Аннотация результатов, полученных в 2018 году
При выполнении первого этапа проекта нами проведено исследование 97 внутриклеточных киназ, ассоциированных с различными молекулярными каскадами. Основной целью проекта является характеристика и выявление компонентов нейронального кинома с ранее не описанными нейропротективными свойствами. Было проведено изучение жизнеспособности первичных культур нервных клеток при блокаде тех или иных молекулярных каскадов в условиях нормы и после моделирования глюкозной депривации (одного из ключевых факторов ишемического повреждения). Исследования проводили на 21 день развития первичной культуры, через 7 дней после моделирования глюкозной депривации. Была собрана основная информация о роли каждого из исследованных представителей клеточного кинома, изучаемые киназы были сгруппированы по основным метаболическим путям. Было выявлено несколько направлений действия блокады ферментов: К первой группе можно отнести киназы, которые влияют на жизнеспособность клеток в нормальных условиях и этот эффект еще более выражен при действии стресс-фактора. К таким киназам относится DYRK1A киназа, а также киназы RET и PAK4. Вторая, наиболее широко представленная группа, это киназы, оказывающие влияние на жизнеспособность в нормальных условиях и не вызывающие изменений относительно контроля в условиях глюкозной депривации (показатели жинеспособности в этой группе на уровне показателей группы глюкозная депривация) - TGFR1 (FLT2), TGFR2, TGFR3, TGFR4, FLT4, hfr1 (сRaf), mTORComplex 1 (mTORC1), mTORComplex 2 (mTORC2), все исследованные представители MEK/ERK - киназного каскада (Erk2, Erk1, BRAF (B-raf), RAF1 (c-Raf), большинство представителей каскада, активируемого TNFa-рецептором (p38MAPK, TNF-alpha Production inhibitor, p38a, JNK3), а также такие киназы, как MER, FAK1, p70S6K, FMS. К третьей группе относятся киназы, блокада которых в нормальных условиях не вызывает достоверного изменения жизнеспособности, но при моделировании глюкозной депривации эффект данных ферментов значим (киназы TGFbR1 (ALK5), TGFbR2). Наибольший интерес представляют киназы, ингибирование которых в условиях глюкозной депривации вызывает достоверное увеличение жизнеспособности: eEF2K - киназа эукариотического фактора элонгации-2, SRC киназа, IKKb киназа. Таким образом проведенные на первом этапе исследования позволили выявить несколько разнонаправленных групп действия различных участников кинома и охарактеризовать физиологически наиболее значимые киназы. Особый интерес, наряду с наиболее сильно влияющими на жизнеспособность клеток в культуре, могут представлять киназы, блокада которых может приводить к увеличению жизнеспособности клеток нервной системы в условиях стресса. Далее было проведено более детальное исследование влияния некоторых киназ, обладающих нейропротекторным действием, на жизнеспособность и метаболическую функциональную активность первичных культур нервных клеток гиппокампа (Ret-киназа, являющаяся компонентом гетеродимерного рецептора глиального нейротрофического фактора GDNF, киназы cRAF и PAK4, входящие в состав сигнального каскада Ras / МАРК), а также AKT-киназы, являющихся компонентами альтернативных путей, активируемых рецепторами нейротрофических факторов (PI3K/Akt-каскад), и киназы MAP3K5 (ASK1), блокада которой не вызывала изменений жизнеспособности в норме, однако значительно снижала жизнеспособность клеточных культур при моделировании глюкозной депривации). Проведен флуоресцентный кальциевый имиджинг для выявления влияния блокады ключевых киназ на спонтанную кальциевую активность клеток первичных культур гиппогкампа мыши. Показано, что ключевую роль в формировании кальциевой активности играет киназа PAK4. Ее блокада приводит к выраженному резкому снижению кальциевой активности. Также негативное влияние как на жизнеспособность, так и на метаболическую активность нервных клеток оказывает блокада RET- киназы. Выраженное влияние PAK4 как на жизнеспособность, так и на функциональную активность клеток может быть обусловлено тем, что PAK4 стимулирует выживание клеток путем фосфорилирования антагониста BCL2 гибели клеток BAD. Таким образом, ее блокада приводит к катастрофическим изменениям функционирования нервных клеток. Далее нами было проведено исследование роли блокады