Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Многощетинковый червь Chaetopterus variopedatus – космополит, встречающийся во многих уголках мира. На взрослой стадии развития черви ведут малоподвижный образ жизни в крупных, погружённых в донный грунт, прочных пергаментных U-образных трубках, постоянно фильтруя воду и получая из неё питательные вещества. В ответ на прямое физическое воздействие или раздражение трубки C. variopedatus выпускает облако светящейся голубым светом слизи. При этом ярко светятся и все сегменты тела червя, секретирующие слизь. Осаму Шимомура предполагал, что биолюминесцентная система C. variopedatus включает фотопротеин и пять дополнительных компонентов: O2, Fe2+, H2O2 и два кофактора неизвестной природы. Белок с молекулярной массой 130 кДа и спектром флуоресценции, аналогичным биолюминесцентному, был выделен из тканей червя, но его структура не была определена. Одни исследователи сообщали, что люминесценция C. variopedatus усиливается в присутствии ионов двухвалентного железа и перекиси водорода. Другие авторы, наоборот, отмечали, что ионы железа(II) не стимулируют свечение, а перекись даже ингибирует его, способствуя увеличению вязкости слизи. Также, согласно литературным источникам, в выделяемой слизи были обнаружены предполагаемые кофакторы биолюминесцентной реакции Chaetopterus variopedatus - флуоресцентные вещества рибофлавин и FMN, однако их связь с механизмами генерации света не была доказана. Изучение новой биолюминесцентной системы начинается с поиска, выделения и определения структур субстрата – люциферина и фермента – люциферазы. В рамках проекта по исследованию механизма испускания света Chaetopterus variopedatus данная стадия была затруднена из-за наличия в литературных источниках противоречивой информации о природе данной биолюминесцентной системы. В настоящем исследовании мы разработали новый метод разделения и частичной очистки белка (30 кДа) и низкомолекулярных компонентов (менее 5 кДа) биолюминесцентной системы Chaetopterus variopedatus. Ни одно из выделенных соединений не обладало независимой люминесцентной активностью, но интенсивное свечение in vitro было вызвано добавлением сульфата железа(II) к реакционной смеси, содержащей очищенный белок и низкомолекулярный компонент - люциферин. Кроме того, интенсивность свечения проявила линейную зависимость от количества люциферина. Этот факт приводит к важному пониманию биолюминесцентной системы Chaetopterus, позволяя предположить, что она относится к люциферин-люциферазному типу, а не к фотопротеину, как ранее считалось. Интересным также является тот факт, что низкомолекулярный люциферин и ионы Fe2+ являются ко-субстратами люциферазы исследуемой биолюминесцентная системы. Дальнейшие очистка и установление структурных характеристик компонентов биолюминесцентной системы Chaetopterus позволят пролить свет на истинную природу этой реакции.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Эксперименты, проведенные нами на первом году исследования биолюминесценции многощетинковых червей Chaetopterus variopedatus, позволили установить, что получение высокоочищенного препарата люциферина из исследуемого червя не представляется возможным в связи с его нестабильностью и низким содержанием в биомассе. Однако, нами был установлен факт наличия искомого люциферина и его аналогов в больших количествах в морских водорослях. В связи с этим наша дальнейшая работа была сосредоточена на разработке метода выделения, очистке и установлении химической структуры люциферина и его аналогов из биомассы водоросли. Представленная в настоящем отчете методика очистки и обогащения субстрата биолюминесцентной реакции Chaetopterus variopedatus из водоросли позволили получить достаточные количества гомогенных исследуемых веществ для анализа методами масс-спектрометрии высокого разрешения и ЯМР. Высокое качество спектров ЯМР позволило провести прямой анализ полученных соединений, поскольку все четвертичные атомы углерода наблюдались в спектрах HMBC и 1D 13C, и все лабильные протоны ОН-групп были четко видны в растворе ДМСО. Для однозначного установления структуры люциферина и его роли в биолюминесцентной системе C. variopedatus необходимо было провести встречный синтез всех люминесцентно-активных соединений, что и было сделано для наиболее простого люциферина. Спектральные и хроматографические свойства синтетического люциферина были полностью идентичны природному соединению. Для дальнейшего исследования механизма биолюминесценции C. variopedatus, нами были синтезированы аналоги люциферина, содержащие флуоресцентные красители флуоресцеин и эозин. В результате проведенной работы на втором году был разработан метод очистки и обогащения субстрата биолюминесцентной реакции C. variopedatus из водорослей в количествах достаточных для анализа физико-химическими методами. Структуры всех субстратов были однозначно установлены с использованием методов масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии. Методом встречного синтеза была подтверждена структура люциферина, а также был получен ряд синтетических аналогов природных субстратов, физико- химические параметры которых были изучены в реакции биолюминесценции Chaetopterus variopedatus in vitro. Полученные на данном этапе результаты позволят в дальнейшем установить механизм биолюминесценции морских полихет C. variopedatus.