Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Инсулиноподобный фактор роста 2 (ИФР-2) - это белок, продуцируемый различными клетками, который может оказывать как дистальное действие через кровь, так и локальное действие на близлежащие клетки. ИФР-2 обладает мощным митогенным эффектом, в связи с чем изучается его роль в физиологических и патологических процессах в организме. ИФР-2 играет большую роль в эмбриональном развитии, однако в настоящее время появляются данные о том, что данный фактор играет роль и в постнатальном развитии, в том числе в нервной системе. В настоящее время некоторыми исследователями показано, что инсулиноподобный фактор роста 2 играет важную роль как процессах “взрослого” нейрогенеза в зубчатой фасции гиппокампа, так и в процессах формирования синапсов в нервной системе. Кроме того, существуют данные о том, что ИФР-2 играет важную роль в обучении, однако таких данных не очень много, и выполнены они на ограниченном спектре поведенческих методик . В настоящей работе проводилось исследование экспрессии мРНК ИФР-2 и ИФР-связывающих белков после обучения и напоминания в модели контекстуального условно-рефлекторного замирания. Поскольку в областях СА1 и зубчатой фасции гиппокампа, по многим данным, физиологические процессы, связанные с активностью нейронов, проходят по-разному (в частности, нейрогенез во взрослом организме показан, в первую очередь, для зубчатой фасции гиппокампа), то было принято решение исследовать экспрессию этих генов в данных отделах мозга отдельно. Для этого была отработана методика физического разделения поля СА1 гиппокампа и зубчатой фасции под бинокуляром как для крыс, так и для мышей. Большая часть экспериментов была проведена на мышах, у которых анализировали уровень экспрессии мРНК ИФ-2Р и ИФР-связывающих белков через 1, 4 и 24 часа после обучения, а также через 1 час после напоминания на следующий день после обучения. Анализ экспрессии производился с помощью метода количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Было обнаружено снижение экспрессии мРНК ИФР-2 через 4 часа после обучения в зубчатой фасции гиппокампа, но не в поле СА1. В группе с активным контролем, в котором животным также предъявлялся новый контекст, но не производилось сочетания с электрокожной стимуляцией, также наблюдалось недостоверное снижение экспрессии мРНК ИФР-2 через 4 часа после посадки животного в новый контекст, что может свидетельствовать о том, что предъявление нового контекста само по себе, без сочетания с ударом тока, может влиять на экспрессию данного гена. Анализ уровня мРНК ИФР-связывающих белков не показал изменений после обучения, кроме гена Igfbp6. Мы обнаружили тенденцию к увеличению уровня Igfbp6 в поле СА1 гиппокампа в той же экспериментальной группе (после 4 часов после обучения).Igfbp6 обладает наибольшей аффинностью к ИФР-2 по сравнению с другими ИФР-связывающими белками (другие белки связывают также ИФР-1 с разной аффинностью), таким образом, можно предположить, что после обучения происходит изменение в ИФР-2-связанной системе. Полученные результаты требуют дальнейшей проверки и увеличения размеров экспериментальных групп, а также для проверки факторов, действующих на экспрессию исследуемых генов. Особенно это связано с тем, что мы получили другие результаты при обучении крыс. Крысы также были обучены в модели условно-рефлекторного страха, и в зубчатой фасции было обнаружено повышение уровня ИФР-2 через 1 час после обучения. Полученные различия могут объясняться как видовыми различиями, так и особенностями поведенческих протоколов. Дальнейшие исследования, надеемся, прольют свет на наблюдаемые различия. Кроме того, в первый год проведения проекта проведен ряд морфологических исследований по локализации ИФР-2 и некоторых ИФР-связывающих белков в мозге мышей. Обнаружена довольно сильная экспрессия белка ИФР-2 в телах и отростках некоторых нейронов дорсомедиального ядра гипоталамуса. Кроме того, показана слабая экспрессия ИФР-2 в некоторых клетках поля СА1 гиппокампа и зубчатой фасции. Однако, иммуногистохимические методы требуют валидации для исключения разного рода кросс-реактивности, поэтому данная работа будет продолжена для исследования обнаруженных морфологических данных. Также нами были сконструированы плазмиды для сверхэкспрессии белка ИФР-2, а также для подавления его экспрессии с помощью РНК-интерференции. Полученные плазмиды после нескольких этапов верификации будут использованы как для производства лентивирусных частиц, так и для электропорации в мозг эмбрионов, доставки нужных последовательностей в исследуемые участки мозга для изучения физиологических функций ИФР-2 на разных уровнях организации - как на уровне синаптической передачи между нейронами, так и на уровне поведения.