КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-74-10071

НазваниеСтруктурные аспекты механизма протекции бактериального генома, как принципиальный шаг на пути преодоления резистентности бактерий к антибиотикам

РуководительДадинова Любовь Александровна, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр "Кристаллография и фотоника" Российской академии наук", г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2021 

КонкурсКонкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словабиокристаллизация, структурная биология, белки, механизмы защиты нуклеоида, малоугловое рентгеновское рассеяние, криоэлектронная микроскопия, рентгеновская макромолекулярная кристаллография

Код ГРНТИ34.17.15


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на детальное изучение in vitro структурных аспектов защитного механизма бактерий E.coli в ответ на стресс, когда внутриклеточные энергетические ресурсы сильно истощены и выживание клеток обусловлено способностью прокариот поддерживать целостность своего генетического материала путем биокристаллизации. Для защиты от неблагоприятных экологических воздействий, в том числе антибактериальной терапии, бактериальная культура может войти в стационарную фазу, где активируются ее внутренние системы защиты от стресса. Чтобы выжить в неблагоприятных условиях, бактерия может кардинально изменить свою организацию, как на молекулярном, так и на клеточном уровнях. Понимание механизма, обеспечивающего защиту генетического материала, как и структура комплекса ДНК-Dps по-прежнему до конца не исследованы. Таким образом, детальное изучение процессов кристаллизации комплекса ДНК-Dps в различных условиях in vitro, имитирующих реальные негативные условия среды, является важным и актуальным и представляет собой цель данного проекта. С помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния будет проведен анализ структуры и построены модели стресс-индуцированного белка Dps и его комплекса с ДНК в растворе при различных условиях (в том числе, при оксидативном стрессе и в присутствии ионов магния и железа), разных длинах ДНК и временах выдержки раствора перед измерениями. Кроме того, метод МУРР будет крайне полезен для быстрого скринига условий образования комплекса, опираясь на результаты которого можно будет проводить дальнейшие исследования структуры с помощью крио-ЭИ и макромолекулярной кристаллографии. Методом криоэлектронной микроскопии будут получены изображения и трехмерные модели структуры комплекса, которые далее будут верифицированы с помощью МУРР. Методом рентгеновской макромолекулярной кристаллографии будут восстановлены кристаллические структуры комплекса с высоким разрешением 2-3 Ǻ. Знание механизмов, осуществляющих переход нуклеоида в конденсированное состояние и детальное изучение структуры комплекса и молекулярных взаимодействий ДНК с Dps необходимо как с фундаментальной, так и с практической точек зрения. Чтобы разработать меры по предотвращению или, по крайней мере, замедлению развития устойчивости генетического аппарата к антибиотикам, необходимо понимать реакцию бактерий на воздействие лекарственного средства на молекулярном уровне.

Ожидаемые результаты
На основании комплексного исследования методами МУРР, крио-ЭМ и макромолекулярной кристаллографии впервые будут получены данные о механизмах образования кристаллического комплекса ДНК со стресс-индуцированным белком Dps. Впервые будет определена в высоком разрешении трехмерная структура этого комплекса при различных соотношениях компонент и длины ДНК. Кроме того, будет изучено влияние ионов железа и магния, оксидативного стресса на процесс образования нанокристаллов, а также их размеры и структуру. В результате будут получены структура и данные о механизмах образования кристаллов Dps-ДНК комплекса, а также защитной роли белка Dps в качестве одного из основных исполнителей ответа клетки на стресс. Эта информация может быть использована для разработки новых антибактериальных и антивирусных препаратов. «Гонка вооружений» с бактериями стала одним из важнейших вопросов современной медицины, изучение клеточных механизмов, которые защищают ДНК и способствуют выживанию бактерии является важной задачей, поскольку с помощью подавления этих механизмов можно преодолеть проблему резистентности к антибиотикам.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетном периоде было проведено комплексное исследование структуры кристаллического комплекса ДНК со стресс-индуцированным белком Dps, как основного фактора защитного механизма нуклеоида клетки против неблагоприятных условий, в том числе действия антибиотика. Исследования проводились с использованием передовых методов структурной биологии: малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), крио-электронной томографии (крио-ЭТ), рентгеновской макромолекулярной кристаллографии. С помощью МУРР были определены условия для образования со-кристалла Dps-ДНК, показано, что длина ДНК в диапазоне 3130-9900 п.о. не влияет на образование структур. Методом крио-ЭТ получена структура со-кристалла с разрешением 13.5 Å, в которой впервые было показано взаиморасположение Dps и ДНК. Однозначность полученной модели была доказана с помощью теоретических расчетов с учетом положения дифракционных пиков на кривых МУРР. Также было продемонстрировано, что при изменении соотношения компонентов в растворе тип решетки со-кристалла в целом не меняется. Кристаллизация ДНК-Dps и последующая расшифровка полученного кристалла с разрешением 2.2 Å выявили отсутствие ДНК в карте электронной плотности. Объяснением такого парадоксального явления может служить предположение о том, что ДНК может обвиваться вокруг частицы додекамера и не имеет регулярного расположения в кристаллической упаковке. Исследование структуры комплекса на разных уровнях в растворе (т.е. условиях близких к нативным) и кристаллическом состоянии дает возможность детально проанализировать структурные особенности процессов биокристаллизации и понять факторы, которые способствуют, предотвращают или иным образом влияют на этот процесс. Все это позволит продвинуться в понимании действия защитного механизма клетки, что в свою очередь является важным шагом на пути преодоления резистентности клеток бактерий к противомикробным средствам.

