КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-74-10098

НазваниеРазработка высокочувствительных биосенсорных платформ для исследования биомолекулярных взаимодействий и быстрого количественного детектирования биологически активных соединений в сложных средах

РуководительБрагина Вера Александровна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2018 - 06.2021

, продлен на 07.2021 - 06.2023. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словаБиосенсорные платформы, биомолекулярные взаимодействия, быстрый иммунохимический анализ, магнитные наночастицы, иммуномагнитная сепарация, микропористые иммунохроматографические структуры, нелинейное намагничивание, медицинская диагностика

Код ГРНТИ34.17.00

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы разработки новых подходов к созданию высокочувствительных биосенсорных платформ для проведения фундаментальных исследований биомолекулярных взаимодействий, а также для быстрого и количественного определения концентрации биологически активных соединений в пробах сложного состава. Уникальность предлагаемого в проекте подхода заключается в том, что магнитные наночастицы (МЧ) будут впервые использоваться одновременно в качестве иммуномагнитного сорбента для выделения и концентрирования исследуемых биообъектов с помощью манипуляций внешним магнитным полем, а также в качестве нанометок, детектируемых электронными методами со всего объема трехмерных микропористых иммунохроматографических структур. По оценкам и по результатам предварительных экспериментов авторов проекта данный новый подход приведет к синергическому эффекту и позволит регистрировать биомолекулярные взаимодействия с высокой чувствительностью (в фемто- и пикомолярном диапазонах концентраций) при малом времени (< 15 мин) анализа. Подход даст возможность снять целый ряд ограничений, присущих традиционным для иммунохимического анализа оптическим меткам, и ликвидировать необходимость предварительной пробоподготовки сложных биологических образцов, таких как цельная кровь, сыворотка, слюна и т. д. В результате будут достигнуты уникальные параметры по совокупности таких важных характеристик аналитических методов, как предел детекции (ПД) определяемых соединений, линейный динамический диапазон количественного определения концентраций, чувствительность, специфичность, скорость анализа, а также будет реализована возможность производить одновременную регистрацию нескольких высокоспецифичных иммунохимических реакций и определять множество аналитов в одной пробе. В качестве модельных объектов и примеров специфических антигенов на первом этапе работы будут использованы биологически активные вещества, обладающие высокой социальной значимостью - гормоны, свидетельствующие об эндокринных заболеваниях организма: тиреотропный гормон - ТТГ, трийодтиронин - Т3, тироксин - Т4. Будут получены конъюгаты МЧ, функционализированные антителами против исследуемых агентов и развиты новые высокочувствительные методы количественного детектирования маркеров эндокринных заболеваний (ТТГ, Т3, Т4) в пробах сложного состава в широком диапазоне концентраций. Ожидаемые ПД белкового маркера ТТГ будут лучше 20 мкМЕ/мл, а для гаптена Т4 составят менее 20-30 фМ в сыворотке крови человека с сокращением времени анализа до 15 мин. Наряду с необходимыми для медицинской диагностики ПД, будут достигнуты широкие динамические диапазоны (на уровне 3-4 порядков) измерения концентрации разнообразных маркеров заболеваний. Это позволит с помощью разработанных биосенсорных систем обеспечить возможность исследования динамики заболеваний пациентов и оценку эффективности выбранного курса терапии или хирургии (например, в случае удаления раковых опухолей). Кроме того, будут разработаны методы регистрации нескольких высокоспецифичных взаимодействий антиген-антитело (АГ-АТ) для одновременного выявления и детекции большого количества биообъектов в одной пробе. С помощью таких методов можно будет осуществлять мониторинг динамики изменения соотношения концентраций биомаркеров в зависимости от прогрессирования заболеваний или их подавления (лечения) различными методами. Таким образом, в результате выполнения проекта будут разработаны научные основы для создания нового поколения аналитических методов как для анализа биомолекулярных взаимодействий (в частности, белков с другими белками и малыми молекулами), так и для решения актуальных задач здравоохранения, персонализированной медицины и экспрессной in vitro диагностики.