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На предыдущих этапах выполнения проекта была использована биомасса полихеты Chaetopterus variopedatus выловленного в Бразилии в заливе Сан-Себастьян рядом с биостанцией университета Сан-Пауло (Centro de Biologia Marinha, Universidade de Sao Paulo, Sao Sebastiao, Brazil). В связи с пандемией Ковид-2019 возникли сложности с коллекционированием и транспортировкой биомассы из Бразилии, поэтому был налажен вылов Chaetopterus variopedatus на морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН в бухте Троицы, залив Посьета, Японское море (Рисовая падь, Хасанский район, Приморский край, Россия). Разработанная на предыдущих этапах методика очистки и обогащения фермента катализирующего биолюминесцентную реакцию Chaetopterus variopedatus позволила получить очищенные гомогенные препараты кандидатов люцифераз “дальневосточной” и “бразильской” популяций полихет – в количестве 30 мг и 15 мг соответственно, достаточном для проведения структурных исследований спектральными и физико-химическими методами анализа. Также были секвенированы транскриптомы Chaetopterus из “дальневосточной” и “бразильской” популяций. Трипсинолиз препаратов люцифераз с последующим масс-спектрометрическим анализом полученных пептидов и поиск в транскриптомах Chaetopterus variopedatus транскриптов, содержащих расшифрованные пептиды позволил установить аминокислотную и нуклеотидную последовательности люцифераз. Поиск в транскриптоме “бразильской” популяции выявил два транскрипта, кодирующих белки массой около 20 кДа. Оба транскрипта не показали значимой гомологии с какой-либо известной на данный момент группой белков, однако показали высокую степень идентичность между собой: 57% идентичных аминокислот и 76% идентичных/гомологичных аминокислот. Для “дальневосточной” популяции также были установлены два гена-кандидата, кодирующие белки массой около 20,2 кДа. Аминокислотные последовательности люцифераз “бразильского” и “дальневосточного” подвидов Chaetopterus также оказались попарно идентичны со степенью гомологии превышающей 85%. Все найденные транскрипты были заклонированы в вектора для экспрессии в гетерологических системах: E. coli, Pichia pastoris и в клетках млекопитающих HEK293T. Полученными конструкциями были трансформированы соответствующие клетки. Однако при добавлении синтетического люциферина биолюминесцентная активность лизатов трансформированных соответствующими конструкциями клеток E. coli, Pichia pastoris и млекопитающих HEK293T отсутствовала для всех полученных вариантов конструкций. Отсутствие активности рекомбинантных люцифераз по-видимому обусловлено необходимостью либо ковалентного связывания неизвестного кофактора, либо необходимостью посттрансляционных модификаций, например специфичного гликозилирования. В рамках продолжения исследований мы планируем выявить необходимые для активности люциферазы Chaetopterus кофактор и/или посттрансляционные модификации и получить активную рекомбинантную люциферазу. В ходе работы по установлению механизма биолюминесцентной реакции исследуемых полихет был проведен ряд модельных ферментативных и неферментативных реакций природного и синтетического люциферинов C. variopedatus с железом (II). Анализ масс-спектров полученных образцов выявил лишь незначительную разницу в продуктах реакции с Fe2+ и биолюминесцентной реакции. По его результатам была определена группа пиков, обнаруживающихся только в образцах с люциферазой, однако из-за низкой концентрации и из-за малого содержания их в смеси относительно остальных продуктов, мы не смогли сделать предположений об их структуре. Мы планируем синтезировать хорошо детектируемые и высокоэффективные аналоги люциферина Chaetopterus, и проанализировать продукты биолюминесцентной реакции с использованием этих субстратов. В результате проведенной работы на третьем году были получены очищенные гомогенные препараты кандидатов люцифераз C. variopedatus “дальневосточной” и “бразильской” популяций. Были определены аминокислотные и нуклеотидные последовательности люцифераз С. variopedatus двух популяций, выявлена гомология последовательностей “дальневосточного” варианта люциферазы с последовательностями люциферазы “бразильского” Chaetopterus. Найденные транскрипты были заклонированы в вектора для экспрессии в гетерологических системах: E. coli, Pichia pastoris и в клетках млекопитающих HEK293T. Проведены модельные ферментативные реакции in vitro с природным субстратом люциферазы C. variopedatus и его аналогами. Для улучшения гидрофильности и ионизации субстрата биолюминесцентной реакции C. variopedatus синтезирован аналог субстрата сопряженный с флуоресцентным красителем - феноловым красным. Исследована биолюминесцентная активность полученного аналога люциферина.