КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-75-00011

НазваниеИзучение функционирования и регуляции митохондриальной системы транспорта ионов Са2+ при мышечной дистрофии Дюшенна. Поиск мишеней для коррекции

РуководительДубинин Михаил Васильевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Марийский государственный университет", Республика Марий Эл

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2020 

КонкурсКонкурс 2018 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словамышечная дистрофия Дюшенна, митохондрии, Са2+ унипортер, митохондриальная пора, пермеабилизация мембран, кальций, апоптоз, ионный транспорт

Код ГРНТИ34.15.35


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на решение одной из важных проблем современной биомедицины - выяснение связанных с митохондриями механизмов развития миопатий и поиск путей коррекции таких патологий. Основной целью настоящего проекта является изучение функционирования митохондриальных систем транспорта ионов кальция, а также митохондриальной Са2+-зависимой поры в митохондриях сердца и скелетной мускулатуры мышей с индуцированной мышечной дистрофией Дюшенна. Планируется оценить скорость транспорта ионов кальция митохондриями при данном состоянии, кальциевую емкость; проанализировать уровень экспрессии генов, кодирующих белки, входящие в состав митохондриального кальциевого унипортера и Na+/Са2+-антипортера при данном состоянии, а также методом иммуноблотинга определить, как изменяется соотношение белковых субъединиц. Планируется исследовать параметры устойчивости митохондрий модельных животных к индукторам Са2+зависимой поры (mitochondrial permeability transition pore) (Са2+, фосфат, окисляющие агенты). Планируется исследовать особенности формирования поры в митохондриях модельных животных и оценить возможность выброса из органелл проапототических белков (цитохром с) при этих условиях. Также методами ОТ ПЦР в реальном времени и western-blot анализа будет проведено сравнение уровня экспрессии генов белков, основных компонентов MPT поры – циклофилина Д и аденилаттранслокатора. Планируется определить взаимосвязь между функционированием систем транспорта ионов Са2+ и параметрами дыхания и окислительного фосфорилирования. Будет проведено сравнение параметров функционирования указанных Са2+-транспортирующих систем в митохондриях мышей с индуцированной мышечной дистрофией Дюшенна и мышей «дикого типа». Предполагается изучить влияние известного фармакологического агента дефлазакорта, применяемого для коррекции этого заболевания, на параметры функционирования указанных Са2+-транспортирующих систем митохондрий. Ожидается, что полученные знания будут способствовать более глубокому пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза мышечной дистрофии Дюшенна, а также позволят выявить дополнительные мишени для коррекции миопатий.