Ожидаемые результаты
В рамках Проекта будут получены следующие конкретные результаты: 1. На основе применения МЧ одновременно в качестве управляемых внешним магнитным полем агентов для выделения и концентрирования исследуемых аналитов, а также нанометок, детектируемых с рекордно высокой чувствительностью оригинальными электронными методами по нелинейному перемагничиванию, будут разработаны принципиально новые аналитические платформы для количественного исследования белок-белковых взаимодействий и взаимодействий белков с малыми молекулами (гаптенами) в пробах сложного состава. 2. Будут разработаны новые иммуносенсорные аналитические методы с уникальными характеристиками такими как быстрота анализа (менее 15 минут), ПД определяемых соединений (в фемто- и пикомолярном диапазонах концентраций), широта динамического диапазона количественного определения концентраций (3-4 порядка), чувствительность, специфичность и простота проведения анализа, которые по совокупности параметров не имеют в настоящее время мировых аналогов. 3. На примере модельных объектов в экспериментах будут разработаны новые высокочувствительные количественные методы детекции маркеров эндокринных заболеваний (ТТГ, Т3, Т4) в пробах сложного состава в широком диапазоне концентраций с ожидаемыми ПД для белковых молекул ТТГ менее 20 мкМЕ/мл, для гаптенов Т4 – на уровне 20-30 фМ. Разработанные методы смогут применяться как безопасная альтернатива радиоиммунному анализу (РИА), который все еще достаточно часто используется в клинической диагностики (в том числе и в г. Москве) именно из-за необходимости измерения концентации гормонов щитовидной железы с высокой чувствительностью, не всегда обеспечиваемой традиционными методами на основе оптических меток. Кроме того, предлагаемые биосенсорные методы детекции гаптенов будут использованы для создания универсальной платформы для ультрачувствительной детекции самых разнообразных малых молекул (лекарственных препаратов, антибиотиков и т.д.) для задач персонифицированной медицины. 4. Будут развиты новые мультиплексные методы быстрой регистрации нескольких высокоспецифичных взаимодействий (АГ-АТ) для обеспечения возможности одновременного выявления и детекции большого количества биомолекул в одной пробе, а также мониторинга динамики изменения соотношения концентраций маркеров в зависимости от прогрессирования заболеваний или их подавления (лечения) различными методами. 5. Будут установлены наиболее оптимальные режимы иммуномагнитной сепарации аналитов и развиты методы, способствующие минимизации времени связывания специфических иммунокомплексов (АГ-АТ), увеличению миграции их вдоль нитроцеллюлозных мембран и сокращению времени анализа. Будут выявлены режимы проведения иммуномагнитной сепарации для обеспечения максимальной чувствительности, специфичности разрабатываемых биосенсорных платформ для детекции биомаркеров заболеваний. 6. Будут разработаны теоретические и экспериментальные подходы, позволяющие подобрать оптимальные условия для синтеза, стабилизации и модификации МЧ. В результате будут синтезированы МЧ, обладающие оптимальным сочетанием стабильности в физиологических условиях, высокой магнитной восприимчивостью, малой степенью агрегированности и высокой степенью монодисперсности. Физико-химические и коллоидные свойства наночастиц будут изучены и охарактеризованы с помощью современных инструментальных методов и будут даны общие рекомендации по принципам конструирования коллоидных систем для биосенсорных платформ. 7. Будут исследованы и выбраны различные методы иммобилизации функционализированных биомолекул и лигандов на поверхность магнитных наночастиц с сохранением реакционной способности и коллоидно-химических свойств исходных компонентов. Будет проведен теоретический анализ полученных данных для иммуноаналитических применений изученных процессов. В результате проведенных исследований будут разработаны научные основы для создания новых высокочувствительных аналитических методов с использования МЧ одновременно в качестве управляемых внешним магнитным полем твердофазных платформ и нанометок в сочетании с регистрацией их вдоль всего объема детектируемых трехмерных пористых микроструктур. Разработанные методы будут протестированы для детекции высокоспецифичных иммунохимических реакций в сложных биологических жидкостях и установлены их аналитические характеристики. Отметим, что разработка высокочувствительных аналитических методов на основе экологически чистых МЧ для замены РИА представляется социально значимой и важной задачей. Другой общественно значимый аспект указанной замены связан с тем обстоятельством, что для уменьшения техногенных рисков РИА использует только короткоживущие изотопы (как правило, 125-I с периодом полураспада 60 суток). Это приводит к весьма ограниченному сроку хранения диагностических наборов РИА. Поэтому даже не использованные наборы подлежат частой и дорогостоящей утилизации, что приводит к значительным финансовым и ресурсным затратам соответствующих государственных организаций. За счет реализации предлагаемого проекта планируется эффективное решение указанных социально значимых и экологических проблем. Подчеркнем, что многие составы МЧ на основе оксидов железа являются экологически безопасными (на уровне ничтожных концентраций ржавчины водопроводных труб), хорошо биодеградируют даже в живом организме и допущены в целом ряде высокоразвитых стран для внутривенных инъекций человеку для контрастирования МРТ, восполнения недостатка железа в организме при анемии и т.д. Предлагаемые к разработке методы будут конкурентоспособными на мировом уровне, значительно расширят возможности использования биосенсорных платформ в протеомике для анализа биомолекулярных взаимодействий, изучения взаимодействий белков с другими белками и малыми молекулами, а также будут применимы для экспресс диагностики и мониторинга социально-значимых заболеваний, контроля качества продуктов питания, экологического мониторинга и др.