Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Методом ТСХ были проанализированы 14 этанольных экстрактов морских губок. Был отобран один наиболее интересный образец морской губки рода Topsentia. Из концентрированного этанольного экстракта морской губки рода Topsentia путем хроматографирования на различных сорбентах была выделена серия полисульфатированных стероидных соединений. Для всех выделенных соединений получены 1H- и 13C ЯМР- и масс-спектры. Методом ТСХ были проанализированы 12 этанольных экстрактов морских звезд. Для дальнейшей работы были отобраны три наиболее перспективных вида: Anthenea aspera, Ceramaster patagonicus и Solaster pacificus. В результате хроматографического разделения из морской звезды Anthenea aspera были выделены три новых стероидных бигликозида, названные антенозиды V–X, и семь ранее известных соединений: антенозиды E, G, S1, S4 и S6 и смесь эпимеров - антенозиды J и K. Структуры новых соединений были установлены различными одно- и двумерными методами ЯМР, а также масс-спектрометрией, включая масс-спектрометрию высокого разрешения. Антенозид V содержит редкое 5α-холест-8(14)-ен-3α,7β,16α-гидроксистероидное ядро. Антенозиды W и X были выделены в виде неразделимой смеси эпимеров. Смесь антенозидов J и K обладала умеренной цитотоксической активностью по отношению к клеточным линиям RPMI-7951, T-47D и HT-29. Было показано, что выделенные соединения в нецитотоксической концентрации 40 мкМ ингибируют образование колоний и рост клеток RPMI-7951, T-47D и HT-29 в различной степени. Антенозиды J и K обладали значительной ингибирующей активностью в отношении всех протестированных клеточных линий. Эти гликозиды уменьшали количество колоний раковых клеток RPMI-7951, T-47D и HT-29 на 64, 55 и 83% соответственно по сравнению с необработанными клетками. Было показано, что антенозиды J и K подавляют экспрессию антиапоптотического белка Bcl-XL и повышают экспрессию проапоптотических белков Bax и Bak, которые приводят к активации инициаторной каспазы-9. Активированная каспаза-9, в свою очередь, индуцировала усиление экспрессии эффекторной каспазы-3 дозо-зависимым образом. В результате смесь исследуемых антенозидов J и K при 40 мкМ вызывала протеолитическое расщепление каспазы-3 и индуцировала апоптоз клеток колоректальной карциномы. Таким образом, смесь антенозидов J и K значительно ингибировала образование колоний клеток меланомы человека, рака молочной железы и колоректальной карциномы и индуцировала апоптоз в клетках колоректальной карциномы HT-29 посредством индукции апоптоза по митохондриальному сигнальному каскаду. Начато исследования двух других видов морских звезд: Ceramaster patagonicus и Solaster pacificus. В результате хроматографического разделения были получены общие фракции церамидов (28.5 г) и цереброзидов (23.0 г). Также начато хроматографическое разделение фракций гликозидов из морской звезды Solaster pacificus. Рекомбинантные аналоги актинопорины Hct-A2 и Hct-S3 актинии Heteractis crispa были получены путем комбинации методов молекулярного клонирования и металл-аффинной хроматографии. Экспрессионные конструкции, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую актинопорин, были созданы на основе вектора pET-41а(+), предназначенного для экспрессии гибридных белков с белком-носителем – глутатион-S-трансферазой (GST) в бактериальной системе. Целевые гены были встроены в вектор по сайтам эндонуклеаз рестрикции PshAI и HindIII. Рекомбинантные плазмиды pET41а/hct-a2 и pET41а/hct-s2 были выделены, секвенированы и использованы для трансформации клеток E. coli штамма Rosetta (DE3) путем электропорации. Далее была проведена процедура экспрессии, позволяющая получить рекомбинантные актинопорины в виде химерных белков, включающих GST, полигистидиновый сайт и сайт для расщепления энтеропептидазой (DDDDK). Экспрессию химерного