Ожидаемые результаты
В проекте будут получены данные об особенностях транспорта ионов кальция в митохондриях сердца и скелетной мускулатуры мышей с моделью мышечной дистрофии Дюшенна. Предполагается, что митохондрии этих животных будут отличаться по показателю кальциевой емкости и скорости транспорта ионов кальция от мышей «дикого типа». Ожидается, что в основе этих изменений может лежать различное соотношение белковых субъединиц кальциевого унипортера (MCU, MCUb, MiCU1-2, EMRE) как основной системы входа Са2+ в митохондрии, а также Na+/Ca2+-антипортера как системы выхода этого иона. Соотношение этих белков и их субъединиц можно отследить как по экспрессии генов этого белка (содержанию мРНК), так и по количеству собственно белка этих субъединиц. Полученные данные позволят понять механизмы работы систем входа-выхода ионов кальция в митохондрии при развитии этой миопатии и выявить возможные мишени для их коррекции. Будет проведен сравнительный анализ действия индукторов митохондриальной Са2+-зависимой поры (Са2+, неорганический фосфат, окисляющие агенты) в митохондриях модельных мышей и мышей «дикого типа». Будет определено, происходит ли изменение уровня экспрессии генов основного регуляторного белка MPT поры – циклофилина Д, а также других возможных структурных белков MPT поры у исследуемых животных. Методом western-blot анализа будет выяснено, как изменяется соотношение этих белков. Будет изучено влияние известного фармакологического агента дефлазакорта, применяемого для коррекции этого заболевания, на параметры функционирования указанных выше кальций-транспортирующих систем митохондрий. Таким образом, полученные данные будут иметь ключевое значение для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза мышечной дистрофии Дюшенна, а также позволят выявить дополнительные мишени для коррекции этой миопатии. Поставленные в работе задачи могут быть выполнены на экспериментальной базе лаборатории и сравнимы с задачами, решаемыми в других лабораториях мира. Результаты работы будут опубликованы в виде 8 статей в высокорейтинговых зарубежных и российских журналах.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В работе показано, что митохондрии скелетных мышц дистрофин-дефицитных мышей C57BL/10ScSn-Dmdmdx (mdx мыши) характеризуются более низким, по сравнению с контрольными животными линии С57ВL/10, сопряжением дыхания и окислительного фосфорилирования. В этом случае скелетная мышечная ткань дистрофин-дефицитных мышей характеризуется также существенно более низким содержанием АТР по сравнению с мышечной тканью контрольных животных. В то же время установлено, что митохондрии сердца изучаемых групп животных не различались по параметрам дыхания и окислительного фосфорилирования. Показано, что для митохондрий скелетных мышц mdx мышей характерно существенное снижение скорости Ca2+ унипорта по сравнению с митохондриями животных «дикого типа». При этом отмечено отсутствие различий в скорости выхода ионов кальция из органелл посредством Na+/Са2+-антипорта между экспериментальными группами животных. В то же время для митохондрий сердца mdx мышей, напротив, установлено достоверное увеличение как скорости Ca2+ унипорта так и скорости выхода ионов кальция из органелл посредством Na+/Са2+-антипорта по сравнению с органеллами животных «дикого типа». Также выяснено, что для митохондрий скелетной мускулатуры mdx мышей характерно резкое уменьшение устойчивости к индукции кальций-зависимой MPT-поры, что проявляется в снижении кальциевой емкости органелл и увеличении интенсивности Са2+-индуцированного набухания по сравнению с митохондриями мышей «дикого типа». В то же время показано, что митохондрии сердца mdx мышей характеризуются увеличением кальциевой емкости по сравнению с контрольными мышами. Показано, что изменения кинетических параметров транспорта ионов кальция и устойчивости к индукции кальций зависимой поры в митохондриях скелетных мышц и сердца дистрофин-дефицитных животных могут быть обусловлены изменением количества и соотношения основных белковых субъединиц кальциевого унипортера, а также белков-предполагаемых структурных элементов митохондриальной поры. В частности, выяснено, что для митохондрий скелетных мышц дистрофин-дефицитных животных характерно увеличение количества субъединицы MCUb в составе кальциевого унипортера по сравнению с контрольными животными, что, по всей видимости, приводит к снижению скорости кальциевого унипорта. Также отмечено снижение количества регуляторной субъединицы MiCU1 в митохондриях скелетных мышц mdx мышей по сравнению с животными дикого типа, что, как предполагается, обуславливает уменьшение кальциевой емкости митохондрий дистрофин-дефицитных мышей по сравнению с органеллами контрольных животных. При этом количество других изучаемых в работе субъединиц кальциевого унипортера (MCU, MiCU2, EMRE), а также Na+/Са2+-антипортера достоверно не изменялось. В случае митохондрий сердца установлено, что для органелл дистрофин-дефицитных животных характерно увеличение количества канальной субъединицы MCU в составе кальциевого унипортера по сравнению с контрольными животными, что, по всей видимости, приводит к увеличению скорости кальциевого унипорта. Также отмечено увеличение количества регуляторных субъединиц MiCU1 и MiCU2 в митохондриях сердца mdx мышей по сравнению с животными дикого типа, что, как предполагается, обуславливает увеличение кальциевой емкости митохондрий сердца дистрофин-дефицитных мышей по сравнению с органеллами контрольных животных. Также для митохондрий сердца дистрофин-дефицитных животных характерно увеличение количества Na+/Са2+-антипортера, что, возможно, обуславливает наблюдаемое возрастание скорости выброса ионов кальция из матрикса органелл. Кроме того, для митохондрий скелетных мышц дистрофин-дефицитных животных характерно увеличение количества второй изоформы аденилаттранслокатора (ANT2, предполагаемый структурный белок MPT поры) по сравнению с животными дикого типа, что, по всей видимости, обуславливает снижение резистентности митохондрий скелетных мышц дистрофин-дефицитных животных к индукции кальций зависимой поры. В то же время для митохондрий скелетных мышц mdx мышей отмечено снижение количества регуляторного белка MPT поры циклофилина Д, что, однако, не оказывает влияния на устойчивость органелл этих животных к индукции поры.

 

Публикации

1. Белослудцев К.Н., Дубинин М.В.,Белослудцева Н.В., Миронова Г.Д. Транспорт ионов Са2+ митохондриями: механизмы, молекулярные структуры и значение для клетки Биохимия, Том 84, вып. 6, с. 759-775 (год публикации - 2019).

2. Дубинин М.В., Белослудцев К.Н. Таксономические особенности механизмов специфического транспорта Cа2+ в митохондриях Биологические мембраны, Том 36,№4,с. 1-12 (год публикации - 2019).

3. Дубинин М.В., Самарцев В.Н., Степанова А.Е., Хорошавина Е.И., Пеньков Н.В., Яшин В.А., Старинец В.С., Михеева И.Б., Гудков С.В., Белослудцев К.Н. Membranotropic effects of ω-hydroxypalmitic acid and Ca2+ on rat liver mitochondria and lecithin liposomes. Aggregation and membrane permeabilization Journal of Bioenergetics and Biomembranes, V. 50, №5, P. 391–401 (год публикации - 2018).

