Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Проведена оптимизация электроспинга нановолокон и определено, что напряжение подаваемое на электроды при электроспининге позволяет контролировать морфологию нановлокон и их толщину. Были определены оптимальные условия для получения подложек, имеющих равномерную структуру нановолокон поликапролактона с толщиной 275±50 нм. 2. Плазменная модификация в смеси СО2/С2Н4/Ar позволяет достигать графтинга СООН групп, что подтверждено Рентген-Фотоэлектронной Спектроскопии (РФЭС) и методом химической дериватизации. Правильно подобранное соотношение СО2/С2Н4 позволяет достигать достаточной концентрации СООН групп и хорошей стабильности пленок в водных растворах. Также важно отметить, что данный тип плазменной модификации может быть масштабирован до промышленных размеров и сам является экологически чистым и энергоэффективным. Полученная структура нановолокон подобна внеклеточному матриксу (ВКМ), дополнительная функционализация СООН группами повышает биодоступность нановолокон и открывает возможность дальнейшей функционализации белковыми молекулами. 3. Эффективность нановолокон для тканевой инженерии зависит от функциональной активности растущих на них клеток, которая в свою очередь зависит от начальных процессов адгезии и распластывания на матриксе. Функционализация СООН группами нановолокон улучшает бисовместимость, снижая апоптоз клеток более чем в 2 раза по сравнению с необработанными нановолокнами. Однако степень адгезии, распластывания и пролиферации клеток все еще недостаточна чтобы данный материал был перспективен для задач регенеративной медицины. Ионная или ковалентная иммобилизация белковых молекул на СООН модифицированные поликапролактоновые нановолокна улучшает показатели адгезии, пролиферации и жизнеспособности фибробластов, снижая апоптоз. Однако, только ковалентное присоединение белков поддерживает высокий пролиферативный уровень до достижения клетками монослоя, низкий уровень апоптоза, что обеспечивается пролонгированным действием белковых компонентов матрикса. 4. Отработан протокол анализа антиоксидантных и цитотоксических свойств образцов плазмы крови здоровых индивидуумов. Проанализированы 73 образца плазмы крови пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Показана статистически значимая связь цитотоксичности и отсутствие антиоксидантных свойств у плазмы крови с длительностью язвообразования. Также обнаружена связь высоких цитотоксических свойств с присутствием антиоксидантных свойств у лиц более молодого возраста (медиана 56 лет). Выявлено, что более 50% образцов характеризуются приобретением цитотоксических свойств и потерей антиоксидантной активности, что возможно является причиной низкой эффективности аутологичной PRP терапии хронических ран. Публикации 1. Miroshnichenko, S.; Timofeeva, V.; Permyakova, E.; Ershov, S.; Shtansky, D. V; Zajickova, L.; Manakhov Anton Plasma-Coated Polycaprolactone Nanofibers with Covalently Bonded Platelet-Rich Plasma Enhance Adhesion and Growth of Human Fibroblasts. Nanomaterials 2019 DOI 10.3390/nano9040637 URL: https://www.mdpi.com/2079-4991/9/4/637.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках работы по данному проекту нами были дополнительно проанализирована биоактивность СООН модифицированных матриц нановолокон поликапролактона для инженерии костных и эндотелиальных тканей, а также были проведены тесты на связывание ионов кальция с матрицей нановолокон с помощью тестов минерализации. Матрицы поликапролактона с COOH покрытием имеют большую перспективу как для инженерии мягких тканей, так и для инженерии костных тканей. Данная работа представлена в нашей публикации (Comparison of different approaches to surface functionalization of biodegradable polycaprolactone scaffolds, https://www.mdpi.com/2079-4991/9/12/1769). Также совместно с научной группой Prof. Lenka Zajickova, мы провели испытания плазменно полимерных пленок полученных с разной плотностью функциональных групп и нами было установлено, что плазменная обработка позволяет стимулировать