белка индуцировали ИПТГ (изопропил-β-D-тиогалактозидом). В ходе проведения экспрессии были подобраны оптимальные условия для увеличения выхода химерного белка. Молекулярная масса гибридного белка составила ~50 кДа, что согласуется с расчетными данными (~52 кДа). Выделение рекомбинантных актинопоринов, rHct-A2 и rHct-S3, осуществляли методом металлоаффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе в нативных условиях. Общий выход rHct-A2 и rHct-S3 составил 2,3 мг и 3,0 мг с 1 литра клеточной культуры соответственно. В результате было получено 6 мг rHct-A2 и 8 мг rHct-S3. Молекулярные массы актинопоринов, установленные методом МАЛДИ-ВП МС, составила 19172 Да для rHct-A2 и 19573 Да для rHct-S3. Гемолитическая активность rHct-A2 составила 2,3×103 ГЕ/мг. На трех линиях опухолевых клеток была исследована цитотоксическая активность рекомбинантного актинопорина, rHct-A2. Показано, что rHct-A2 вызывал гибель 50% клеток рака толстой кишки (HT-29), рака молочной железы (MDA-MB-231) и меланомы (SK-MEL-28) в концентрациях 34, 46 и 63 мкМ, соответственно, и на 47% ингибировал формирование колоний клеток HT-29 в концентрации 20 мкМ.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Из морской губки Halichondria vansoesti было выделено семь новых необычных полисульфатированных стероидов. Некоторые из исследованных метаболитов показали способность ингибировать экспрессию простатического специфического антигена (ПСА) в лекарственно-устойчивых клетках 22Rv1 в низких микромолярных концентрациях. Таким образом, снижение экспрессии ПСА может говорить об ингибировании сигналинга андрогенового рецептора. Также ряд выделенных стероидов показал способность ингибировать потребление глюкозы опухолевыми клетками. Данное исследование является первым сообщением о способности морских стероидных соединений ингибировать экспрессию ПСА/сигналинга андрогенового рецептора, а также потребление глюкозы опухолевыми клетками человека. Был исследован механизм противоопухолевого действия нового бициклического гуанидинового алкалоида урупоцидина C (Ur-C), выделенного ранее из глубоководной морской губки Monanchora pulchra. Мы показали, что в опухолевых клетках рака простаты Ur-C способен вызывать остановку клеточного цикла в G1- и S-фазах, а также индуцировать опосредованную каспазой-3 гибель клеток. Впервые таргетирование митохондрий было определено как центральный механизм противоракового действия для подобных молекул. Таким образом, обработка выделенными алкалоидами приводила к пермеабилизации митохондриальной мембраны, в результате чего происходило высвобождение цитотоксических митохондриальных белков в клеточную цитоплазму, активация активных форм кислорода (ROS), последующая активация каспазы-9 и -3, расщепление PARP, фрагментация ДНК и апоптоз. Кроме того, при совместном применении Ur-C с клинически одобренным ингибитором PARP олапарибом, наблюдались синергические эффекты. Наконец, данный алкалоид проявлял аддитивный эффект в сочетании с доцетакселом и энзалутамидом (ингибитор андрогенового рецептора, применяемый в химиотерапии рака простаты). Кроме того, противораковая активность и механизм действия нового морского пентациклического гуанидинового алкалоида монанхоксимикалина С, выделенного из этого же вида морской губки, была также изучена на клетках рака предстательной железы человека 22Rv1. В результате было показано, что обработка клеток монанхоксимикалином С приводила к экстернализации фосфатидилсерина, активации каспазы-3, а также расщеплению PARP. Экспрессия анти-апоптотического белка сурвивина снижалась. Дальнейшие эксперименты по ингибированию каспаз показали, что под действием вещества на клетки происходит неапоптотическая гибель клеток, которая также является каспазо-независимой. Скрининг активности киназ выявил, что активация митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) c-Jun