двух выявленных на предыдущих этапах ключевых киназ (RET и PAK4), обладающих нейропротективным действием, в реализации разных стресс-индуцированных типов клеточной смерти (апоптоз/некроз). Для исследования было проведено моделирование двух различных стресс-факторов, являющихся компонентами ишемического повреждения – глюкозной депривации и гипоксии. Показано, что глюкозная депривация вызывает гибель клеток по некротическому типу. Гипоксия приводит к увеличению как числа апоптотических, так и некротических элементов. Блокада RET киназы приводит к изменению соотношения различных типов клеточной смерти. Возрастает число апоптотических элементов (ранний апоптоз) , а число некротических элементов напротив снижается. Блокада PAK4 киназы при приводит увеличению числа поздних апоптотических элементов. Также при выполнении работ по проекту был разработан новый алгоритм обработки данных спонтанной нейросетевой активности, который на следующем этапе проекта будет применен для выявления при последующем выполнении проекта особенностей реорганизации нейронных сетей in vitro в условиях стресса и/или при применении ингибиторов киназ. Для записи данных используется зарекомендовавшая себя технология мультиэлектодных матриц (multielectrode arrays), позволяющих неинвазивно регистрировать внеклеточные потенциалы действия. Для решения поставленной задачи было реализовано параллельное детектирование импульсов по всем активным электродам. Метод основан на применении порога, рассчитанного по среднеквадратичному отклонению от ожидаемого уровня сигнала, помноженному на коэффициент, который зависит от параметров исследуемой записи: уровня шума, плотности клеток, относительной амплитуды полезного сигнала (событий), и определяется в каждом случае индивидуально. Разработаны алгоритмы определения начала и конца сетевой пачки, частоты сетевых пачек и других важнейших параметров сетевой биоэлектрической активности. Для визуализации картины внутренних взаимодействий в нейронной сети in vitro используется модифицированный метод графов. Для валидации разработанного метода нами было проведено исследование изменения показателей нейросетевой активности в процессе развития первичной диссоциированной культуры клеток головного мозга. С этой целью были проанализированы записи спонтанной активности на разных сроках развития культуры в норме и при добавление биохимического стимула, влияющего на развитие нейронной сети и дифференцировку клеточных ансамблей. Результаты проведенных исследований по проекту опубликованы в двух статьях в рецензируемых журналах, входящих в базы цитирования WoS, одна их которых в журнале Front Physiol., IF= 4,18, Q1. Таким образом, все поставленные в плане-графике задачи первого этапа выполнения проекта выполнены в полном объеме. Члены научного коллектива проекта благодарят лабораторию проф. Д.Каплана, университет Шаритэ, Берлин, за предоставленную библиотеку ингибиторов.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На втором этапе проекта продолжены работы по выявлению представителей нейронального кинома, обладающих нейропротекторным действием. Выявлены киназы, играющие ключевую роль в поддержании жизнеспособности нервных клеток в нормальных условиях, а также киназы, обладающие выраженным нейропротективным эффектом при воздействии факторов ишемии (глюкозной депривации, гипоксии). Наибольший интерес привлекли киназы, ингибирование которых не влияло либо снижало выживаемость клеток в нормальных условиях, но повышало ее при моделируемом стрессе. На втором этапе проекта данный эффект обнаружен для FLT4 киназы. Имеющиеся в литературе сведения о роли данного фермента для клеток нервной системы ограничены, однако выраженный нейропротективный обуславливает необходимость подробного исследования внутриклеточных каскадов, в которых задействована данная киназа. Также выявлен ряд представителей кинома, обладающих выраженной нейропротективной активностью (IRAK1, IKK2, CHK2, KIT, PDGFRb, FGFR3, JAK2, IRAK4, CDK4, CDK6, PIM1, FLT4, ErbB2), а также киназы, ингибирование которых усиливает действие глюкозной депривации (DAGK). Ключевой задачей второго этапа проекта было изучение основных характеристик спонтанной биоэлектрической и кальциевой активности первичных нейрональных культур и особенностей реорганизации