 

Публикации

1. Дадинова Л., Чесноков Ю., Камышинский Р., Орехов А., Петухов М., Можаев А., Сошинская Е., Васильев А., Штыкова Э. Investigations of Dps/DNA crystallization conditions and the structure of biocrystals according to SAXS and cryo-electron microscopy data The FEBS Open Bio, - (год публикации - 2019).

2. Дадинова Л.А., Чесноков Ю.М., Камышинский Р.А., Орлов И.А., Петухов М.В., Можаев А.А., Сошинская Е.Ю., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Орехов А.С., Васильев А.Л., Штыкова Э.В. Protective Dps-DNA co-crystallization in stressed cells: an in vitro structural study by small-angle X-ray scattering and cryo-electron tomography FEBS Letters, - (год публикации - 2019).

3. Штыкова Э., Дадинова Л., Можаев А., Петухов М., Лойко Н., Крупянский Ю., Грузинов А., Шроер М., Джеффрис С., Свергун Д. Phenomenon of DNA preservation in stress induced cells: structural peculiarities of bio-crystallization processes in vivo and in vitro revealed by SAXS The FEBS Open Bio, - (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетном периоде было проведено комплексное исследование механизмов и условий возникновения процесса со-кристаллизации ДНК со стресс-индуцированным белком Dps, как основного фактора защитного механизма нуклеоида клетки против неблагоприятных условий, в том числе действия антибактериальных средств. Исследования проводились с использованием передовых методов структурной биологии: малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ). С помощью МУРР и крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) была обнаружена зависимость образования комплекса Dps-ДНК от состава буфера. Впервые наблюдался полиморфизм структур Dps-ДНК со-кристаллов. При определенных условиях со-кристаллы Dps-ДНК могут образовывать триклинную и кубическую структуры. Методом крио-электронной томографии (крио-ЭТ) кубическая структура со-кристаллов Dps-ДНК была определена с разрешением порядка 13.5 Å. Параметры этой кристаллической решетки были уточнены с помощью теоретических расчетов, исходя из анализа взаимного расположения брэгговских пиков на кривых малоуглового рассеяния и определенных по ним индексов Миллера. Уточненные параметры элементарной ячейки кубической решетки со-кристалла Dps-ДНК оказались равными: a= 13.9 нм, α = 90. С помощью анализа структуры отдельных частиц по данным крио-ЭМ впервые с разрешением 13 Å визуализировано взаимодействие Dps-ДНК и с разрешением 3 Å получена структура белка Dps, получены 2D классы Dps с развернутыми N-концевыми фрагментами. Методом МУРР показано влияние длины и топологии ДНК на образование комплекса Dps-ДНК. Определены критически важные условия среды для образования со-кристаллов и влияние бивалентных Fe2+ и Mg2+ катионов на формирование комплекса Dps-ДНК. Подробно проанализировано действие ЭДТА на Dps и его N-концевые фрагменты, которые ответственны за взаимодействие с ДНК. Комплементарность методов МУРР и крио-ЭМ позволили детально исследовать структурные особенности процессов биокристаллизации Dps-ДНК и определить факторы, которые влияют на этот процесс. Особенно важно, что структурные исследования были проведены в условиях наиболее приближенных к естественным при отсутствии специальной подготовки препаратов перед исследованиями. Это позволило продвинуться в понимании действия защитного механизма клетки. Выяснение фундаментальных биохимических, генетических и структурных основ резистентности имеет первостепенное значение для разработки стратегий, направленных на ограничение возникновения и распространения устойчивости бактерий, а также разработки инновационных терапевтических подходов.