N-концевой протеинкиназы (JNK1/2) является первичным молекулярным эффектом монанхоксимикалина С в клетках рака простаты. Четыре новых конъюгата, сложные эфиры полигидроксистероидов с длинноцепочечными жирными кислотами, были выделены из глубоководной дальневосточной морской звезды Ceramaster patagonicus. Структуры выделенных соединений были установлены методами ИК, одно- и двумерной ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрией, а также химическими превращениями. Были исследованы цитотоксическая и антипролиферативная активности выделенных соединений на нормальных эпидермальных клетках мыши JB6 Cl41, клетках рака молочной железы человека MDA-MB-231 и колоректальной карциномы HCT 116. Было обнаружено, что тестируемые соединения были нетоксичными в отношении тестируемых клеток в концентрациях до 100 мкМ. Кроме того, мы определили цитостатическое (антипролиферативное) действие выделенных соединений на клетках JB6 Cl41, MDA-MB-231 и HCT 116 в нетоксических концентрациях. Было показано, что обработка всех протестированных клеточных линий данными соединениями в концентрации 20 мкМ приводила к небольшому ингибированию пролиферации клеток даже через 72 часа обработки. В настоящем исследовании было обнаружено, что выделенные соединения ингибировали образование колоний опухолевых клеток MDA-MB-231 и клеток HCT 116. Кроме того, мы исследовали способность данных соединений ингибировать миграцию клеток рака молочной железы MDA-MB-231 и клеток колоректальной карциномы человека HCT 116 с высоким инвазивным потенциалом. Было продемонстрировано, что два соединения (в концентрации 20 мкМ) способны предотвращать миграцию клеток MDA-MB-231 на 42% и 50% соответственно по сравнению с контролем после 48 ч инкубации. Другие два соединения обладали умеренной антиметастатической активностью в отношении клеток MDA-MB-231. С другой стороны, одно из соединений практически полностью предотвращало миграцию клеток HCT 116. Кроме того, нами были изучены другие малополярные соединения, полученные из морской звезды Ceramaster patagonicus. В результате хроматографического разделения были получены индивидуальные церамиды и цереброзиды. Из морской звезды Solaster pacificus было выделено восемь новых соединений, пацификусозиды A-H, и одно соединение было идентифицировано как известный тритерпеновый гликозид кукумариозид D. Структуры новых соединений были установлены с помощью методов двумерной ЯМР спектроскопии, а также при помощи ИЭР масс-спектрометрии высокого разрешения и ИЭР МС/МС. Мы исследовали цитотоксическую и канцерпревентивную активности выделенных соединений по отношению к нормальным эпидермальным клеткам мыши JB6 Cl41. Показано, что исследуемые вещества подавляют жизнеспособность клеток в низких микромолярных концентрациях. Установлено, что ряд соединений в нетоксической концентрации 0,5 мкМ ингибировали TPA- и EGF-индуцированную неопластическую трансформацию JB6 Cl41 клеток. Стоит отметить, что данные по биологической активности хорошо согласуются со структурными особенностями выделенных соединений. Так, наиболее активные вещества содержат одну и ту же пентасахаридную углеводную цепь с терминальной 3-О-Ме глюкозой и схожий тритерпеновый агликон, отличаясь друг от друга только конфигурацией двойной связи в боковой цепи агликона. В то же время соединения, показавшие наименьшую активность, также имеют общую структурную особенность – укороченную тетрасахаридную углеводную цепь, в которой терминальный моносахаридный остаток не имеет метильной группы по С-3. По всей вероятности, наличие такого метилированного углеводного фрагмента, а также длина углеводной цепи, играют важную роль в проявлении противоопухолевых свойств у выделенных соединений. Были получены рекомбинантные аналоги актинопоринов Hct-A2 и Hct-S3 актинии Heteractis crispa по описанной ранее схеме. Гемолитическая активность rHct-S3 на эритроцитах человека составила 3,58∙103 ГЕ/мг, что сопоставимо с активностью rHct-A2. rHct-S3 был исследован в in vitro модели EGF-индуцированной неопластической трансформации эпидермальных клеток мыши JB6 Cl41 в мягком агаре. Установлено, что rHct-S3 в концентрации 20 мкМ ингибировал неопластическую трансформацию JB6 Cl41 клеток, индуцированную EGF, на 25 % по сравнению с трансформированными клетками.