Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В соответствии с заявкой, в первый год выполнения проекта проводились исследования каталитической активности цефалоспориновых соединений в активном центре металло-бета-лактамазы L1, молекулярного механизма реакции гидролиза имипенема карбапенемазой NDM-1 и сопоставление структурных особенностей металло-бета-лактамаз класса B3 и карбапенемаз. Предложена новая для ферментативных процессов концепция выделения и количественной оценки ключевых межатомных взаимодействий, определяющих константы скорости реакции набора родственных соединений в активном центре фермента. Для гидролиза цефалоспориновых соединений в активном центре L1 металло-бета-лактамазы показано, что в структуре переходного состояния лимитирующей стадии ключевой является водородная связь между OH фрагментом карбоксильной группы и атомом азота субстрата. Для характеризации водородной связи использовались такие дескрипторы электронной плотности (ЭП) как собственно значение ЭП, лапласиан ЭП, собственные значения матрицы Гессе ЭП, энергии связей, оцененные по эмпирическим соотношениям по значениям плотности кинетической или потенциальной энергии, а также атомные вклады в ЭП в критической точке связи. Для всех выбранных теоретических дескрипторов ключевого взаимодействия наблюдалась линейная взаимосвязь с экспериментальным макроскопическим параметром константой скорости стационарной кинетики Михаэлиса-Ментен, kcat. Особенностью поставленной задачи является то, что выбранный для рассмотрения набор соединений имеет разброс kcat менее чем в 100 раз. Поэтому корреляционные соотношения должны обладать небольшими погрешностями, чтобы быть пригодными для надежного прогнозирования новых соединений. Геометрические модели ведут к погрешности определения kcat 202-213 c-1 в изучаемом диапазоне, что более чем в 2 раза превышает диапазон изучаемых значений. Простейшие дескрипторы ЭП демонстрируют погрешности более 30 с-1, что также является неудовлетворительным. Наилучшим среди изученных в ходе проекта дескрипторов связывания оказался вклад атома азота в электронную плотность критической точки связи O-H…N; в изучаемом диапазоне ошибка для него составляет 3.2-9.4 с-1. Поэтому именно этот дескриптор был выбран для дальнейших исследований. Полученная зависимость протестирована на соединении, не входящем в обучающую выборку, – цефтазидиме. Для него предсказано значение 15.7 +/- 3.9 с-1, что полностью согласуется с экспериментальными данными 15.4 с-1. Также проведено метилирование и фторирование самого медленного субстрата цефокситина и показано, что двойное фторирование приводит к значимому уменьшению величины kcat. Проведено структурное и биоинформатическое сопоставление металло-бета-лактамаз класса B3 и карбапенемаз. Первое отличие состоит в различной ориентации петель, закрывающих активный центр от растворителя. Эти петли имеют разный аминокислотный состав, в результате чего в металло-бета-лактамазах класса B3 над пяти- или шестичленным кольцом субстрата расположен гидрофобный остаток пролина. В карбапенемазах в этой области расположены остатки, способные ориентировать молекулу воды на атом углерода пяти- или шестичленного кольца субстрата. Также в этих двух классах ферментов обнаружены различия в координационной сфере катиона цинка, координирующего атом азота субстрата. Эти различия и приводят к тому, что в результате гидролиза соединений в активном центре металло-бета-лактамаз класса B3 образуется продукт, протонированный по атому азота, а в карбапенемазах – по сопряженному с ним атому углерода. Проведено моделирование реакции гидролиза имипенема в активном центре карбапенемазы NDM-1. Показано, что барьеры всех элементарных стадий составляют менее 13 ккал/моль, что говорит о разумности предложенного механизма. Также предложенный механизм объясняет протонирование продукта реакции по атому углерода. По результатам работы опубликовано 2 статьи (New Journal of Chemistry (Q1) и Вестник Московского университета Серия 2: Химия (англоязычная версия – Q3)) и одна статья принята к публикации (Mendeleev Communications (Q2)); результаты работы доложены на 6 конференциях. На сайте организации, где выполняется проект, ФИЦ Биотехнологии РАН, опубликована информация о работе коллектива в рамках данного проекта: https://www.fbras.ru/novyiy-shag-na-puti-predskazatelnogo-molekulyarnogo-modelirovaniya-fermentativnyih-protsessov.html

