Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетном периоде было проведено комплексное исследование структуры кристаллического комплекса ДНК со стресс-индуцированным белком Dps, как основного фактора защитного механизма нуклеоида клетки против неблагоприятных условий, в том числе действия антибиотика. Исследования проводились с использованием передовых методов структурной биологии: малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), крио-электронной томографии (крио-ЭТ), рентгеновской макромолекулярной кристаллографии. С помощью МУРР были определены условия для образования со-кристалла Dps-ДНК, показано, что длина ДНК в диапазоне 3130-9900 п.о. не влияет на образование структур. Методом крио-ЭТ получена структура со-кристалла с разрешением 13.5 Å, в которой впервые было показано взаиморасположение Dps и ДНК. Однозначность полученной модели была доказана с помощью теоретических расчетов с учетом положения дифракционных пиков на кривых МУРР. Также было продемонстрировано, что при изменении соотношения компонентов в растворе тип решетки со-кристалла в целом не меняется. Кристаллизация ДНК-Dps и последующая расшифровка полученного кристалла с разрешением 2.2 Å выявили отсутствие ДНК в карте электронной плотности. Объяснением такого парадоксального явления может служить предположение о том, что ДНК может обвиваться вокруг частицы додекамера и не имеет регулярного расположения в кристаллической упаковке. Исследование структуры комплекса на разных уровнях в растворе (т.е. условиях близких к нативным) и кристаллическом состоянии дает возможность детально проанализировать структурные особенности процессов биокристаллизации и понять факторы, которые способствуют, предотвращают или иным образом влияют на этот процесс. Все это позволит продвинуться в понимании действия защитного механизма клетки, что в свою очередь является важным шагом на пути преодоления резистентности клеток бактерий к противомикробным средствам.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетном периоде было проведено комплексное исследование механизмов и условий возникновения процесса со-кристаллизации ДНК со стресс-индуцированным белком Dps, как основного фактора защитного механизма нуклеоида клетки против неблагоприятных условий, в том числе действия антибактериальных средств. Исследования проводились с использованием передовых методов структурной биологии: малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ). С помощью МУРР и крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) была обнаружена зависимость образования комплекса Dps-ДНК от состава буфера. Впервые наблюдался полиморфизм структур Dps-ДНК со-кристаллов. При определенных условиях со-кристаллы Dps-ДНК могут образовывать триклинную и кубическую структуры. Методом крио-электронной томографии (крио-ЭТ) кубическая структура со-кристаллов Dps-ДНК была определена с разрешением порядка 13.5 Å. Параметры этой кристаллической решетки были уточнены с помощью теоретических расчетов, исходя из анализа взаимного расположения брэгговских пиков на кривых малоуглового рассеяния и определенных по ним индексов Миллера. Уточненные параметры элементарной ячейки кубической решетки со-кристалла Dps-ДНК оказались равными: a= 13.9 нм, α = 90. С помощью анализа структуры отдельных частиц по данным крио-ЭМ впервые с разрешением 13 Å визуализировано взаимодействие Dps-ДНК и с разрешением 3 Å получена структура белка Dps, получены 2D классы Dps с развернутыми N-концевыми фрагментами. Методом МУРР показано влияние длины и топологии ДНК на образование комплекса Dps-ДНК. Определены критически важные условия среды для образования со-кристаллов и влияние бивалентных Fe2+ и Mg2+ катионов на формирование комплекса Dps-ДНК. Подробно проанализировано действие ЭДТА на Dps и его N-концевые фрагменты, которые ответственны за взаимодействие с ДНК. Комплементарность методов МУРР и крио-ЭМ позволили детально исследовать структурные особенности процессов биокристаллизации Dps-ДНК и определить факторы, которые влияют на этот процесс. Особенно важно, что структурные исследования были проведены в условиях наиболее приближенных к естественным при отсутствии специальной подготовки препаратов перед исследованиями. Это позволило продвинуться в понимании действия защитного механизма