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках работы в течение первого года выполнения Проекта были разработаны новые биосенсорные подходы для количественного детектирования белок-белковых взаимодействий на нитроцеллюлозных мембранах в сэндвич-формате с использованием конъюгатов магнитных наночастиц (МЧ) в сложных биологических средах. Разработаны экспериментальные подходы, позволяющие подобрать оптимальные условия для синтеза, стабилизации и модификации МЧ. В результате были синтезированы магнитные наночастицы, обладающие оптимальным сочетанием стабильности в физиологических условиях, высокой магнитной восприимчивостью, малой степенью агрегированности и высокой степенью монодисперсности. Физико-химические и коллоидные свойства наночастиц изучены и охарактеризованы с помощью современных инструментальных методов. Были исследованы и выбраны различные методы иммобилизации функционализированных биомолекул и лигандов на поверхность магнитных наночастиц с сохранением реакционной способности, физиологических и коллоидно-химических свойств исходных компонентов. Были разработаны иммуномагнитные методы для выделения и концентрирования исследуемых аналитов, предназначенные для обогащения пробы, быстрой очистки исследуемого антигена в образцах сложного состава и увеличения чувствительности комбинированного иммуноанализа. Были установлены оптимальные режимы иммуномагнитной сепарации аналитов и развиты методы, способствующие минимизации времени связывания специфических иммунокомплексов (АГ-АТ), увеличению эффективности их миграции вдоль нитроцеллюлозных мембран и сокращению времени анализа. Были выявлены режимы проведения иммуномагнитной сепарации для увеличения чувствительности и специфичности разрабатываемых биосенсорных платформ для детекции белковых биомаркеров заболеваний. Продемонстрирована применимость разработанных биосенсорных подходов для регистрации биомолекул в сложных средах, в частности, в сыворотке крови человека. В качестве модельного объекта в экспериментах был использован белковый маркер, обладающий высокой социальной значимостью - тиреотропный гормон (ТТГ). Достигнутый предел детекции ТТГ в сыворотке составил 0,017 мкМЕ/мл в широком динамическом диапазоне более 3 порядков при времени анализа менее 30 мин, что обеспечивает весь возможный диапазон колебаний концентраций гормона в сыворотке крови человека. Это позволяет проводить достаточно простую экспресс диагностику состояний пациентов, как с малым, так и повышенным содержанием тиреотропного гормона в крови. По результатам, полученным в ходе проекта, подана одна печатная работа в высокорейтинговый журнал первого квартиля (Q1) по базам Web of Science и Scopus (https://www.scimagojr.com). Полученные результаты были доложены участниками проекта в качестве 3 устных докладов на ведущих международных и российских конференциях. Доклад по результатам работы получил премию на школе-конференция молодых ученых ИОФ РАН "Прохоровские недели", 11 - 23 октября 2018 г. Москва.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках работы в течение второго года выполнения Проекта были разработаны новые высокочувствительные биосенсорные подходы с использованием конъюгатов магнитных наночастиц для количественного детектирования взаимодействий белков с другими белками и малыми молекулами (гаптенами) на различных микропористых структурах в сэндвич- и конкурентном форматах иммуноанализа в сложных биологических средах. С помощью оптических безмаркерных биосенсорных систем проведен скрининг широкого набора коммерчески доступных антител на наиболее социально-значимые высокомолекулярные соединения (белковые маркеры) и низкомолекулярные вещества (гаптены), исследованы кинетические параметры взаимодействия таких антител с антигенами и осуществлен выбор оптимальных иммунореагентов. Были исследованы трехмерные капиллярно-пористые структуры (нитроцеллюлозные мембраны и волоконные 3D фильтры) и выбраны наиболее оптимальные структуры в качестве твердых фаз для разработки новых форматов иммуноанализа. Были получены конъюгаты на основе магнитных наночастиц меченные антителами к целому ряду анализируемых аналитов и конъюгаты низкомолекулярных веществ с различными высокомолекулярными белками-носителями (БСА, казеин и желатин). Были исследованы взаимодействия низкомолекулярных веществ (гаптенов) с антителами в двухфазной системе при наличии конкурентных соединений и установлены наиболее оптимальные форматы регистрации гаптенов в биологических жидкостях. Продемонстрирована эффективность разработанных биосенсорных подходов с использованием конъюгатов магнитных наночастиц для высокочувствительной количественной детекции высоко – и низкомолекулярных соединений в биологических средах (на примере сыворотки крови человека). В качестве модельных объектов в экспериментах были использованы белковый маркер инфекционных заболеваний – поверхностный антиген вируса гепатита В и биологически-значимый гаптен - фолиевая кислота. Разработанные иммуномагнитные биосенсорные платформы продемонстрировали широкий динамический диапазон измерения концентраций (2,5-5 порядков) анализируемых соединений с пределами детекций (в пикомолярном диапазоне) на уровне современных иммуноаналитических методов, требующих лабораторных условий с продолжительность анализа более 2-12 часов. В тоже время разработанные биосенсорные методы позволяют проводить анализ значительно проще и быстрее – менее 30 мин и перспективны для проведения исследований непосредственно на месте забора пробы (вне специализированных лабораторий). В результате проведенных исследований разработаны научные основы для создания нового поколения аналитических методов как для анализа взаимодействий белков с другими белками и малыми молекулами, так и для решения актуальных задач здравоохранения, персонализированной медицины и экспрессной in vitro диагностики. Полученные в рамках проекта результаты опубликованы в 2 публикациях в высокорейтинговых журналах первого квартиля (Q1) по базам Web of Science (Core Collection) и Scopus с импакт-факторами 6,35 и 4,916 и представлены участниками проекта в качестве 3 устных и 1 постерного докладов на ведущих международных и российских конференциях.