4. Дубинин М.В., Старинец В.С., Теньков К.С., Белослудцев К.Н. Влияние мышечной дистрофии Дюшенна на транспорт ионов кальция в митохондриях скелетной мускулатуры Международная конференция «Современные проблемы медицины и естественных наук». Сборник статей, С. 168-169. (год публикации - 2019).

5. Дубинин М.В., Теньков К.С., Старинец В.С., Таланов Е.Ю., Белослудцев К.Н. Особенности функционирования митохондрий при мышечной дистрофии Дюшенна Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 72-й Всероссийской с международным участием школы- конференции молодых ученых, С. 78 (год публикации - 2019).

6. Дубинин М.В., Теньков К.С., Старинец В.С., Хорошавина Е.И., Белослудцев К.Н. Ca2+ uptake and permeability transition in heart and skeletal muscle mitochondria: a comparative study Journal of Bioenergetics and Biomembranes, Vol. 50. №6. P. 70-71. (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) – наследственное прогрессирующее заболевание мышечной системы, в основе развития которой лежат мутации гена дистрофина, расположенного в локусе Xp21.2. Это приводит к тяжелому отсутствию (<5%) дистрофина, белка мембраны мышечных клеток, необходимого для поддержания структуры и функции мышц. В свою очередь, это вызывает патологические изменения в структуре и функциях как скелетной, так и сердечной мышечной ткани, сопровождающиеся снижением мышечной силы и выносливости организма, а также развитием кардиомиопатии, аритмии и умственной отсталости. Известно, что развитие внутриклеточных патологических процессов, сопровождающих дистрофию Дюшенна, ассоциировано с дисфункцией митохондрий, что приводит к снижению содержания АТР в скелетных мышцах, а также дисрегуляции внутриклеточного гомеостаза ионов кальция. Все это, в свою очередь, способствует быстрому прогрессированию патологии. Одним из путей коррекции этого заболевания является применение глюкокортикоидов, в частности дефлазакорта, официально одобренного управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (англ. Food and Drug Administration, FDA, USFDA) для коррекции МДД в 2017 году. В настоящей работе изучено влияние дефлазакорта на функциональную активность митохондрий скелетных мышц дистрофин-дефицитных мышей C57BL/10ScSn-Dmdmdx (mdx мыши), а также мышей С57ВL/10 «дикого типа», использованных в качестве контрольных животных. Установлено, что введение дефлазакорта улучшает показатели дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий mdx мышей, не влияя на параметры мышей «дикого типа». Показано, что это может быть обусловлено увеличением уровня комплексов III и IV дыхательной цепи митохондрий скелетных мышц, а также АТР-синтазы. Терапия с применением дефлазакорта сопровождается увеличением уровня АТР в скелетной мускулатуре mdx мышей, по сравнению с контрольными дистрофин-дефицитными животными, а также достоверным увеличением мышечной силы животных. Предположено, что это может быть обусловлено, в том числе, и улучшением функциональной активности митохондрий скелетных мышц mdx мышей, вызванным применением дефлазакорта. Показано, что терапия с применением дефлазакорта приводит к восстановлению скорости поглощения ионов кальция митохондриями скелетных мышц дистрофин-дефицитных животных до уровня животных «дикого типа». При этом дефлазакорт не влияет на скорость транспорта кальция в митохондриях мышей «дикого типа». Предположено, что снижение скорости Са2+ унипорта в митохондриях скелетных мышц mdx мышей может быть обусловлено молекулярными перестройками в комплексе кальциевого унипортера, а именно снижением соотношения канальной субъединицы MCU и ее неактивного паралога MCUb. В этом случае терапия с применением дефлазакорта не оказывает влияния на уровень канальной субъединицы MCU в митохондриях экспериментальных групп животных, однако снижает уровень субъединицы MCUb в митохондриях скелетных мышц mdx мышей. Это приводит к достоверному увеличению соотношения субъединиц MCU и MCUb в митохондриях mdx мышей, подвергнутых действию дефлазакорта, по сравнению с контрольными дистрофин-дефицитными мышами, что может оказывать влияние на изменение скорости поглощения ионов кальция митохондриями скелетных мышц mdx мышей. При этом отмечается, что дефлазакорт не оказывает существенного влияния на уровень регуляторной субъединицы MICU1 в митохондриях скелетных мышц исследуемых групп животных. Наряду с этим установлено, что митохондрии mdx мышей, подвергнутые действию дефлазакорта, характеризуются снижением кальциевой емкости по сравнению с контрольными дистрофин-дефицитными животными. Показано, что этот глюкокортикоид оказывает подобное влияние и на митохондрии мышей «дикого типа». Сделан вывод, что дефалазакорт снижает устойчивость митохондрий к индукции MPT поры. Предположено, что снижение устойчивости митохондрий скелетных мышц дистрофин-дефицитных животных может быть обусловлено существенным увеличением уровня 2 изоформы аденилаттрансплокатора (ANT2), который способен формировать канал поры во внутренней мембране митохондрий скелетных мышц при этой патологии. При этом лечение дефлазакортом приводит к увеличению уровня ANT2 как в митохондриях mdx мышей, так и животных «дикого типа». В этом случае уровень 1 изоформы аденилаттрансплокатора (ANT1) не изменяется. Наряду с этим отмечено увеличение уровня ATP синтазы в митохондриях mdx мышей, которая также способна формировать канал MPT поры, а также тенденция к восстановлению уровня регуляторного белка циклофилина D до уровня мышей «дикого типа». Кроме того, митохондрии скелетных мышц mdx мышей характеризуются снижением уровня VDAC1, который, как предполагается, формирует канал MPT поры во внешней мембране митохондрий. При этом дефлазакорт обнаруживает тенденцию к снижению уровня этого белка в митохондриях обеих исследуемых групп животных. Предположено, что все это может способствовать снижению резистентности митохондрий к индукции MPT поры и клеточной гибели. Сделан вывод, что такое действие дефлазакорта может лежать в основе его многочисленных побочных эффектов.