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В полном соответствии с заявкой, во второй год выполнения проекта проводились исследования взаимодействий металло-бета-лактамаз с антибиотиками и ингибиторами. Дана интерпретация наблюдаемых экспериментально различий продуктов реакции гидролиза имипенема карбапенемазой NDM-1 и L1 металло-бета-лактамазой. В рамках комбинированного метода квантовой механики / молекулярной механики (КМ/ММ) рассчитаны равновесные геометрические конфигурации интермедиата реакции, предшествующего переносу протона на субстрат. Различия, объясняющие образование отличающихся продуктов реакции, наблюдаются в N-C-C фрагменте имипенема. В комплексе с L1 металло-бета-лактамазой наблюдается большая локализация отрицательного заряда на атоме азота и большая кратность связи С-С. В ходе гидролиза в активном центре NDM-1 наблюдается меньшая степень кратности связи С-С и большая степень кратности связи N-C, а также большая локализация отрицательного заряда на атоме углерода. Эти факторы являются определяющими при присоединении протона к атому углерода в комплексе имипенема с NDM-1 и к атому азота в комплексе с L1 мeталло-бета-лактамазой. Проведен анализ нелокальных пространственно-распределенных дескрипторов, включая обменную дырку Ферми и индексы делокализации в структурах переходного состояния лимитирующей стадии для 10 комплексов цефалоспориновых соединений с L1 металло-бета-лактамазой. Показано, что двойная связь во фрагменте N-C-C субстратов в ходе лимитирующей стадии формируется по-разному в быстрых и медленных субстратах. В быстрых субстратах в структуре переходного состояния связь С=С практически сформирована аналогично комплексу фермент-продукты. У медленных субстратов в структуре переходного состояния связь C-C практически не отличается по своим свойствам от структуры предшествующего интермедиата. Также можно заключить, что перенос протона от атома кислорода на атом азота в ходе лимитирующей стадии протекает медленнее для субстратов с низкими значениями kcat, поскольку электроны неподеленной пары атома азота в значительной степени делокализованы в направлении фрагмента H-O. Проведены тестовые расчеты структур переходных состояний лимитирующей стадии в комплексах цефалоспориновых соединений с L1 металло-бета-лактамазой для поиска оптимального протокола расчёта, позволяющего быстрее отбирать медленно гидролизующиеся субстраты. Показано, что можно использовать менее затратный вариант метода КМ/ММ, КМ(PBE0-D3/6-31G**)/ММ(AMBER), позволяющий ускорить расчёты более, чем в 5 раз. При этом ошибка определения каталитических констант увеличивается с 3.2 – 9.4 с-1 до 5.8 – 17.3 с-1, что является удовлетворительным для первичного скрининга. Предложенная идеология поиска ключевых межатомных взаимодействий, определяющих макроскопическое свойство, протестирована на комплексах цефалоспориновых соединений с другими металло-бета-лактамазами класса B3 (FEZ-1 и SMB-1). По результатам расчётов методом КМ/ММ с последующим анализом дескрипторов электронной плотности в критической точке водородной связи в структуре переходного состояния лимитирующей стадии показано, что закономерности, выявленные для L1 металло-бета-лактамазы можно распространить и на другие ферменты этого класса. Более сильная водородная связь характерна для более медленных субстратов. Рассчитаны равновесные геометрические конфигурации предреакционных комплексов борсодержащих ингибиторов и металло-бета-лактамазы NDM-1. Выбраны дескрипторы для определения электрофильности атома бора ингибитора и нуклеофильности каталитического гидроксид аниона, которые характеризуют реакционную способность комплекса. Показана важность учета конкретного белкового окружения и молекул растворителя для правильной оценки ингибирующей способности. Изучены небольшие модельные системы, имитирующие структуру переходного состояния лимитирующей стадии реакции гидролиза цефалоспоринового соединения в активном центре L1 металло-бета-лактамазы. Они состоят из остова гидролизованных цефалоспориновых соединений в структуре, аналогичной переходному состоянию лимитирующей стадии в активном центре L1 металло-бета-лактамазы, катиона цинка и двух молекул ДМСО, координирующих катион цинка. Донорно-акцепторный характер заместителей варьировался за счёт последовательного фторирования метильных групп заместителей цефалоспоринового остова. Показано, что изменения заместителей приводят к значительным изменениям силы водородной связи, определяющей реакционную способность соединений. По результатам работы опубликовано 2 статьи (RSC Advances (Q1 по данным Scopus) и Журнал физической химии) и 1 одна статья проходит рецензирование (International Journal of Quantum Chemistry (Q1 по данным Scopus)); результаты работы доложены на 7 конференциях в 10 устных и стендовых докладах.