Публикации

1. Брагина В.А, Знойко С.Л., Орлов А.В., Пушкарев А.В., Никитин М.П., Никитин П.И. Analytical platform with selectable assay parameters based on three functions of magnetic nanoparticles: demonstration of highly sensitive rapid quantitation of staphylococcal enterotoxin B in food Analytical Chemistry, vol. 91, № 15, p. 9852-9857 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b01519

2. Знойко С.Л., Орлов А.В., Брагина В.А., Никитин М.П., Никитин П.И. Nanomagnetic lateral flow assay for high-precision quantification of diagnostically relevant concentrations of serum TSH Talanta, Vol. 216,120961 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.talanta.2020.120961

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках работы в течение третьего года выполнения Проекта были разработаны новые быстрые и высокочувствительные биосенсорные подходы с использованием конъюгатов магнитных наночастиц и оптимальных по кинетическим характеристикам антител для изучения белок-белковых взаимодействий на иммунохроматографических микропористых структурах в сэндвич-формате иммуноанализа в сложных средах. Были разработаны способы дальнейшего повышение чувствительности и сокращения продолжительности иммунохроматографических сэндвич-форматов магнитного иммуноанализа за счет объединения с методами иммуномагнитного обогащения исследуемых проб. Был разработан новый метод измерения кинетики взаимодействия антител и антигенов в иммунохроматографических тест-системах, объединённых с иммуномагнитной сепарацией антигенов. С помощью оптических безметочных интерферометрических систем был осуществлен скрининг широкого спектра коммерчески доступных антител против белковых онкомаркеров и исследована кинетика взаимодействия иммунокомплексов антиген-антитело и выбраны оптимальные по кинетическим параметрам антитела. Были исследованы различные типы коммерческих иммунохроматографических структур - нитроцеллюлозных мембран, имеющих разный размер пор и выбраны наиболее оптимальные структуры в качестве твердой фазы для количественного детектирования взаимодействий антитело - белковый маркер заболеваний. Были разработаны экспериментальные подходы, позволяющие подобрать оптимальные условия для иммобилизации высокоаффинных распознающих биомолекул на выбранных микропористых иммунохроматографических структурах. Были получены конъюгаты магнитных наночастиц, функционализированных антителами против исследуемых белковых онкомаркеров и оптимизировано количества антител для конъюгации с сохранением их высокой связывающей активности. Продемонстрирована эффективность разработанных биосенсорных подходов с использованием конъюгатов магнитных наночастиц для высокочувствительной количественной детекции высоко –молекулярных соединений - белковых онкомаркеров. Разработанные иммуномагнитные биосенсорные платформы продемонстрировали широкий динамический диапазон измерения концентраций (более 2,5 порядков) анализируемых соединений с пределами детекций на уровне современных лабораторных иммуноаналитических методов, в частности, иммуноферментных анализов, требующих длительное время инкубации (2-4 ч), лабораторных условий и дорогостоящего оборудования. Разработанные в рамках проекта методы и подходы позволят вывести на новый уровень фундаментальные исследования по созданию новых высокочувствительных биосенсорных методов анализа биомолекулярных взаимодействий в пробах сложного состава, а также расширят возможности использования биосенсорных платформ в протеомике для изучения белок-белковых взаимодействий. Полученные в рамках проекта результаты опубликованы в трех публикациях в журналах индексируемых международными системами цитирования Web of Science Core Collection и Scopus, из них 2 – в высокорейтинговых научных изданиях первого квартиля (Q1) с импакт-факторами 3,275 и 2,596 (что по условиям данного конкурса РНФ, засчитывается за 4 публикации) и представлены участниками проекта в качестве 1 устного и 1 постерного докладов на ведущих международных и российских конференциях.