 

Публикации

1. - Ученые нашли изменения в структуре митохондрий при болезни Дюшенна Пресс-служба РНФ, - (год публикации - ).

2. - Биологи уточнили механизм развития болезни Дюшенна Indicator.Ru, - (год публикации - ).

3. - Российские учёные описали особенности развития дистрофии Дюшена Канал "Наука", - (год публикации - ).

4. - При миопатии Дюшенна нарушается поглощение митоходриями ионов кальция «Полит.ру», - (год публикации - ).

5. - Ученые нашли изменения в структуре митохондрий при болезни Дюшенна МИОПАТИЯ.BY, - (год публикации - ).

6. Дубинин М.В., Старинец В.С., Теньков К.С., Белослудцева Н.В., Белослудцев К.Н. Влияние глюкокортикоида дефлазакорта на функционирование митохондрий скелетных мышц при мышечной дистрофии Дюшенна Биология – наука XXI века: 24-я международная Пущинская школа конференция молодых ученых, - (год публикации - 2020).

7. Дубинин М.В., Таланов Е.Ю., Старинец В.С., Теньков К.С., Белослудцев К.Н. Транспорт Са2+ в митохондриях сердца в условиях мышечной дистрофии Дюшенна Биохимия – основа наук о жизни: материалы 2-ой Всероссийской школы-конференции молодых ученых., С. 42-45 (год публикации - 2019).

8. Дубинин М.В., Таланов Е.Ю., Теньков К.С., Старинец В.С., Белослудцева Н.В., Белослудцев К.Н. The Effect of Deflazacort Treatment on the Functioning of Skeletal Muscle Mitochondria in Duchenne Muscular Dystrophy International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 8763. (год публикации - 2020).

9. Дубинин М.В., Таланов Е.Ю., Теньков К.С., Старинец В.С., Михеева И.Б., Шарапов М.Г., Белослудцев К.Н. Duchenne muscular dystrophy is associated with the inhibition of calcium uniport in mitochondria and an increased sensitivity of the organelles to the calcium-induced permeability transition Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease, 1866(5):165674. (год публикации - 2020).

10. Дубинин М.В.,Старинец В.С.,Теньков К.С.,Белослудцев К.Н. Транспорт ионов кальция в митохондриях скелетных мышц и сердца при мышечной дистрофии Дюшенна Сборник научных трудов VI съезда биофизиков России, Том 1. Стр. 219-220 (год публикации - 2019).

11. Дубинин М.В.,Таланов Е.Ю.,Теньков К.С.,Старинец В.С., Михеева И.Б.,Белослудцев К.Н. Transport of Ca 2+ and Ca 2+-dependent permeability transition in heart mitochondria in the early stages of Duchenne muscular dystrophy Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 1861(10):148250. doi: 10.1016/j.bbabio.2020.148250 (год публикации - 2020).


Возможность практического использования результатов
Результаты проекта позволяют полагать, что митохондрии и митохондриальные транспортные системы скелетных мышц и сердца могут рассматриваться в качестве перспективных мишеней для коррекции мышечной дистрофии Дюшенна. В этом случае представляется перспективным более детально исследовать влияние митохондриально-направленных соединений (модуляторов кальциевых каналов и MPT поры) на функционирование скелетной и сердечной мускулатуры при этой патологии. Это, в перспективе, позволит разработать дополнительные подходы для поддержки пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна.