КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-75-10060

НазваниеРазработка и оценка эффективности мультимодальных систем для адресной терапии рака молочной железы

РуководительЕфремова Ольга Александровна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирская обл

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2021 

КонкурсКонкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-109 - Клиническая лабораторная диагностика и нанотехнологии в медицине

Ключевые словатаргетная терапия, онкологические заболевания, мезопористые частицы, диоксид кремния, наноантитела, фотодинамическая терапия, фототермическая терапия

Код ГРНТИ76.09.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Настоящий проект направлен на разработку новой мультимодальной терапевтической платформы для лечения рака молочной железы. Платформа будет основана на микро- и наночастицах мезопористого диоксида кремния (SiO2), конъюгированного с нано-моноантителами, и будет включать люминесцентные, цитостатические, фотодинамически и фототермически активные агенты. В качестве основных объектов исследования выступают мезопористые нано- и микрочастицы диоксида кремния, включающие в свой состав фотоактивные октаэдрические кластерные комплексы металлов и наночастицы золота. В ходе работы над проектом данные частицы будут конъюгированы с нано-моноантителами C7b, специфичными к рецепторам HER2 (рецептор к эпидермальному фактору роста). Поскольку клетки рака молочной железы имеют высокую степень экспрессии на своей поверхности рецепторы HER2, конъюгация с нано-моноантителами существенно повысит таргетность разрабатываемого препарата. Также в ходе работы частицы диоксида кремния, конъюгированные с наноантителами и включающие в себя кластерные комплексы металлов и наночастицы золота, будут модифицированы включением в их состав молекул доксорубицина, которые будут выделяться после проникновения частиц в опухолевые клетки. Это усилит терапевтивескую эффективность создаваемого препарата, добавляя к фототермическому и фотодинамическому действию цитостатический эффект. На каждом этапе модификации планируется изучение биологических свойств синтезированных соединений, в частности, темновой и фотоиндуцированной цитотоксичности, оценка проникновения препарата в клетки и исследование внутриклеточной локализации, кинетики накопления и выведения частиц из клетки. Кроме того, планируется изучить острую токсичность и биораспределение наиболее перспективных соединений на лабораторных животных (мыши) и впервые изучить фотоиндуцированную противоопухолевую активность полученных препаратов in vivo.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения настоящего проекта ожидается получить мультимодальный препарат на основе мезопористых микро- и/или наночастиц диоксида кремния, октаэдрических кластерных комплексов металлов, наночастиц золота, наноантител C7b и доксорубицина и изучить их биологические свойства in vitro и in vivo. Предполагается, что результаты выполнения проекта в дальнейшем позволят создать препарат для таргетной терапии опухолей молочной железы, включающий фототермическое, фотодинамическое и цитостатичнское действие. Получение и конъюгация наноантител C7b будет проходить по методике, разработанной участниками проекта, которая не использовалась до этого в создании терапевтических препаратов подобного типа. Полученные в результате исследования данные будут доложены на российских и международных научных конференциях, проводимых в 2018-2020 годах. Кроме того, данная работа будет доложена на различных молодежных конференциях, например, Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» и Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Полученные результаты также планируется опубликовать в серии статей в ведущих международных журналах.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетном году был проведен ряд исследований, касающихся получения наночастиц золота, покрытых слоем диоксида кремния, содержащего кластерные комплексы состава (Bu4N)2[{Mo6I8}L6] (L = NO3-, OTs-), изучения их фотодинамических, фототермических, а также биологических свойств. Размер наночастиц золота был подобран, исходя из оптимального перекрывания их полосы поглощения и люминесценции кластерного комплекса, а сами наночастицы размером 106.86 ± 6.88 нм синтезированы трехстадийным зародышевым методом. Покрытие осуществлялось в две стадии: сначала ПЭГ-модифицированные наночастицы золота покрывались слоем чистого SiO2, а затем уже полученные наночастицы покрывались тонким слоем SiO2 со включенным кластерным комплексом. Затем путем анализа спектров люминесценции, УФ-спектров и ПЭМ-изображений полученных материалов была определена оптимальная толщина оболочки SiO2 и количество включаемого кластерного комплекса, при которых сохранялись плазмонные свойства, наблюдалась наибольшая интенсивность эмиссии и не происходило искажения сферической формы частиц. Суммарная толщина оболочки составила 20.5 ± 2.1 нм, а количество включаемого комплекса – 3 мг на 1 мг SiO2. Изучение фотодинамических свойств полученных материалов показало, что материалы, содержащие наночастицы золота, демонстрируют в два раза большую эффективность в процессах генерации активных форм кислорода, чем материалы, содержащие только кластерный комплекс. Интересно, что при замене нитратного комплекса на тозилатный наблюдалось более чем трехкратное увеличение наблюдаемой константы скорости превращения «ловушки» на синглетный кислород (3.85*10-2 мин-1 против 1.13*10-2 мин-1). Исследование фототермических свойств полученных материалов показало, что они могут возбуждаться как под действием УФ-облучения с длиной волны 400 нм, так и под ближним ИК-излучением с длиной волны 800 нм, что делает их перспективными кандидатами для биологических применений. В обоих случаях коллоидные растворы материалов, содержащих нитратный кластерный комплекс, демонстрировали наибольшую скорость и эффективность нагрева. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что материалы, содержащие кластерный комплекс состава (Bu4N)2[{Mo6I8}(NO3)6], являются более перспективными агентами для фототермической терапии, а материалы со включенным кластерным комплексом состава (Bu4N)2[{Mo6I8}(OTs)6] наиболее эффективны в качестве агентов для фотодинамической терапии. Вторым большим блоком работы стало изучение биологических свойств материалов. Исследование темновой токсичности на клеточных линиях DK-4, SKBR и MCF-7 с помощью стандартного МТТ-теста показало, что на всех трех изученных линиях частицы не проявляют значительной темновой токсичности, что говорит об их безопасности для тканей организма в отсутствие облучения. Для того, чтобы исследовать кинетику накопления и выведения частиц, первоначально был использован метод проточной цитометрии, который показал, что клетки, инкубированные как с содержащими, так и с не содержащими золото частицами, не проявляли значительной люминесценции даже через 8 часов инкубирования. Однако, согласно данным флуоресцентной микроскопии, наночастицы, которые проявляли яркую люминесценцию, локализовались либо между клеток, либо на их поверхности, а при проникновении в клетку переставали люминесцировать. Данный эффект связан с эффективным тушением люминесценции частиц кислородом, содержание которого повышено в раковых клетках. Более подробная оценка проникновения частиц в клетки и их внутриклеточного распределения методом трансмиссионной электронной микроскопии показала, что в клетках линии DK-4 наблюдалось два основных типа локализации наночастиц: в одномембранных везикулах и в миелиноподобных структурах, что говорит о том, что наиболее вероятными механизмами проникновения наночастиц в клетку являются фаго- или пиноцитоз. В клетках линии MCF-7 частицы чаще всего локализовались в лизосомах и фаголизосомах. Наиболее вероятным механизмом проникновения в данном случае являлся неспецифический пиноцитоз. Поскольку было показано, что кластер-содержащие наночастицы могут проникать в клетки, проявляя при этом низкую темновую токсичность, далее было проведено исследование их фотоиндуцированной токсичности. Наилучшие результаты продемонстрировал образец, содержащий наночастицы золота и кластерный комплекс (Bu4N)2[{Mo6I8}(OTs)6]. Таким образом, было доказано, что материалы такого типа являются наиболее эффективными фотосенсибилизаторами, а сочетание их низкой темновой токсичности с довольно высокой фотоиндуцированной токсичностью делает их перспективными агентами для терапии раковых опухолей.

 

Публикации

1. - Ученые Новосибирского Академгородка работают над новым способом лечения рака Вести Новосибирск, http://newsvideo.su/video/9046502 (год публикации - ).

2. Воротников Ю.А., Позмогова Т.Н., Соловьева А.О., Мирошниченко С.М., Воронцова Е.В., Шестопалова Л.В., Миронов Ю.В., Шестопалов М.А., Ефремова О.А. Luminescent silica mesoparticles for protein transduction Materials Science and Engineering C, V. 96, pp. 530-538 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетном году был проведен ряд исследований, касающихся получения, характеризации и изучения свойств непористых и мезопористых материалов на основе наностержней золота и октаэдрических кластерных комплексов молибдена, а также их конъюгатов с наноантителами C7b к рецепторам HER2. Поскольку на люминесцентные и фотодинамические свойства подобных комбинированных материалов влияет степень перекрывания полос поглощения наночастиц и эмиссии флуорофора, мы исследовали материалы, содержащие три типа наностержней золота с максимумами поглощения на 613 (AR = 1.5), 679 (AR = 2.5) и 768 (AR = 4.0) нм, обеспечивающими перекрывание с полосой эмиссии кластерного комплекса в различных областях спектра. Путем анализа спектров люминесценции, УФ-спектров и ПЭМ-изображений полученных материалов были определены оптимальная толщина оболочки SiO2 и количество включаемого кластерного комплекса, при которых наблюдалась наибольшая интенсивность эмиссии с сохранением плазмонного резонанса и формы частиц. Для всех материалов суммарная толщина оболочки составила 7-10 нм, а количество включаемого комплекса – 3 мг на 1 мг SiO2. Анализ спектров люминесценции полученных материалов показал, что при изменении размера включаемых наностержней золота, т.е. при изменении области перекрывания, меняется и форма полосы эмиссии кластерных комплексов. Для сферических наночастиц золота и близких к ним наностержней с AR = 1.5 наблюдается сужение спектра люминесценции в коротковолновой области по сравнению с материалами, не содержащими наночастиц золота. В свою очередь, для наностержней с AR = 2.5 и 4.0 наблюдается значительный гипсохромный сдвиг максимума эмиссии, а в случае AR = 2.5 еще и значительное снижение интенсивности эмиссии. Таким образом, различия в форме и положении полос эмиссии при использовании частиц золота с разными AR показывают, что люминесцентные свойства комбинированных материалов сильно зависят от области перекрывания полос поглощения наночастиц золота и эмиссии кластерных комплексов. Изучение фотодинамических свойств полученных материалов показало, что материалы, содержащие наностержни золота с AR = 4.0, демонстрируют наибольшую эффективность в процессах генерации активных форм кислорода, причем эта эффективность практически не зависит от состава исходного кластерного комплекса. Таким образом, в сравнении с лучшими результатами, полученными в прошлом году для сферических частиц, эффективность генерации 1O2 возросла в 9.5 раз. Поскольку проведенные эксперименты показали, что материалы, содержащие наностержни золота с AR = 4.0, являются наиболее перспективными агентами для фотодинамической терапии, в дальнейшем именно они использовались для изучения фототермических и биологических свойств. Исследование фототермических свойств полученных материалов показало, что они могут возбуждаться как под действием УФ-облучения с длиной волны 400 нм, так и под ближним ИК-излучением с длиной волны 800 нм. Наибольшую эффективность нагрева образцы продемонстрировали под облучением 800-нм фемтосекундным лазером. Биологические свойства полученных материалов были исследованы на клетках линии SKBR3. Цитотоксичность была изучена методом МТТ. Было показано, что, как и в случае сферических частиц, покрытие частиц слоем диоксида кремния приводит к снижению клеточной токсичности, а включение комплекса не сказывается на токсических показателях системы. Методом проточной цитометрии с использованием нетоксичных концентраций был показан факт проникновения частиц в клетку. Следующим блоком нашей работы была конъюгация полученных материалов с наноантителами C7b к рецепторам HER2. Она осуществлялась путем модификации поверхности частиц эпоксидными группами и их дальнейшего связывания с наноантителами. Иммуноферментный анализ полученных материалов показал, что наноантитела сохраняют аффинность к рецепторам HER2 даже после связывания с наночастицами. Кроме того, нами была начата работа по получению и характеризации мезопористых материалов на основе наностержней золота. Покрытие слоем мезопористого диоксида кремния осуществлялось методом травления с предварительной защитой поверхности. Исследование фотодинамических свойств полученных материалов показало, что независимо от состава исходного кластерного комплекса они демонстрируют в 1.4-1.5 раз большую эффективность в процессах генерации синглетного кислорода, чем непористые материалы, что в перспективе делает их более эффективными агентами для фотодинамической терапии.

 

Публикации

1. Воротников Ю.А., Новикова Е.Д., Соловьева А.О., Шаншин Д.В., Цыганкова А.Р., Щербаков Д.Н., Ефремова О.А., Шестопалов М.А. Single-domain antibody C7b for address delivery of nanoparticles to HER2-positive cancers Biomaterials, - (год публикации - 2020).