 

Публикации

1. Камышинский Р., Чесноков Ю., Дадинова Л., Можаев А., Орехов А., Штыкова Э., Васильев А. In vitro cryo electron tomography study of protective Dps-DNA co-crystallization INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMEDICINE, June 2019 -Volume 9, Issue Suppl_1 (год публикации - 2019).

2. Камышинский Р.А., Чесноков Ю.М, Дадинова Л.А., Можаев А.А., Орлов И.А., Петухов М.В., Орехов А.С., Штыкова Э.В., Васильев А.Л. Полиморфизм структур биокристаллов Dps-ДНК НИЦ "Курчатовский институт", стр.89 (год публикации - 2019).

3. Камышинский Р.А., Чесноков Ю.М., Дадинова Л.А., Можаев А.А., Орлов И.А., Петухов М.В., Орехов А.C., Штыкова Э.В., Васильев А.Л. Polymorphic Protective Dps–DNA Co-Crystals by Cryo Electron Tomography and Small Angle X-Ray Scattering Biomolecules, 10(1), 39 (год публикации - 2020).

4. Камышинский Р.А., Чесноков Ю.М., Дадинова Л.А., Можаев А.А., Петухов М.В., Орехов А.С., Штыкова Э.В., Васильев А.Л. Исследования процессов формирования биокристаллов Dps-ДНК НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ, стр. 97 (год публикации - 2020).