адгезию различных типов клеток: эндотелиальных (HUVEC, HSVEC, CPAE) и кератиноцитов (HaCat), более подробно результаты описаны в нашей публикации: “Cell type specific adhesion to surfaces functionalized by amine plasma polymers”, Scientific Reports, 2020. Мы также проанализировали кинетику высвобожденият белка и сделали сследующие важные выводы: 1) Неспецифическое связывание белка с поверхностью PCL-ref приводит к быстрому выделению белка, более 90% его массы выделяется в первые 20 минут контакта с PBS 2) Ионное связывание белка с поверхностью нановолокон с различной плазменной обработкой приводит к значительно более медленному выделению белка. Подложки могут сохранять apoA-I в течение 48ч. 3) Ковалентное связывание белков позволяет еще сильнее замедлить выделение белка с поверхности, но здесь эффект менее заметный чем в сравнении с PCL-ref. Небольшие концентрации белка были найдены в пробах и после 72ч инкубации в PBS. Таким образом, связывание белков с поверхностью нановолокон можно осуществлять тремя разными способами и в каждом из способов могут быть свои преимущества: 1) Если нужен очень быстрый выход белка в окружающую среду – можно использовать неспецифическое связывание с PCL-ref 2) Для умеренно медленного выделения белка можно применить ионное связывание с PCL-COOH 3) Для самого замедленного выделения нужно применять ковалентное связывание с подложками с высоким содержанием СООН групп и тощиной не менее 100 нм. Важно отметить, что нами также была разработана новая методика оценки иммобилизации белка на поверхность нановолокон с помощью специальной аппроксимации спектров Рентген-Фотоэлектронной Спектроскопии (РФЭС) и моделирования спектра белков. Описанные результаты стали основой нашей публикации: “XPS Modeling of Immobilized Recombinant Angiogenin and Apoliprotein A1 on Biodegradable Nanofibers” (Manakhov et al, Nanomaterials 2020, 10(5), 879; https://doi.org/10.3390/nano10050879), где нами подробно описана данная методика. В результате проведенной работы над проектом было показано, что ковалентно иммобилизованные белки apoA-I и ангиогенин на поверхности PCL-COOH нановолокон сохраняют свою антиоксидантную (apoA-I) и ангиогенную (ангиогенин) активность. Оценка цитотоксичности плазм крови пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД 2) показала, что 37,5 % образцов снижают жизнеспособность мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека до 49,4 (21,3-63,3) %, за счет некротической гибели клеток. Антиоксидантная активность плазм пациентов варьировала в широком диапазоне, при этом 42,5% образцов имеют низкую антиоксидантную активность, выживаемость клеток при моделированном оксидативном стрессе составляла 8,5 (2-19,3) %, контрольные образцы сохраняли жизнеспособность клеток в пределах 53,9 (50,3-55,6) %. Отмечено, что плазмы здоровых людей имеют высокую емкость антиоксидантной защиты, при разведении до 0,5% сохраняют 24,4 (22,8-31,2) % жизнеспособных клеток. Образцы плазм больных имеют сниженную емкость, при разведении плазмы антиоксидантная активность сохраняется только у 18,4 % образцов. Добавление аполипопротеина А-I к образцам плазм крови больных СД 2 типа повышало выживаемость клеток в широком диапазоне в зависимости от их исходных показателей токсичности и антиоксидантных свойств. Не влияет на высокие антиоксиданитные свойства плазм, повышая сниженные до 26 (19,0-29,7) % живых клеток. В результате работы были изучены концентрации циркулирующих регуляторов ангиогенеза (ангиогенина и VEGF) и аполипопротеинов А-I и А-II в сыворотках крови здоровых людей и пациентов с СД 2 типа. Концентрации VEGF увеличиваются в сыворотке крове больных СД 2 типа. В группе хирургического отделения (ХО) концентрация VEGF составляла 122 (26,8-161,5) пг/мл, терапевтического отделения (ТО) 54,2 (33,4-98,6) пг/мл. Концентрация VEGF в сыворотке крови здоровых людей составляла 9,7 (5,9-10,8) пг/мл и была ниже по сравнению с ХО (р=0,0002) и ТО (р=0,004). Наблюдается обратная тенденция изменения сывороточной концентрации ангиогенина, которая была снижена в обоих