимых категорий как долговременная потенциация, рост аксонов, действие нейротрофинов. Для того, чтобы проверить гены, связанные с IGF-инсулиновым путём, мы загрузили список дифференциально-экспрессируемых генов (по порогу скорректированного значения p<0,1) в дорсальной области СА1 в базу данных geneontology.org. Для дальнейшего анализа с помощью ПЦР в реальном времени на большей выборке животных были отобраны два гена – Irs2 и Akt1. IRS2 является специфичным компонентом IGF-инсулинового пути, в то время как многие другие компоненты являются общими для разных нейротрофических путей. Akt1 показал наибольшее увеличение экспрессии при анализе транскриптома с помощью полногеномного секвенирования. Мы обнаружили, что экспрессия мРНК гена Irs2 достоверно увеличивается при предъявлении нового контекста в дорсальной области СА1 и в вентральной зубчатой фасции, но не в других исследуемых областях гиппокампа. Экспрессия мРНК гена Akt1 не меняется достоверно в изолированных областях СА1 и зубчатых фасциях через час после предъявления новой обстановки. На основе полученных данных об изменении экспрессии гена Irs2 в некоторых областях гиппокампа написана статья и направлена в рецензируемый журнал. Анализ транскриптома показал, что экспрессия РНК некоторых Igf-связывающих белков характеризуется локальностью: Igfbp6 экспрессируется в большей степени в прелимбической коре, тогда как экспрессия Igfbp5 преобладает в зубчатой фасции, а экспрессия Igfbp4 – в области СА1 гиппокампа и в прелимбической коре мозга мышей. В предыдущем году работы мы обнаружили с помощью флуоресценции, что белок Igfbp2 на фотографиях мозга локализуется преимущественно в ядрах клеток. Мы проанализировали фотографии с помощью конфокальной микроскопии, а также с дополнительным окрашиванием ядер на DAPI. Анализ полученных изображений показал колокализацию окрашенных областей с окрашиванием на DAPI. Чтобы проверить, насколько действие антител специфично, мы выделили ядра клеток из ткани мозга и обнаружили, что детекция предполагаемого белка c помощью вестерн-блоттинга происходит только в ядерной фракции, но не в надосадочной жидкости. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Igfbp2 может локализоваться в ядрах. Некоторые данные об экспрессии Igf2 и Igf-связывающих белков, полученные на основе анализа открытых баз данных, опубликованы в рецензируемом журнале (Beletskiy A, Chesnokova E, Bal N. Insulin-Like Growth Factor 2 As a Possible Neuroprotective Agent and Memory Enhancer-Its Comparative Expression, Processing and Signaling in Mammalian CNS. Int J Mol Sci. 2021). Также мы провели эксперименты in vivo для исследования действия сверхэкспрессии Igf2, вызванной вирусной трансдукцией. В работе было несколько экспериментальных групп. Первой группе моделировали фототромбоз c помощью бенгальского розового (БР) и вводили вирус на основе плазмиды p156_CMV:Igf2-IRES-GFP (Igf2_БР). Вторая группа переносила ложную операцию и введение вируса p156_CMV:Igf2-IRES-GFP (Igf2_ЛО). Третьей группе моделировали фототромбоз и вводили контрольный вирус p156_CMV:GFP (вектор_БР). Четвертая группа подвергалась ложной операции и введению контрольного вируса (вектор_ЛО). Для тестирования памяти был выбран тест на распознавание местоположения объектов, для анализа исследовательской активности проводили норковый тест. Тест на распознавание местоположения объекта показал недостоверное повышение индекса распознавания в ложнооперированной группе с вирусом для оверэкспрессией Igf2 по сравнению с остальными группами через неделю после операции. При этом в большинстве групп индекс был близок к нулю, что возможно, связано с тем, что животные не до конца восстановились после операции. Через 4 недели после операции тест на распознавание местоположения объекта показал недостоверное снижение индекса распознавания в ложнооперированной группе с контрольным вирусом по сравнению с животными с фототромбозом и введением контрольного вируса. В группе с введением вируса с Igf2 у ложнооперированных животных также наблюдается более низкая медиана по сравнению с ложнооперированной