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В течение второго года выполнения проекта мы проводили исследование динамики экспрессии Igf2, Igfbp6 и c-fos в вентральных отделах гиппокампа (зубчатой извилине и СА1 области) и прелимбической коре мозга на разных временных точках после обучения в модели условно-рефлекторного страха и после напоминания. Полученные результаты позволят составить более подробную картинку функционирования Igf2-связанной системы при формировании условно-рефлекторной реакции замирания на контекст, поскольку предполагается, что дорсальный гиппокамп связан с обработкой пространственной информации, в то время как вентральный гиппокамп вовлечен в обработку эмоциональных сигналов. Прелимбическая кора по многим данным, также участвуют в формировании ассоциативной связи между информацией о контексте и безусловным стимулом, поэтому исследование экспрессии исследуемых генов в данной области представляется интересной задачей для понимания механизмов памяти. Обнаружено, что экспрессия генов c-fos увеличивалась через час после помещения животного в обучающую камеру в левой и правой прелимбической коре в двух экспериментах из трёх, где базовый уровень экспрессии был низким. В эксперименте, где базовый уровень был высокий, в прелимбической коре изменений не наблюдалось. В других проанализированных структурах (зубчатая фасция и поле СА1 вентрального гиппокампа) c-fos повышался через час, но не через 4 часа после обучения во всех экспериментах независимо от базового уровня. Исследование экспрессии c-fos после напоминания через 24 часа после обучения и сбора образцов через час после напоминания не показало изменений ни по сравнению с пассивным контролем, ни по сравнению с группой без напоминания. Сильных изменений уровней Igf2 и Igfbp6 в данных структурах не обнаружено, хотя можно отметить некоторое снижение уровня экспрессии Igf2 на 4-часовой точке в экспериментальной группе по сравнению с активным контролем в вентральной зубчатой фасции и правой прелимбической коре. Анализ достоверности полученных результатов будет проводиться на третьем году эксперимента после обработки всех полученных образцов и учёта фактора базового уровня c-fos. Также отработана методика детекции молекул РНК в образцах мозга (RNAScope). В ходе работы удалось обнаружить экспрессию мРНК Igf2 в срезах гиппокампа и коры мозга, причём локализация внутри структуры позволяет предполагать нейрональную экспрессию (хотя это требует дополнительного анализа).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На 3м году выполнения проекта проводили эксперименты по изучению изменения экспрессии генов в отдельных областях гиппокампа мышей после обучения как с помощью полногеномного секвенирования транскриптома, так и с помощью ПЦР в реальном времени. Также проводили изучение экспрессии разных Igf-связывающих белков в разных отделах гиппокампа и в коре мозга. Далее мы изучали влияние сверхэспрессии Igf2 в мозге и в культуре нейронов на синаптическую пластичность и память. Для полногеномного секвенирования транскриптома было получено 2-3 образца из четырех отделов гиппокампа и из левой и правой прелимбической коры для контрольной группы и для группы, в которой образцы были собраны через час после обучения в модели контекстного условно-рефлекторного страха. После анализа полученных данных дифференциальная экспрессия генов была отдельно подсчитана для каждой исследуемой области мозга. Общей для большинства зон была повышенная экспрессия различных комбинаций немедленных ранних генов – в частности, экспрессия Arc была отмечена во всех 6 областях (хотя анализ с помощью ПЦР в реальном времени показал, что в левой вентральной зубчатой фасции изменения недостоверны), также обнаружено увеличение экспрессии немедленного раннего гена c-Fos во многих областях. Тем не менее, наиболее существенные изменения были отмечены лишь в двух участках: левой дорсальной CА1 зоне и правой прелимбической области коры. Также мы сравнили экспрессию гена c-Fos в