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Исследование противоопухолевой активности вторичных метаболитов морских губок. Было исследовано изменение активности протеинкиназ под действием гуанидинового алкалоида монанхоксимиколина (MomC) с помощью функциональной киномики с использованием технологии PamTechnology®, которая позволяет идентифицировать киназы, специфически активируемые или ингибируемые под действием конкретного препарата. В результате была выявлена общая повышенная активность STK в образцах, обработанных MomC, по сравнению с контрольной группой. Следует отметить, что никакого значительного ингибирования фосфорилирования, вызванного обработкой MomC, не наблюдалось ни для одного из исследованных пептидов. Также в ходе исследования кинома была предсказана активация киназы PRKY. По результатам анализа было предсказано, что киназы p38, JNKs и ERKs преимущественно активируются MomC в раковых клетках. Чтобы подтвердить эти результаты, был проведен Вестерн-блоттинг анализ экспрессии активных форм данных киназ после различного времени обработки MomC. Было показано, что доза- и время-зависимая активация JNK1/2 наблюдалась уже через 6 ч после начала обработки клеток. Напротив, активации каспазы-3 после данного периода обработки обнаружено не было. Следует отметить, что никаких изменений в соотношении активной к неактивной формам киназ ERK1/2 или p38 не было обнаружено даже после 48 ч обработки. Ингибирование как фосфорилированной, так и общей киназы p38 было связано с цитотоксическими процессами, которые начинают проявляться через 12 ч после начала воздействия MomC на клетки. Чтобы определить специфические эффекты в клетках рака простаты, была проведена совместная обработка клеток MomC и SP600125 – известным специфическим ингибитором киназы JNK1/2. Для исследования данного процесса был использован метод Чоу-Талалая. Была получена карта цитотоксической активности MomC и SP600125 в индивидуальном виде, а также в комбинации друг с другом. Дальнейший анализ данных выявил антагонистический эффект SP600125 на цитотоксическую активность MomC в клетках 22Rv1 во всем диапазоне концентраций исследуемого морского алкалоида. Таким образом, было установлено, что активация JNK1/2 была определена как про-цитотоксический стимул, важный для реализации индуцируемой веществом цитотоксической программы. Поскольку активация киназы JNK может быть результатом окислительного стресса, были исследованы уровни АФК в клетках 22Rv1, обработанных MomC. Действительно, повышенная регуляция АФК была обнаружена через 6 ч после обработки клеток веществом. Более того, предварительная обработка клеток известным антиоксидантом N-ацетил-L-цистеином (NaC) значительно подавляла цитотоксический эффект MomC. Таким образом, активация АФК вносит значительный вклад в противоопухолевую активность исследуемого морского алкалоида. Кроме того, также был обнаружен выход ряда цитотоксических митохондриальных белков в клеточную цитоплазму. Такими белками были, например, цитохром с и фактор индукции апоптоза. Данный факт свидетельствует об увеличении под действием MomC проницаемости митохондриальных мембран, которая может быть как причиной, так и результатом повышенной продукции АФК. Было исследовано влияние ингибитора PARP олапариба на активность MomC. Однако ожидаемого синергетического эффекта олапариба не наблюдалось, а напротив, был обнаружен выраженный