нейрон-глиальных сетей на фоне блокады киназ и воздействия факторов ишемии. При исследовании функциональной кальциевой активности были проанализированы не только основные параметры кальциевых осцилляций, но и сетевые характеристики кальциевой активности первичных нейрональных культур с помощью разработанного оригинального математического алгоритма. На основе колебаний внутриклеточного уровня кальция отдельных клеток был проведен корреляционный попарный анализ. Были рассмотрены три основных показателя: средний уровень корреляции кальциевых сигналов между клетками, число функциональных связей на одну клетку и процент скоррелированных связей от общего числа возможных связей. Показано, что воздействие глюкозной депривации и гипоксии оказывают негативное влияние на сетевую кальциевую активность первичных нейрональных культур. Оба фактора ишемии приводят к значимому снижению процента клеток, проявляющих кальциевую активность и частоты кальциевых осцилляций при неизменности длительности кальциевых осцилляций. Гипоксия вызывает наиболее выраженный эффект и приводит к снижению частоты кальциевых событий в 3 раза относительно контрольных значений. Моделирование факторов ишемии приводило к значимым изменениям корреляционных и динамических свойств клеток первичных нейрональных культур и снижению значений сетевых характеристик. Некоторые ингибиторы киназ, для которых был установлен выраженный нейропротекторный эффект при моделировании глюкозной депривации, не предотвращают потерю сетевой активности. Например, ингибирование JAK2 киназы приводило к угнетению сетевой активности в первичной нейрональной культуре как в норме, так и при моделировании глюкозной депривации и гипоксии. Напротив, ингибирование FLT4 киназы способствовало не только сохранению, но и стимуляции сетевой активности после воздействия глюкозной депривации и частично после гипоксии. Так как наблюдаемые эффекты оценивались в отдаленный период, данное усиление активности не может рассматриваться как эксайтотоксичность, а непосредственно связано с поддержанием функциональных характеристик сети. Для анализа спонтанной биоэлектрической активности первичных нейрональных культур был применен метод неинвазивной долговременной регистрации нейросетевого сигнала с помощью мультиэлектродных зондов. Этот метод позволяет выявить сетевые взаимоотношения топографически сформированной локальной нейрон-глиальной сети. При этом активность глиальных клеток не учитывается, так как изучаются только внеклеточные электрические потенциалы. Анализ биоэлектрической сетевой активности крайне сложная задача, требующая обработки большого числа мультиканальных электрических сигналов в пространственном и временном масштабе. С целью выявления особенностей реорганизации нейронных сетей на фоне блокады киназ и моделируемого стресса разработан новый алгоритм обработки данных спонтанной нейросетевой активности. Показано, что ингибирование eEF2K киназы способствует сохранению жизнеспособности клеток первичных нейрональных культур в отдаленном периоде после воздействия глюкозной депривации, однако приводит к угнетению спонтанной биоэлектрической активности клеток и разрушению внутренней функциональной структуры нейронной сети. Ингибирование представителей JAK/STAT киназного каскада играет важную роль в активации нейропротекторных механизмов, способствующих поддержанию как жизнеспособности, так и функциональной нейросетевой активности первичных нейрональных культур в отдаленном периоде после воздействия фактора ишемии с частичным сохранением внутренней функциональной структуры нейронной сети. Таким образом, второй этап проекта был связан с расширением спектра протестированных ингибиторов различных киназ в первичных нейрональных культурах и глубоким изучением функциональной реорганизации нейрон-глиальных сетей при ингибировании значимых представителей нейронального кинома. С этой целью было разработано два метода анализа сетевой активности. Были выявлены ранее не описанные представители нейронального кинома, обладающие нейропротективным эффектом и сохраняющие функциональную нейросетевую активность. По завершении второго этапа проекта опубликовано две статьи в изданиях, индексируемых базами данных WoS и Scopus, входящих в первый квартиль (Q1). Члены научного коллектива проекта благодарят лабораторию проф. Д.