группой с введением контрольного вируса, однако различия также недостоверны. В группе Igf2-БР наблюдается промежуточное значение между группами вектор-ЛО и вектор-БР, что не исключает возможного защитного действия Igf2 на животных с фототромбозом. Однако, снижение (хоть и недостоверное) индекса в группе Igf2-ЛО может указывать на возможное негативное действие Igf2 в прелимбической коре на рабочую память у здоровых животных. Норковый тест на исследовательскую активность показал слабое недостоверное снижение количества исследуемых «норок» в группе с введением вируса с Igf2 вне зависимости от индукции фототромбоза. Для анализа как возможных нейропротективных эффектов, так и негативных эффектов требуется увеличение количества животных в выборках для увеличения статистической мощности. Для функционального исследования роли IGF2 в нейронах мы провели эксперименты с хронической сверхэкспрессией Igf2, вызванной вирусной трансдукцией культуры нейронов, а также острые эксперименты с добавлением человеческого рекомбинатного инсулиноподобного фактора 2 в гиппокампе крыс. Культура нейронов была посажена из мозга новорожденных крысят. На 4-й день культивирования в лунки были добавлены 3 мкл вируса на основе плазмиды p156_CMV:Igf2-IRES-GFP (Igf2-GFP) или 1 мкл вируса на основе плазмиды p156_CMV:GFP (GFP). Эксперимент проводился на 14-15 день культивирования. Электрофизиологическая регистрация проводилась методом пэтч-клямп в режиме «целая клетка». Для оценки вклада кальций-проницаемых АМПА рецепторов использовался метод регистрации индекса выпрямления (RI). Индекс выпрямления отображает внутреннее выпрямление кальций-проницаемых АМПА рецепторов и оценивается как соотношение амплитуды тока, измеренной при -70 mV и при +35 mV (EPSC-70mV/ EPSC+35 mV). Мы не обнаружили статистически достоверной разницы между индексом выпрямления контрольных нейронов (2.3±0.3, n=7) и нейронов, трансдуцированных вирусом с геном Igf2 (2.8±0.4. n=7), что свидетельствует о том, что оверэкспрессия Igf2 не влияет на вклад кальций-проницаемых АМПА рецепторов. Регистрация парной фасилитации выявила достоверную разницу между контрольными клетками (0.8±0.03, n=7) и клетками, трансдуцированными Igf2 (1.03±0.04, n=9, p=0.014, T-критерий Стьюдента), что свидетельствует о том, что оверэкспрессия Igf2 достоверно изменяет пресинаптический вклад в синаптическую трансмиссию. Для оценки влияния IGF2 на долговременную потенциацию срезы гиппокампа были получены от крыс возрастом около 1,5 мес. Стимулирующий и регистрирующий электроды помещались в str.radiatum поля СА1 гиппокампа. Нестабильная долговременная потенциация была вызвана слабой тета-стимуляцией (ТБС). 10 нМ инсулиноподобного фактора 2 были добавлены за 20 минут до индукции долговоременной потенциации. Эксперименты показали, что добавление IGF2 приводит к стабилизации потенциации, которая удерживается в течение часа, в отличие от контрольных срезов, в которых она постепенно падает практически до исходного уровня. Стоит отметить, что добавление пептида до индукции потенциации привело к увеличению парной фасилитации, которая изменялась как за счёт небольшого уменьшения амплитуды первого стимула, так и более существенного роста второго стимула через 50 мс. При этом увеличенная парная фасилитация наблюдалась для разных интервалов – от 30 до 100 мс. Таким образом, нами показано, что как в культуре нейронов млекопитающих при хронической оверэкспрессии Igf2, так и в острых экспериментах со срезами гиппокампа с добавлением экзогенного пептида наблюдается увеличение парной фасилитации под действием данного фактора, что свидетельствует о возможной роли Igf2 в регуляции пресинаптического выброса. Кроме того, добавление Igf2 стабилизирует долговременную потенциацию, что согласуется с литературными данными.

 

Публикации

1. Белецкий А.П., Чеснокова Е.А., Баль Н.В. Insulin-Like Growth Factor 2 As a Possible Neuroprotective Agent and Memory Enhancer-Its Comparative Expression, Processing and Signaling in Mammalian CNS International Journal of Molecular Sciences, Т. 22. Номер 4. С.1849. (год публикации - 2021).