разных отделах гиппокампа через час после обучения с помощью ПЦР в реальном времени на большей выборке животных для статистического анализа. Мы обнаружили, что предъявление новой обстановки вызывает увеличение экспрессии гена c-Fos во всех изучаемых отделах гиппокампа. Стоит отметить, что сочетание новой обстановки с электрокожной стимуляции не оказало дополнительного эффекта по сравнению с предъявлением только новой обстановки, поэтому статистический анализ проводился между контрольными мышами и мышами, которым был предъявлен новый контекст вне зависимости от сочетания с электрокожной стимуляцией. На предыдущем году выполнения проекта такой же эффект был обнаружен для левой и правой прелимбической коры. Анализ генной онтологии дифференциально экспрессируемых локусов в зоне дорсальной области СА1 показал преобладание среди них рибосомных генов, а также таких значимых категорий как долговременная потенциация, рост аксонов, действие нейротрофинов. Для того, чтобы проверить гены, связанные с IGF-инсулиновым путём, мы загрузили список дифференциально-экспрессируемых генов (по порогу скорректированного значения p<0,1) в дорсальной области СА1 в базу данных geneontology.org. Для дальнейшего анализа с помощью ПЦР в реальном времени на большей выборке животных были отобраны два гена – Irs2 и Akt1. IRS2 является специфичным компонентом IGF-инсулинового пути, в то время как многие другие компоненты являются общими для разных нейротрофических путей. Akt1 показал наибольшее увеличение экспрессии при анализе транскриптома с помощью полногеномного секвенирования. Мы обнаружили, что экспрессия мРНК гена Irs2 достоверно увеличивается при предъявлении нового контекста в дорсальной области СА1 и в вентральной зубчатой фасции, но не в других исследуемых областях гиппокампа. Экспрессия мРНК гена Akt1 не меняется достоверно в изолированных областях СА1 и зубчатых фасциях через час после предъявления новой обстановки. На основе полученных данных об изменении экспрессии гена Irs2 в некоторых областях гиппокампа написана статья и направлена в рецензируемый журнал. Анализ транскриптома показал, что экспрессия РНК некоторых Igf-связывающих белков характеризуется локальностью: Igfbp6 экспрессируется в большей степени в прелимбической коре, тогда как экспрессия Igfbp5 преобладает в зубчатой фасции, а экспрессия Igfbp4 – в области СА1 гиппокампа и в прелимбической коре мозга мышей. В предыдущем году работы мы обнаружили с помощью флуоресценции, что белок Igfbp2 на фотографиях мозга локализуется преимущественно в ядрах клеток. Мы проанализировали фотографии с помощью конфокальной микроскопии, а также с дополнительным окрашиванием ядер на DAPI. Анализ полученных изображений показал колокализацию окрашенных областей с окрашиванием на DAPI. Чтобы проверить, насколько действие антител специфично, мы выделили ядра клеток из ткани мозга и обнаружили, что детекция предполагаемого белка c помощью вестерн-блоттинга происходит только в ядерной фракции, но не в надосадочной жидкости. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Igfbp2 может локализоваться в ядрах. Некоторые данные об экспрессии Igf2 и Igf-связывающих белков, полученные на основе анализа открытых баз данных, опубликованы в рецензируемом журнале (Beletskiy A, Chesnokova E, Bal N. Insulin-Like Growth Factor 2 As a Possible Neuroprotective Agent and Memory Enhancer-Its Comparative Expression, Processing and Signaling in Mammalian CNS. Int J Mol Sci. 2021). Также мы провели эксперименты in vivo для исследования действия сверхэкспрессии Igf2, вызванной вирусной трансдукцией. В работе было несколько экспериментальных групп. Первой группе моделировали фототромбоз c помощью бенгальского розового (БР) и вводили вирус на основе плазмиды p156_CMV:Igf2-IRES-GFP (Igf2_БР). Вторая группа переносила ложную операцию и введение вируса p156_CMV:Igf2-IRES-GFP (Igf2_ЛО). Третьей группе моделировали фототромбоз и вводили контрольный вирус p156_CMV:GFP (вектор_БР). Четвертая группа подвергалась ложной операции и введению контрольного вируса (вектор_ЛО). Для тестирования памяти был выбран тест на распознавание местоположения объектов, для анализа исследовательской активности проводили норковый тест. Тест на распознавание местоположения объекта показал недостоверное повышение индекса распознавания в ложнооперированной группе с вирусом для оверэкспрессией Igf2 по