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В соответствии с заявкой, на третьем году выполнения Проекта проводились исследования взаимодействий металло-β-лактамаз и пенициллин связывающих белков с антибиотиками и ингибиторами. Проведено сравнение возможностей квантово-топологической теории атомов в молекулах (QTAIM) и метода связевых орбиталей (NBO) для анализа реакционной способности цефалоспоринов в активном центре металло-β-лактамазы L1. Для этого использован тот же набор модельных систем, что и ранее при поиске адекватных дескрипторов электронной плотности, характеризующих наблюдаемые константы скорости реакции гидролиза набора родственных соединений. Метод NBO качественно верно описывает изменение электронно-плотностных характеристик, в ходе лимитирующей стадии реакции, а именно чередование двойной и одинарной связи в N-C-C фрагменте шестичленного кольца цефалоспоринового остова. В то же время, сравнение аналогичных стационарных точек поверхности потенциальной энергии в комплексах с родственными соединениями не дало видимых различий этих свойств в рамках NBO анализа. В то же время, QTAIM позволяет различать особенности электронно-плотностной картины в каждом из комплексов и устанавливать взаимосвязь этих свойств с экспериментально наблюдаемой реакционной способностью. Результаты NBO анализа сильно отличаются для нитроцефина по сравнению со всеми остальными субстратами. Это связано с тем, что в нитроцефине π-система является гораздо более протяженной за счёт сопряжения цефалоспоринового остова с заместителем. Таким образом, метод NBO способен фиксировать различия в чередовании двойных и одинарных связей, а также в локализации неподеленных электронных пар при описании сильно различающихся систем, однако не способен различить ситуации с похожими субстратами и не может быть использован для объяснения различий в реакционной способности этих соединений. Определен механизм взаимодействия ингибиторов на основе бороновых кислот с металло-β-лактамазой NDM-1 и проведено его сравнение с химической реакцией с карбапенемовым антибиотиком имипенемом. В обоих случаях каталитической частицей является гидроксид анион, осуществляющий нуклеофильную атаку на карбонильный углерод субстрата или атом бора ингибитора. Согласно проведенным расчётам методом молекулярной динамики с потенциалами КМ/ММ с последующим расчетом атомной функции Фукуи f+, атом бора в растворе является гораздо более сильным электрофилом, чем карбонильный атом углерода имипенема. Это приводит к тому, что при связывании наблюдается сначала активация части популяции фермент-субстратных комплексов, после чего проходит химическая реакция с барьером 14 ккал/моль. Исходно высокая электрофильность атома бора ингибиторов, полученная из расчётов в растворе, приводит к безбарьерному образованию ковалентного аддукта с гидроксид анионом в результате связывания в активном центре фермента. Предложены количественные соотношения, позволяющие оценивать ингибирующую способность (величину IC50) родственных соединений бороновых ингибиторов с бензо[b]тиофеновым остовом по рассчитанным значениям функции влияния атомов кислорода в критических точках координационных связей в структурах комплексов. Анализ разнообразных соединений бензо[b]тиофеновым остовом показал, что заменой заместителей вряд ли можно добиться уменьшения IC50 ниже 30 μМ. В рамках направления, связанного с перепрофилированием лекарств, рассчитаны структуры комплексов унитиола с металло-β-лактамазами NDM-1 и VIM-2 и сериновой β-лактамазой OXA-48 методом КМ/ММ, исследованных экспериментально коллегами-экспериментаторами. Унитиол образует комплексы с тяжелыми металлами и уже используется в медицинской практике при отравлениях ими. Это соединение имеет две тиоловых группы и одну сульфоновую. Во всех случаях последняя образует солевые мостики с заряженными остатками лизином или аргинином, которые необходимы в активном центре для связывания карбоксильной группы антибиотиков. Тиоловые группы имею различные функции. В случае сериновой β-лактамазы они остаются в нейтральном состоянии и способны занимать гидрофобный карман. При связывании с активным центром металло-β-лактамаз одна из двух тиоловых групп занимает место каталитического гидроксид аниона, что сопровождается ее депротонированием и переносом протона на каталитический аспартат. Этот процесс аналогичен химической реакции с антибиотиком. Антибиотики ацилируют аминокислотный остаток серина активного центра пенициллин-связывающих белков, что блокирует дальнейший рост клеточной стенки. Однако мутации этих ферментов приводят к ухудшению каталитических параметров ацилирования. Так, например, появление мутаций в PBP2 из Neisseria gonorrhoeae приводит к уменьшению величины k2/KS в десятки и даже сотни раз. Мы рассматривали этот белок из штамма дикого типа FA19 и мутантных H041 и 35/02. Расчёты методом классической молекулярной динамики показали, что присутствующие точечные мутации значительно влияют на динамическое поведение PBP2. Петля между остатками 502-514 различается сильнее всего в исследуемых структурах и именно она участвует в связывании антибиотиков в активном центре PBP2, что может влиять на связывание ингибитора с ферментом. Накопленные в ходе выполнения работы над Проектом новые знания по механизмам гидролиза субстратов металло-β-лактамазами, а также механизмам их ингибирования обобщены и систематизированы в обзоре.