группах, при этом более высокие концентрации выявлены в группе с осложнениями 234,7 (154,2-290,4) нг/мл и 189,9 (116,6-234,9) нг/мл (р=0,023). Корреляционный анализ показал отрицательную связь регулятора ангиогенеза VEGF с ангиогенином (r= -0.35, р<0,05) среди всех исследуемых групп. Исследование сывороточного уровня аполипопротеинов выявило снижение антиатерогенного, противовоспалительного, регулирующего уровень гликемии apoA-I и повышение уровня apoA-II. Уровень ароА-I пациентов ХО (1,09 (0,9-1,17) мг/мл) ниже здоровых доноров (1,28(1.21- 1.34) мг/мл) (р=0,01) и пациентов ТО (1,17 (1,05-1,25)) (р=0,023). Наше исследование показало наиболее значимые отличия (р=0,0004) по содержанию аполипопротеина А-II между пациентами терапевтического (0,07 (0,02-0,15) мг/мл) и хирургического (0,22 (0,18-0,27) мг/мл) отделений. Концентрация apoA-II у здоровых пациентов составляла 0,02 (0,02-0,04) мг/мл и статистически отличалась от ТО (р=0,02) и от ХО (р=0,0002). Соотношение же ароА-I к ароА-II значимо отличалось между всеми исследуемыми группами и было снижено в 94% случаев у пациентов хирургического отделения (4,33 (3,69-6,35). Корреляционный анализ показал положительную связь VEGF с apoA-II (r=0,43, р<0,05) среди всех исследуемых групп. Также была обнаружена положительная связь между гликированным гемоглобином и apoA-II (r=0,5, р<0,05) в группе терапевтического отделения. Таким образом за отчетный период отработали методы плазменной обработки поликапролактоновых (PCL) матриц, исследовали возможности использования функционализацированных СООН группами нановолокон не только для связывания белков для задач регенерации мягких тканей, но и для остеорегенерации, т.е. для широкого круга биомедицинского применения ФДА одобренного материала. Ранее нами была показана эффективность плазмы обогащенной тромбоцитами (PRP) здоровых людей, имобилизованной на PCL для повышения адгезии, пролиферации и жизнеспособности различных клеток. В результате прошедшего периода мы показали, что плазмы СД 2 типа имеют значительные изменения в уровнях ангиогенных факторов и аполипопротеинов. Токсичность плазм, вызывающих некротическую гибель клеток, совместно с нарушениями ангиогенных факторов, наиболее вероятно будут снижать эффективность PRP, иммобилизованной на ПКЛ матрицах. Иммобилизация apoA-I и ангиогенина совместно с PRP больных СД 2 типа на PCL нановолокнах возможно повысит эффективность PRP терапии хронических язв нижних конечностей.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект посвящен разработке и исследованию модификаций поверхности поликапролактоновых нановолокон биологически активными молекулами для терапии трудно заживающих ран при сахарном диабете 2 типа. Терапия данной патологии является очень сложной задачей в виду многофакторности патогенеза и патофизиологии процесса. Плазма обогащенная тромбоцитами – высокоактивный аутологичный коктейль естественных модуляторов регенерации, в состав ее входят цитокины, белки внеклеточного матрикса и ростовые факторы. Хотя использование ее при СД2 типа, как в виде инъекционной формы, так и в виде цельных аппликаций не всегда демонстрирует впечатляющие результаты. Скрининг, проведенный нами за время выполнения Проекта продемонстрировал, что 37,5% плазм больных СД2 типа имеют цитотоксические свойства. В результате данного этапа работы нам удалось продемонстрировать что ковалентно иммобилизованная плазма на плазменномодифицированные поликапролактоновые нановолока значимо снижает ее токсичность, при этом сохраняя стимулирующую активность на клетки, причем в некоторых случаях превышающих контрольные образцы – плазмы, выделенные у здоровых доноров. Также мы продемонстрировали, что иммобилизованные образцы плазм на нановолокнах оказывают протективное действие в разной степени на клетки при моделируемом оксидативном стрессе. Использование аполипопротеина А-I в работе обусловлено его антиоксидантной активностью. Было продемонстрировано, что добавление апоА-I к образцам, оказывающих слабую антиоксидантную активность в 18,2% случаях повышала последнюю. Был