Публикации

1. Брагина В.А., Орлов А.В., Знойко С.Л., Пушкарев А.В., Новичихин Д.О., Гутенева Н.В., Никитин М.П., Горшков Б.Г., Никитин П.И. Nanobiosensing based on optically selected antibodies and superparamagnetic labels for rapid and highly sensitive quantification of polyvalent hepatitis B surface antigen Analytical Methods, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1039/D1AY00354B

2. Пушкарев А.В., Орлов А.В., Знойко С.Л., Брагина В.А., Никитин П.И. Rapid and Easy-To-Use Method for Accurate Characterization of Target Binding and Kinetics of Magnetic Particle Bioconjugates for Biosensing Sensors, V. 21(8), 2802 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/s21082802

3. Брагина В.А., Черкасов В.Р., Бабёнышев А.В., Буренин А.Г., Новичихин Д.О., Гутенева Н.В. Optical Label-Free Method for Investigation of Polyvalent Antigen-Antibody Interactions for Diagnostics of Hepatitis B IEEE Xplore, - (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1109/ICLO48556.2020.9285631

Возможность практического использования результатов
Разработанные в проекте методы и подходы будут иметь следующие возможности для практического применения: - для высокочувствительного количественного обнаружения биомаркеров социально-значимых заболеваний (эндокринных, инфекционных, онкологических). В частности, разработанная технология для детекции маркеров инфекционных заболеваний позволит проводить диагностику вирусных гепатитов, например гепатита В, на ранних стадиях инфицирования, что особенно актуально для диагностики носителей инфекции, для экспресс-анализов и скринингового исследования определенным категориям лиц (сотрудникам медицинских учреждений, потенциальным донорам крови, беременным женщинам, пациентам перед хирургическим вмешательством и др.). Разработанная биосенсорная платформа для детекции маркеров эндокринных заболеваний позволит проводить достаточно простую экспресс диагностику состояний пациентов, как с малым, так и повышенным содержанием тиреотропного гормона в крови. Все это позволит с помощью разработанных биосенсорных систем обеспечить возможность исследования динамики заболеваний пациентов и проводить оценку эффективности выбранного курса терапии или хирургии (например, в случае удаления раковых опухолей). Разработанные экспресс-методы смогут применяться как безопасная альтернатива трудоемким лабораторным аналитическим методам с продолжительностью более 2-4 часов, в частности, радиоиммунным анализам, которые все еще часто используется в клинической диагностике, например для детекции гормонов щитовидной железы. - для высокочувствительной количественной экспресс-детекции токсинов и патогенов в продуктах питания, что представляется важным для многих социально-значимых задач биобезопасности и контроля качества продуктов питания. - pазработанные методы позволят усовершенствовать медицинскую помощь при социально-значимых заболеваниях, в частности, ускорить диагностические возможности иммуноанализов и переместить тестирование из специализированных лабораторий/клиник во внелабораторные условия, проводить диагностику в отдаленных районах и периферийных фельдшерских пунктах. Кроме того, разработанные конкурентоспособные на мировом уровне, высокочувствительные методы иммуноанализа в рамках курса на импортозамещение позволят заменить используемые во многих централизованных лабораториях для диагностики заболеваний тест-системы зарубежных производителей, на отечественные с более низкой стоимостью, особенно в условиях санкционной политики западных стран, направленной против России. Таким образом, в рамках проекта разработаны научных и технологических заделы для создания нового поколения высокочувствительных аналитических экономически эффективных экспресс-методов как для анализа биомолекулярных взаимодействий (в частности, белков с высоко- и низкомолекулярными соединениями), так и для решения актуальных задач здравоохранения, персонализированной медицины, экспрессной in vitro диагностики, безопасности пищевых продуктов и экологического мониторинга и т.д.