Каплана, университет Шаритэ, Берлин, за предоставленную библиотеку ингибиторов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На третьем этапе выполнения проекта проведено исследование специфичности нейропротекторного действия выбранных киназ для нервных клеток. Для этого исследовано влияние соответствующих блокаторов на жизнеспособность клеток нормальной печени человека (клеточная линия Chang liver) в норме и при моделировании факторов ишемии. Продемонстрировано, что как ГД, так и гипоксия приводят к достоверному снижению числа жизнеспособных клеток в культуре Chang liver по сравнению с интактными культурами. Блокаторы киназ SRC, IKKb, eEF2K, FLT4, RIPK, IRAK1, IRAK4, CHL2, JAK2, ErbB2 не оказали протекторного эффекта при воздействии обоих стресс-факторов. Отсутствие влияния на жизнеспособность клеток культур отличного от нейронального происхождения (печень человека, энтодермальный зародышевый листок), свидетельствует о тканеспецифичности протективного действия исследуемых киназ при действии факторов ишемии. Далее были выполнены исследования наиболее перспективных киназ на устойчивость лабораторных животных к действию факторов ишемии. По совокупности влияния на жизнеспособность нервных клеток в норме и при моделировании стресс-факторов и действию на функциональную кальциевую и биоэлектрическую активность для исследований in vivo были выбраны киназы SRC, IKKb и RIPK1. Исследования проводились на самцах мышей линии C57Bl/6. Было проведено можелирование острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) и моделирование ишемии методом односторонней окклюзии сонной артерии. Показано, что ингибирование RIP и SRC киназ повышает устойчивость животных к гипоксическому и ишемическому повреждению, что проявляется в повышении доли высоко- и среднеустойчивых животных. Ингибирование RIP киназы с помощью ингибитора necrostatun-1 повышало выживаемость животных при моделировании острой гипобарической гипоксии. Проведено поведенческое тестирование для оценки когнитивных и мнестических способностей животных в отдаленном постишемическом периоде. При блокаде киназ RIPK1 и SRC наблюдается нормализация ориентировочно-исследовательской активности животных в тесте «Открытое поле» и поддержание мнестических способностей (отсроченного коэффициента сохранения памяти в тесте «Водный лабиринт Морриса). Морфологический анализ тканей головного мозга, а также выполненнение магнитно-резонансной томографии подтвердило, что и при гипоксическом, и при ишемическом повреждении головного мозга наиболее выраженное защитное действие на структуру нервной ткани наблюдается при применении ингибитора RIP киназы Necrostatin-1. Блокада киназы IKKb негативно влияет на морфологическую структуру коры головного мозга при моделировании ОГБГ. Таким образом, наиболее выражен протекторный эффект при применении ингибитора RIP киназы necrostatin-1. Применение ингибитора IKKb киназы напротив негативно влияло на выживаемость животных при моделировании ОГБГ и ишемии. Для понимания механизмов адаптации организма, направленных на повышение устойчивости тканей к дефициту кислорода, исследование энергетического обмена имеет первостепенное значение. Проведено исследование функционального состояния митохондриального аппарата нервных клеток в тканях головного мозга после моделирования ОГБГ с помощью респирометра высокого разрешения Oroboros Oxygraph-2k (Oroboros, Австрия). Анализ состояний V4 (окисление субстратов глутамат и малат) и V3 (субстраты глутамат и малат + АДФ) позволяет предположить, что нейропротекторное действие блокады RIP1 киназы при моделировании ОГБГ и ишемического повреждения головного мозга ассоциировано с умеренной активацией функциональной активности II комплекса дыхательной цепи митохондрий. Результаты проведенных исследований по проекту опубликованы в 11 публикациях в рецензируемых журналах, входящих в базы цитирования WoS, пять за которых входят в категорию Q1. Таким образом, все поставленные в плане-графике задачи проекта выполнены в полном объеме. Члены научного коллектива проекта благодарят лабораторию проф. Римы Аль-Альвар, Университет Онтарио, Торонто, Канада, а также проф. Давида Каплана, Шарите, Германия, за предоставленную библиотеку ингибиторов.