проведен анализ взаимодействия антиоксидантной защиты исследуемых образцов плазм с содержанием в них апоА-I. Мы не обнаружили прямой корреляционной связи. Так 57,5% образцов с высоким и средним уровнем концентрации апоА-I (30-197 mg/dL) имеют антиоксидантную активность, в то же время 40% с низким значениями apoА-I (7-20 mg/dL) также проявляют антиоксидантные свойства. С другой стороны, добавление аполипопротеина к образцам, не оказывающим антиоксидантную активность, но имеющих высокий уровень апоА-I повышало жизнеспособность клеток при оксидативном стрессе. И наоборот есть плазмы, с низким содержанием аполипопротеина, демонстрирующие высокую антиоксидантную защиту, добавление белка к образцам особо не влияло на и так высокую антиоксидантную защиту. Известно, что у больных СД 2 типа происходит гликирование белков, что приводит к нарушению/извращению их функциональной активности. Возможно это объясняет почему образцы с высоким содержанием аполипопротеина А-I не оказывают антиоксидантных свойств. Далее мы определили влияние образцов плазм на жизнеспособность фибробластов человека и секрецию ими коллагена 1 типа и фибронектина. Было показано, что образцы, проявляющие цитотоксические свойства по отношению жизнеспособности мезенхимальных стромальных клеток не вызывали апоптоз фибробластов, однако значимо замедляли пролиферацию и секрецию как коллагена 1 типа, так и фибронектина. Также отмечено, что токсичные образцы изменяли морфологию фибробластов. Интересные данные получены при исследовании влияния образцов плазм на секрецию оксида азота эндотелиальными клетками. Так, токсичные образцы стиммулируют выработку оксида азота, как и образцы с низким содержанием ангиогенина в составе. Допирование плазм дополнительно ангиогенином также приводило к снижению секреции оксида азота эндотелиальными клетками. Был продолжен скрининг образцов сывороток крови на содержание белков аполипопротеина А-I, A-II, ангиогенина и VEGF. При расширении групп было зарегистрирован больший разброс значений в показателях, что привело к снижению статистической разницы между группой здоровых и пациентов СД2 типа без язв. Однако сохранилась статистическая разница между группой пациентов терапевтического и хирургического отделений по таким показателям как апоА-I, апо А-II и ангиогенин. К нашему удивлению мы обнаружили высокий уровень VEGF у 20% контрольных образцов. Необходимо отметить, что в контрольную группу попали образцы здоровых доноров, перенесших коронавирусную инфекцию, что могло отразится на результатах исследования и требует более подробного дальнейшего анамнеза. Тестирование композитных наноматериалов с ковалентно иммобилизованными плазмой обогащеной тромбоцитами совместно с аполипопротеином А-I и ангиогенином на модели полнослойной кожной раны на мышах с генетической предрасположенностью к СД2 типа, с хронической гипергликимией, патологическим ожирением, задержкой заживления ран (на 39%). В результате было продемонстрировано, что покрытие раны модифицированными нановолокнами в течении 10 дней приводило к ускорению заживление ран на 32,1% по сравнению с не леченным контролем. При использование гидроколлоидной повязки в качестве контроля наблюдалось ускорение заживления в группе композиционной повязки на 13,5%. Таким образом, мы продемонстрировали эффективность разрабатываемых нами материалов, однако следует отметить, что несмотря на длительную гипергликемию, увеличение сроков заживления ран, контрольные раны, хоть и с задержкой, но заживают полноценно. Это связано с наличием в коже мышей слоя panniculus carnosus, за счет которого идет как контракция кожного дефекта, так и его реваскуляризация. На гистологических срезах видно, что в контрольной ране происходит формирование грануляционной ткани, эпителизация, ангиогенез. Для более корректной оценки эффективности разработываемых наноматериалов и приближения модели к реальным условиям, будут разработаны и использованы подходы для моделирования ран, приближенных по своей патофизиологиии к хроническим язвам, наблюдаемых у больных СД2 типа.