5. Сошинская Е.Ю., Дадинова Л.А. , Можаев А.А. , Штыкова Э.В. Влияние состава буфера на конформационную подвижность N-концевых фрагментов Dps и характер взаимодействия с ДНК. Исследование методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Кристаллография, - (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном периоде было проведено комплексное исследование механизмов и условий возникновения процесса со-кристаллизации ДНК со стресс-индуцированным белком Dps, как основного фактора защитного механизма нуклеоида клетки против неблагоприятных условий, в том числе действия антибактериальных средств. Исследования проводились с использованием передовых методов структурной биологии: малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ). С помощью этих методов показано, что образование кристаллического комплекса не зависит от температуры в широком диапазоне значений 20- 60 С, однако при физиологической температуре 37 С наблюдается увеличение количества кристаллических комплексов. Эксперименты по выдерживанию смеси Dps-ДНК в течение недели показал отсутствие изменений в сформированных кристаллических структурах. Проведенный анализ изменения состава буфера и кислотности среды показал необходимость присутствия ЭДТА в растворе для образования кристаллов, а изменение pH в диапазоне значений 7.5- 8.0 приводит к возникновению полиморфизма кристаллических структур Dps-ДНК. Анализ гибкости N-концевых фрагментов белка показал, что их конформация и гибкость зависит от ЭДТА. Выявлено, N-концевые области Dps в присутствии ЭДТА свободно простирается в раствор от поверхности белка. Однако, несмотря на разупорядочение, не все 12 N-концов могут одновременно выступать далеко от поверхности белка Dps. Наблюдаемые протяженные и компактные конформации N-концов находятся в динамическом равновесии в растворе, и, следовательно, каждая из них может обеспечивать взаимодействие с ДНК. Соответствующие белковые структуры депонированы в SASBDB (https://www.sasbdb.org/) с кодами: SASDKF4 для Dps в растворе в присутствии ЭДТА и SASDKY4 для Dps в буфере без ЭДТА. Анализ влияния двухвалентных катионов железа и магния в виде 20 мМ MgCl2 и FeSO4 на структуру кристаллов Dps-ДНК показал, что в обоих случаях катионы разрушают комплекс, однако в случае магния эффект полностью обратим при добавлении 20 мМ ЭДТА. Комплексные исследования структуры белка Dps в зависимости от воздействия ионов железа и магния также показали различие в действии этих веществ. Добавление ионов магния приводит к компактизации N-терминалов белка Dps, что делает их недоступными для связывания с ДНК, тогда как добавление ионов железа приводит к накоплению железосодержащих кластеров в полости белка и его частичной агрегации. С помощью метода анализа проекций одиночных частиц получена трехмерная реконструкция структуры Dps с железосодержащим кластером с пространственным разрешением 3.2 Å. Показано, что железосодержащий кластер размером 10-15 Å располагается в полости додекамера Dps рядом с гидрофобной порой, вблизи 3 глутаматных остатков. Дополнительные эксперименты по МУРР на клетках E.coli Gold (мутированные), подвергнутых длительному периоду голодания (порядка нескольких месяцев) выявили наличие кристаллического комплекса внутри клетки. Однако положение пиков отличается от структуры Dps-ДНК in vitro, что может свидетельствовать о более сложной структуре, образованной in vivо, поскольку в клетке помимо главного белка Dps продуцируется еще ряд белков, участвующих в реакции на стрессовые условия. По полученным результатам сделан доклад на Научно-популярном лектории Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2020» https://www.youtube.com/watch?v=25N3ofuR4Fg, а также 3 кратких статьи в СМИ: https://www.gazeta.ru/science/news/2020/06/05/n_14512309.shtml https://www.poisknews.ru/themes/medicine/fiziki-izuchili-strukturu-zashhishhayushhuyu-genom-bakterij-ot-antibiotikov/ , https://indicator.ru/biology/zashishayushii-genom-ot-antibiotikov-kompleks-dnk-05-06-2020.htm Кроме того, по результатам проекта была защищена Р.А. Камышинским кандидатская диссертация на тему “Cтруктура биокристаллов Dps-ДНК по данным криоэлектронной томографии” https://crys.ras.ru/dissertatsionnyj-sovet/zashchity-dissertatsij#Kamyshinskii

 

Публикации

1. - Физики изучили структуру, защищающую геном бактерий от антибиотиков газета поиск, - (год публикации - ).

2. - Исследован механизм защиты генома бактерий от воздействия антибиотиков Indicator, - (год публикации - ).

3. - Что нужно знать, чтобы преодолеть резистентность бактерий? Научно-популярный лекторий Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2020», - (год публикации - ).

4. - Физики изучили структуру, защищающую геном бактерий от антибиотиков газета.ru, - (год публикации - ).

5. Дадинова Л.А., Можаев А.А., Камышинский Р.А., Чесноков Ю.М., Орлов И.А., Сошинская Е.Ю., Петухов М.В., Орехов А.С., Васильев А.Л., Штыкова Э.В. Структурные аспекты механизма защиты бактериального генома по данным малоуглового рентгеновского рассеяния и крио-электронной микроскопии Материалы ХV международной научной конференции, стр 29 (год публикации - 2020).

6. Дубровин Е.В., Дадинова Л.А., Петухов М.В., Сошинская Е.Ю., Можаев А.А., Клинов Д.В., Шаффер Т.Е., Штыкова Э.В., Батищев О.В. Spatial organization of Dps and DNA–Dps complexes Journal of Molecular Biology, Volume 433, Issue 10, 14 May 2021, 166930 (год публикации - 2021).

7. Камышинский Р. А., Чесноков Ю. М., Орехов А. С. Cryo-Electron Tomography Studies of Cell Systems Crystallography reports, № 5, т. 65, 744-748 (год публикации - 2020).

8. Камышинский Р.А., Чесноков Ю.М., Дадинова Л.А., Можаев А.А., Петухов М.В., Орехов А.С., Штыкова Э.В., Васильев А.Л. Определение структуры комплекса Dps-ДНК методами криоэлектронной томографии. Сборник тезисов РКЭМ 2020, том 2 (XXVIII Российская конференция по электронной микроскопии), Том2, стр.120-121 (год публикации - 2020).