сравнению с остальными группами через неделю после операции. При этом в большинстве групп индекс был близок к нулю, что возможно, связано с тем, что животные не до конца восстановились после операции. Через 4 недели после операции тест на распознавание местоположения объекта показал недостоверное снижение индекса распознавания в ложнооперированной группе с контрольным вирусом по сравнению с животными с фототромбозом и введением контрольного вируса. В группе с введением вируса с Igf2 у ложнооперированных животных также наблюдается более низкая медиана по сравнению с ложнооперированной группой с введением контрольного вируса, однако различия также недостоверны. В группе Igf2-БР наблюдается промежуточное значение между группами вектор-ЛО и вектор-БР, что не исключает возможного защитного действия Igf2 на животных с фототромбозом. Однако, снижение (хоть и недостоверное) индекса в группе Igf2-ЛО может указывать на возможное негативное действие Igf2 в прелимбической коре на рабочую память у здоровых животных. Норковый тест на исследовательскую активность показал слабое недостоверное снижение количества исследуемых «норок» в группе с введением вируса с Igf2 вне зависимости от индукции фототромбоза. Для анализа как возможных нейропротективных эффектов, так и негативных эффектов требуется увеличение количества животных в выборках для увеличения статистической мощности. Для функционального исследования роли IGF2 в нейронах мы провели эксперименты с хронической сверхэкспрессией Igf2, вызванной вирусной трансдукцией культуры нейронов, а также острые эксперименты с добавлением человеческого рекомбинатного инсулиноподобного фактора 2 в гиппокампе крыс. Культура нейронов была посажена из мозга новорожденных крысят. На 4-й день культивирования в лунки были добавлены 3 мкл вируса на основе плазмиды p156_CMV:Igf2-IRES-GFP (Igf2-GFP) или 1 мкл вируса на основе плазмиды p156_CMV:GFP (GFP). Эксперимент проводился на 14-15 день культивирования. Электрофизиологическая регистрация проводилась методом пэтч-клямп в режиме «целая клетка». Для оценки вклада кальций-проницаемых АМПА рецепторов использовался метод регистрации индекса выпрямления (RI). Индекс выпрямления отображает внутреннее выпрямление кальций-проницаемых АМПА рецепторов и оценивается как соотношение амплитуды тока, измеренной при -70 mV и при +35 mV (EPSC-70mV/ EPSC+35 mV). Мы не обнаружили статистически достоверной разницы между индексом выпрямления контрольных нейронов (2.3±0.3, n=7) и нейронов, трансдуцированных вирусом с геном Igf2 (2.8±0.4. n=7), что свидетельствует о том, что оверэкспрессия Igf2 не влияет на вклад кальций-проницаемых АМПА рецепторов. Регистрация парной фасилитации выявила достоверную разницу между контрольными клетками (0.8±0.03, n=7) и клетками, трансдуцированными Igf2 (1.03±0.04, n=9, p=0.014, T-критерий Стьюдента), что свидетельствует о том, что оверэкспрессия Igf2 достоверно изменяет пресинаптический вклад в синаптическую трансмиссию. Для оценки влияния IGF2 на долговременную потенциацию срезы гиппокампа были получены от крыс возрастом около 1,5 мес. Стимулирующий и регистрирующий электроды помещались в str.radiatum поля СА1 гиппокампа. Нестабильная долговременная потенциация была вызвана слабой тета-стимуляцией (ТБС). 10 нМ инсулиноподобного фактора 2 были добавлены за 20 минут до индукции долговоременной потенциации. Эксперименты показали, что добавление IGF2 приводит к стабилизации потенциации, которая удерживается в течение часа, в отличие от контрольных срезов, в которых она постепенно падает практически до исходного уровня. Стоит отметить, что добавление пептида до индукции потенциации привело к увеличению парной фасилитации, которая изменялась как за счёт небольшого уменьшения амплитуды первого стимула, так и более существенного роста второго стимула через 50 мс. При этом увеличенная парная фасилитация наблюдалась для разных интервалов – от 30 до 100 мс. Таким образом, нами показано, что как в культуре нейронов млекопитающих при хронической оверэкспрессии Igf2, так и в острых экспериментах со срезами гиппокампа с добавлением экзогенного пептида наблюдается увеличение парной фасилитации под действием данного фактора, что свидетельствует о возможной роли Igf2 в регуляции пресинаптического выброса. Кроме того, добавление Igf2 стабилизирует долговременную потенциацию, что согласуется с литературными данными.