2. Новикова Е.Д., Воротников Ю.А., Николаев Н.А. Цыганкова А.Р., Ефремова О.А., Шестопалов М.А. Synergetic effect of Mo6 clusters and gold nanoparticles on photophysical properties of both components Journal of Material Chemistry C, - (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном году были завершены исследования фотоиндуцированной токсичности наиболее перспективных материалов на основе наностержней золота с AR = 4.0 на клетках линии MCF-7. Облучение светом с длиной волны 360 нм в течение 30 минут привело к снижению жизнеспособности клеток на 37% в присутствии GNR@SiO2@1 и на 21% в присутствии GNR@SiO2@2. Такое же по длительности облучение белым светом (λ = 400-800 нм) снижало жизнеспособность клеток на 58% в присутствии GNR@SiO2@1 и на 48% в присутствии GNR@SiO2@2. Также мы завершили характеризацию мезопористых наночастиц золота, полученных на втором году выполнения проекта, с помощью методов просвечивающей электронной микроскопии и АЭС-ИСП и установили, что в мезопористые материалы включается в 3 раза больше кластерного комплекса, чем в непористые. Исследование фототермических свойств полученных материалов под действием 800-нм фемтосекундного лазера показало, что водные растворы мезопористых наночастиц золота с нитратным и тозилатным кластерным комплексом нагрелись на 7,4ºС, а раствор наночастиц без кластерного комплекса – на 5,9ºС. Для придания мезопористым материалам дополнительных химиотерапевтических свойств в их поры включался цитостатический препарат цисплатин. По окончании 7 дней в мезопористые наночастицы GNR@mSiO2@1 включалось 95% добавленного цисплатина. По истечении 48 часов в питательной среде высвобождалось 27% препарата. Также нами был исследован альтернативный метод придания терапевтическим системам свойства адресной доставки и разработана гибридная система {W6I8}-DNA для селективной терапии стволовых раковых клеток (СРК) на основе йодидных октаэдрических кластерных комплексов вольфрама (фотосенсибилизатор) и двухцепочечной ДНК человека (система адресной доставки). Методом проточной цитометрии было показано, что максимальное накопление материала в клетках Krebs-2 (клетки карциномы), наблюдается через 2 часа инкубации, и составляет 3%, что соответствует содержанию популяции СРК в данной клеточной культуре. Адресность доставки была изучена с помощью антитела к стволовым клеткам CD133. Согласно полученным данным, эмиссия кластерного комплекса наблюдалась исключительно в клетках, меченных CD133, что подтверждает перспективу данной системы для заявленных целей. Дальнейшее изучение рентген-индуцированной цитотоксичности {W6I8}-DNA показало, что облучение приводит к сокращению популяции СРК примерно в 2,5 раза. Модельные эксперименты in vivo на мышиной модели показали, что инкубированные с {W6I8}-DNA и облученные рентгеновским излучением клетки демонстрируют наименьшую скорость роста с объемом опухоли на 42 день равным 0.28 см3 (~5% от объема опухоли, полученной с помощью необлученных контрольных клеток), что показывает проявление терапевтического эффекта разработанной системы и показывает значимость СРК для общей онкогенности клеточной культуры. Оценка адресности доставки наночастиц, конъюгированных с наноантителами C7b, в раковые клетки, обладающие повышенной экспрессией рецепторов HER2, оценивалась методом АЭС-ИСП. Количество наночастиц, проникающих в клетки линии HepG2, оказалась в 3 раза выше, чем в клетки линии MCF-7, причем как для образцов с наноантителами, так и без них. Кроме того, на обеих клеточных линиях количество наночастиц, проникающих в клетки, примерно на 30% выше для конъюгатов с наноантителами. Эффективность наночастиц GNR@mSiO2@2-cys-С7b в качестве агентов для противораковой терапии исследовалась на мышах линии Nude с привитой раковой опухолью HepG2. После инъекции не было заметно никаких токсических проявлений и отклонениях в поведении мышей, что показывает низкую токсичность полученных соединений. Затем мышь помещали в рестриктор, позволяющий селективно облучать раковую опухоль, и облучали белым светом (источник излучения помещен на расстоянии 10 см от опухоли) в течение 30 минут дважды с интервалом в 24 часа. Ввиду озвученных ранее обстоятельств, данный эксперимент был проведен с задержкой и в настоящее время наблюдение за мышами продолжается.

 

Публикации

1. Воротников Ю.А., Новикова Е.Д., Соловьева А.О., Шаньшин Д.В., Цыганкова А.Р., Щербаков Д.Н., Ефремова О.А., Шестопалов М.А. Single-domain antibody C7b for address delivery of nanoparticles to HER2-positive cancers Nanoscale, V. 12, № 42, pp. 21885-21894 (год публикации - 2020).

2. Новикова Е.Д., Воротников Ю.А., Николаев Н.А., Цыганкова А.Р., Шестопалов М.А. Ефремова О.А. The Role of Gold Nanoparticles' Aspect Ratio in Plasmon-Enhanced Luminescence and Singlet Oxygen Generation Rate by Mo6 Clusters Chemical Communications, - (год публикации - 2021).

3. Новикова Е.Д., Воротников Ю.А., Николаев Н.А., Цыганкова А.Р., Шестопалов М.А., Ефремова О.А. Synergetic effect of Mo6 clusters and gold nanoparticles on photophysical properties of both components Chemistry - A European Journal, V. 27, №8, pp .2818-2825 (год публикации - 2020).

4. Позмогова Т.Н., Ситникова Н.А., Пронина Е.В., Мирошниченко С.М., Кушнаренко А.О., Соловьева А.О., Богачев С.С., Вавилов Г.Д., Ефремова О.А., Воротников Ю.А., Шестопалов М.А. Hybrid system {W6I8}-cluster/dsDNA as an agent for targeted X-ray induced photodynamic therapy of cancer stem cells Small, - (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
Полученные результаты являются основой для создания комбинированных терапевтических препаратов для адресного лечения Her2 положительного рака молочной железы. Кроме того, разработанная в последнем году выполнения проекта гибридная система на основе кластерных комплексов вольфрама и человеческой ДНК показала перспективность в адресной элиминации стволовых раковых клеток методом глубинной фотодинамической терапии (с использованием рентгеновского излучения).