клетки. Выяснение фундаментальных биохимических, генетических и структурных основ резистентности имеет первостепенное значение для разработки стратегий, направленных на ограничение возникновения и распространения устойчивости бактерий, а также разработки инновационных терапевтических подходов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном периоде было проведено комплексное исследование механизмов и условий возникновения процесса со-кристаллизации ДНК со стресс-индуцированным белком Dps, как основного фактора защитного механизма нуклеоида клетки против неблагоприятных условий, в том числе действия антибактериальных средств. Исследования проводились с использованием передовых методов структурной биологии: малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ). С помощью этих методов показано, что образование кристаллического комплекса не зависит от температуры в широком диапазоне значений 20- 60 С, однако при физиологической температуре 37 С наблюдается увеличение количества кристаллических комплексов. Эксперименты по выдерживанию смеси Dps-ДНК в течение недели показал отсутствие изменений в сформированных кристаллических структурах. Проведенный анализ изменения состава буфера и кислотности среды показал необходимость присутствия ЭДТА в растворе для образования кристаллов, а изменение pH в диапазоне значений 7.5- 8.0 приводит к возникновению полиморфизма кристаллических структур Dps-ДНК. Анализ гибкости N-концевых фрагментов белка показал, что их конформация и гибкость зависит от ЭДТА. Выявлено, N-концевые области Dps в присутствии ЭДТА свободно простирается в раствор от поверхности белка. Однако, несмотря на разупорядочение, не все 12 N-концов могут одновременно выступать далеко от поверхности белка Dps. Наблюдаемые протяженные и компактные конформации N-концов находятся в динамическом равновесии в растворе, и, следовательно, каждая из них может обеспечивать взаимодействие с ДНК. Соответствующие белковые структуры депонированы в SASBDB (https://www.sasbdb.org/) с кодами: SASDKF4 для Dps в растворе в присутствии ЭДТА и SASDKY4 для Dps в буфере без ЭДТА. Анализ влияния двухвалентных катионов железа и магния в виде 20 мМ MgCl2 и FeSO4 на структуру кристаллов Dps-ДНК показал, что в обоих случаях катионы разрушают комплекс, однако в случае магния эффект полностью обратим при добавлении 20 мМ ЭДТА. Комплексные исследования структуры белка Dps в зависимости от воздействия ионов железа и магния также показали различие в действии этих веществ. Добавление ионов магния приводит к компактизации N-терминалов белка Dps, что делает их недоступными для связывания с ДНК, тогда как добавление ионов железа приводит к накоплению железосодержащих кластеров в полости белка и его частичной агрегации. С помощью метода анализа проекций одиночных частиц получена трехмерная реконструкция структуры Dps с железосодержащим кластером с пространственным разрешением 3.2 Å. Показано, что железосодержащий кластер размером 10-15 Å располагается в полости додекамера Dps рядом с гидрофобной порой, вблизи 3 глутаматных остатков. Дополнительные эксперименты по МУРР на клетках E.coli Gold (мутированные), подвергнутых длительному периоду голодания (порядка нескольких месяцев) выявили наличие кристаллического комплекса внутри клетки. Однако положение пиков отличается от структуры Dps-ДНК in vitro, что может свидетельствовать о более сложной структуре, образованной in vivо, поскольку в клетке помимо главного белка Dps продуцируется еще ряд белков, участвующих в реакции на стрессовые условия. По полученным результатам сделан доклад на Научно-популярном лектории Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2020» https://www.youtube.com/watch?v=25N3ofuR4Fg, а также 3 кратких статьи в СМИ: https://www.gazeta.ru/science/news/2020/06/05/n_14512309.shtml https://www.poisknews.ru/themes/medicine/fiziki-izuchili-strukturu-zashhishhayushhuyu-genom-bakterij-ot-antibiotikov/ , https://indicator.ru/biology/zashishayushii-genom-ot-antibiotikov-kompleks-dnk-05-06-2020.htm Кроме того, по результатам проекта была защищена Р.А. Камышинским кандидатская диссертация на тему “Cтруктура биокристаллов Dps-ДНК по данным криоэлектронной томографии” https://crys.ras.ru/dissertatsionnyj-sovet/zashchity-dissertatsij#Kamyshinskii