антагонистический эффект. В проведенных экспериментах наблюдалась повышенная регуляция цитотоксических АФК и повреждение митохондрий под воздействием MomC. Кроме того, активный PARP требовался для индуцированной MomC цитотоксической активности. Таким образом, повышенная продукция АФК вызвала не классическую апоптотическую гибель клеток, опосредованную индукцией разрывов одноцепочечной ДНК, а скорее специфическую активацию JNK, приводящую к дальнейшей активации PARP. Полученные результаты показывают, что MomC осуществляет свой цитотоксический эффект именно таким образом. Исследование вторичных метаболитов морских звезд. При помощи хроматографии на Полихром 1 и силикагеле, а также ВЭЖХ на колонках с обратной фазой из морской звезды Solaster pacificus было выделено шесть индивидуальных тритерпеновых гликозидов: новые пацификусозиды А-С и известные кукумариозиды С1, С2 и А10. Цитотоксическая активность выделенных соединений была исследована на нормальных эмбриональных клетках почки HEK 293, клетках колоректальной карциномы HT-29, клетках меланомы человека RPMI-7951 и клетках молочной железы MDA-MB-231 при помощи MTS-метода. Кукумариозиды С1, С2 и А10 обладают высокой цитотоксической активностью против тестируемых клеточных линий. Пацификусозид С имеет также высокую цитотоксическую активность против клеток HEK 293, HT-29 и MDA-MB-231 и умеренную против клеток RPMI-7951. Пацификусозид В ингибировал клеточную выживаемость всех типов протестированных клеток с IC50 более чем 20 μM. В то же время пацификусозид А был нетоксичен против всех типов клеток в концентрациях до 40 μM. Было проанализировано влияние выделенных тритерпеновых гликозидов в смеси с холестерином на жизнеспособность клеток. Было обнаружено, что цитотоксическая активность исследуемых соединений в сочетании с холестерином заметно уменьшалась по сравнению с активностью индивидуальных тритерпеновых гликозидов. Полученные данные позволили предположить, что механизм цитотоксического действия тритерпеновых гликозидов может быть объяснен связыванием с холестерином плазматических мембран, что приводит к мембранолизу и гибели клеток. Было исследовано влияние тритерпеновых гликозидов на рост и формирование колоний опухолевых клеток в нетоксичных концентрациях 0,1, 0,5 и 1 μM. Пацификусозиды А и В, а также кукумариозид А10 в концентрации 1 мкМ обладают умеренной ингибирующей активностью. Пацификусозид С и кукумариозиды С1 и С2 практически полностью подавляли рост колоний клеток HT-29, RPMI-7951 и MDA-MB-231 в концентрациях 0,5 μМ и 1 μМ. Насколько нам известно, это первые сведения о том, что тритерпеновые гликозиды в нетоксичных концентрациях значительно ингибировали образование колоний опухолевых клеток человека. На основании полученных данных, была высказана гипотеза о том, что активность тритерпеновых гликозидов зависит от структуры боковой цепи в тритерпеновом агликоне. Также была еще раз подтверждена гипотеза о том, что тритерпеновые гликозиды обладают мембранолитическим действием и проявляют свой цитотоксический эффект, связывая компоненты плазматической мембраны клеток-мишеней. Были изучены малополярные соединения, полученные из объединенного хлороформ-метального и этанольного экстрактов морской звезды Ceramaster patagonicus. В частности, при помощи распределительной хроматографии, хроматографии на силикагеле, а также ВЭЖХ было получено семнадцать подфракций, которые содержали смеси церамидов. На основании ХС атомов углерода концевых метильных групп в 13С ЯМР спектрах выделенных церамидов сделан вывод о наличие нормального, изо- и анте-изо типов жирной кислоты и сфингозинового основания. Абсолютная стереохимия асимметрического центра в 2-(R)-2-гидрокси-жирных кислотах была определена на основании величины удельного вращения. Аналогичным образом была определена абсолютная стереохимия фитосфингозинового основания. Также из малополярной части экстракта морской звезды Ceramaster patagonicus была выделена серия цереброзидов. В 1Н и 13С ЯМР спектрах этих соединений наблюдались сигналы, характерные для глюкоцереброзида сфингозинового типа, содержащего остаток 2-гидрокси жирной кислоты. Структуры выделенных соединений были определены аналогичным способом. Результаты изучения противоопухолевой активности рекомбинантного аналога актинопорина морской анемоны Heteractis crispa. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей известных актинопоринов и Hct-S3 показал, что Hct-S3 объединяет высокая степень идентичности (87–89%) с гигантоксином-4 из Stichodactyla gigantea, а также RTX-A из H. crispa и StnI из Stichodactyla helianthus, которые обладают противоопухолевой активностью. Рекомбинантный пептид был получен в составе гибридного белка с глутатион-S-трансферазой, сайтом расщепления для энтеропептидазы и полигистидиновой последовательностью как продукт экспрессии гена в бактериальной системе. Выход целевого актинопорина составил 1 мг/л клеточной культуры. Молекулярная масса пептида по данным MALDI-TOF MS составила 19393 Да, что соответствует расчетной (19390 Да). Цитотоксическая активность актинопорина была исследована на человеческих клетках рака кишечника HT-29, рака молочной железы MDA-MB-231, меланомы SK-MEL-28, а также нормальных эпидермальных клетках мыши JB6 C141 и клетках эмбриональных почек человека HEK 293 методом МТS. Показано, что актинопорин проявлял цитотоксическую активность в отношении всех линий клеток. Актинопорин в концентрациях 1, 2 и 4 мкМ ингибировал EGF–индуцированную неопластическую трансформацию клеток JB6 C141 на 10% ± 5.0, 23% ± 2.5, и 34% ± 0.2 соответственно. В этих же концентрациях рекомбинантный Hct-S3 снижал количество колоний HT-29 на 25% ± 1.8, 33% ± 0.1, и 47% ± 0.9; MDA-MB-231 – на 17% ± 2.4, 20% ± 2.5 и 37% ± 1.2; SK-MEL-28 – 18% ± 1.5, 24% ± 0.5, 34% ± 3.6 соответственно. Hct-S3 в концентрациях 1, 2 и 4 мкМ подавлял миграцию клеток HT-29 на 33% ± 10.2, 50% ± 7.5 и 99% ± 6.4, по сравнению с контрольной группой. Кроме того, была проверена антипролиферативная активность актинопорина. Показано, что в концентрациях 1, 2 и 4 мкМ Hct-S3 слабо снижал скорость пролиферации клеток HT-29 после 24 и 48 ч, тогда как после 96 ч обработки полипептидом пролиферация клеток была снижена на 11% ± 3.0, 26% ± 1.2 и 31% ± 5.0 соответственно, что свидетельствует об умеренной антипролиферативной активности актинопорина. Для выявления предполагаемого механизма антимиграционной активности Hct-S3, было оценено влияние полипептида на уровень экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММР)-2 и -9. Актинопорин в концентрации 2 мкМ эффективно ингибировал экспрессию как ММР-2, так и ММР-9. Более того, было протестировано влияние Hct-S3 на активацию каспазы-3, поли (АДФ-рибозы) полимеразы (PARP), а также уровень экспрессии факторов Bcl-2 и Вах. Актинопорин запускал расщепление каспазы-3 и PARP, что свидетельствует о запуске механизма апоптоза, а также активацию экспрессии антиапоптотического фактора Вах и подавление экспрессии проапоптотического фактора. Таким образом, рекомбинантный Hct-S3 снижает миграцию клеток рака кишечника HT-29, вероятно, путем ингибирования ММР-2 и ММР-9 и запускает процесс апоптоза посредством активации каспазы-3. Таким образом, показано, что актинопорин H. crispa обладает противоопухолевой активностью в отношении клеток рака кишечника, молочной железы и меланомы. Установлено, что Hct-S3 подавляет миграцию клеток рака кишечника путем ингибирования экспрессии ММР-2 и ММР-9, запускает механизм апоптоза посредством активации каспазы-3 и PARP, а также регулирует экспрессию апоптотических белков Bcl-2 и Вах. Полученные результаты указывают на высокий потенциал актинопорина в качестве противоопухолевого соединения.