КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-74-00123

НазваниеИзучение ДНК-белковых взаимодействий в терминальных комплексах бактериофагов термофильных бактерий

РуководительКлимук Евгений Иванович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионАвтономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2020 

КонкурсКонкурс 2018 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаВирусы, бактериофаги, термофильные бактерии, аппарат упаковки ДНК, ДНК-белковые комплексы, малая субъединица терминазы, рентгеноструктурный анализ, 3D структуры

Код ГРНТИ34.15.15


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Вирусы являются наиболее распространенной "формой жизни" на Земле, они способны инфицировать любые живые организмы. Упаковка вирусного генома в капсид является неотъемлемой частью жизненного цикла вируса. Она может происходить путем одновременной сборки белковой капсулы с геномом, а может быть двухстадийной - для ее осуществления вирусы используют специальные молекулярные машины, питаемые энергией гидролиза макроэргических соединений, для упаковки генома в предварительно сформированный капсид. Несмотря на структурное и функциональное сходство, эти молекулярные машины эволюционировали для выполнения различных задач, и многие из них до сих пор плохо охарактеризованы. Наиболее изучены моторы упаковки ДНК у бактериофагов, или вирусов бактерий. В состав этого мотора у хвостатых бактериофагов (и эволюционно связанных с ними патогенных герпесвирусов, таких как вирус Эпштейна-Барр, Цитомегаловирус, вирус Варицелла-Зостер) входят 3 белка: портальный белок, формирующий ворота для входа ДНК внутрь прокапсида, а также малая и большая субъединицы терминазы, ответственные за узнавание фаговой ДНК и ее перемещение внутрь прокапсида с последующим нуклеазным раскусом, соответственно. Бесхвостые бактериофаги (и эволюционно связанные с ними патогенные поксвирусы, например, вирус оспы) также используют мотор для упаковки геномной ДНК в капсид, однако он не содержит портальный белок. Взаимодействие с капсидом, а также перемещение геномной ДНК в капсид, происходит за счет АТФазы, формирующей 12-мерные олигомеры. Для инициации упаковки с концом геномной ДНК ковалентно связывается терминальный белок, он же является сигналом окончания упаковки, механически блокируя вход в капсид за счет связывания со вторым концом ДНК. В последние годы достигнут прогресс в получении данных о 3D структуре отдельных компонентов мотора упаковки ДНК у хвостатых бактериофагов и получены новые функциональные данные в так называемых «single-molecule» экспериментах in vitro, однако механизм упаковки ДНК в вирусные частицы до сих пор неизвестен. В частности, до сих пор нет понимания механизма узнавания ДНК и инициации упаковки. Для бесхвостых бактериофагов даже структурная информация о компонентах мотора упаковки ДНК крайне ограничена. В рамках этого проекта мы ожидаем получить структурные данные для компонентов терминального комплекса аппарата упаковки ДНК, а также охарактеризовать формируемые ими ДНК-белковые комплексы на модели бактериофагов, инфицирующих термофильные бактерии рода Thermus. Несколько таких бактериофагов были недавно выделены и охарактеризованы в нашей лаборатории. Известно, что белки термофильных организмов являются более стабильными и упорядоченными. Использование в качестве модельных организмов бактериофагов термофильных бактерий в рамках предварительных экспериментов позволило нам и нашим коллегам (в сотрудничестве с нами) закристаллизовать и решить 3D структуры отдельных компонентов аппарата упаковки ДНК, например, портального белка и нуклеазного домена большой субъединицы терминазы хвостатого бактериофага G20c. Мы ожидаем, что используя структурные, биофизические и биохимические подходы нам удастся выяснить молекулярные основы узнавания и инициации упаковки ДНК терминальным комплексом аппарата упаковки ДНК бактериофагов, инфицирующих термофильные бактерии рода Thermus.

Ожидаемые результаты
В рамках выполнения проекта будет проведена структурно-функциональная характеристика компонентов терминального комплекса аппарата упаковки ДНК, а также формируемых ими ДНК-белковых комплексов из бактериофагов G18 и phiKo, инфицирующих термофильную бактерию Thermus thermophilus. Эти бактериофаги были выделены в нашей лаборатории из образцов воды геотермальных источников Камчатки, последовательность их геномной ДНК полностью определена в ходе предварительных исследований. Малые субъединицы терминазы хвостатых бактериофагов, ответственные за узнавание сайта инициации упаковки ДНК, как правило, имеют низкий уровень сходства аминокислотных последовательностей, не позволяющий провести их предсказание методами биоинформатики при аннотации геномных последовательностей новых бактериофагов. Зачастую компоненты аппарата упаковки ДНК хвостатых бактериофагов закодированы в геноме в виде оперона, в котором первый ген кодирует малую субъединицу терминазы. В ходе предварительных исследований в геноме бактериофага G18 был предсказан оперон, кодирующий компоненты аппарата упаковки ДНК. При гетерологической экспрессии предполагаемого гена малой субъединицы терминазы, мы получили хорошо растворимый белок, который согласно результатам аналитической гель-фильтрации обладает молекулярной массой около 180 кДа. Поскольку молекулярная масса мономера малой субъединицы терминазы бактериофага G18 равна 21кДа, мы получили 9-субъединичные олигомеры, характерные для белков этого класса. В рамках проекта мы решим 3D структуру малой субъединицы терминазы бактериофага G18. Также мы экспериментально определим pac-сайт (сайт инициации упаковки) для малой субъединицы терминазы в геноме бактериофага G18. Наконец, мы проведем структурно-функциональную характеристику малой субъединицы терминазы в комплексе с pac-сайтом. Структурная информация о компонентах мотора упаковки ДНК бесхвостых бактериофагов практически отсутствует. Недавняя асимметричная реконструкция капсида бесхвостого бактериофага PRD1 (с разрешением 12А) показала, что входящая в аппарат упаковки ДНК АТФаза формирует 12-мерные олигомеры. Ограниченная растворимость и стабильность FtsK-подобной АТФазы (белка P9) и других белков, участвующих в упаковке ДНК, например, терминального белка Р8, бактериофага PRD1 не позволяет закристаллизовать их и решить 3D-структуру. Единственная доступная информация о 3D-структуре компонентов мотора упаковки ДНК бесхвостых вирусов относится к FtsK-подобным АТФазам, а именно далекому гомологу белка Р9 - белку B204 из вируса STIV2. В рамках проекта мы решим 3D-структуру АТФазы, входящей в состав аппарата упаковки ДНК бактериофага phiKo, а также экспериментально определим другие компоненты мотора, в том числе терминальный белок. После этого мы охарактеризуем комплекс терминального белка с сайтами связывания на концах геномной ДНК бактериофага phiKo. Нет сомнений в том, что полученные в рамках реализации проекта результаты будут новыми и оригинальными и будут иметь принципиальное значение для понимания структурно-функциональной организации терминальных комплексов аппарата упаковки ДНК вирусов. Кроме этого, очевидно большое значение предполагаемых результатов для развития биотехнологии и медицины, например, для направленной доставки нуклеиновых кислот вирусными терминальными белками.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение первого года выполнения проекта была проведена наиболее рутинная часть работы. Были созданы конструкции для экспрессии малой субъединицы терминазы бактериофага G18 и моторной АТФазы бактериофага phiKo в виде слитых с N-концевым 6*His-тагом и N-концевым SUMO-тагом. После этого были подобраны условия экспрессии и очистки этих белков и получены препараты с чистотой >99%. Для очищенных белков были опробованы условия кристаллизации и для 6 кристаллов малой субъединицы терминазы бактериофага G18 собраны наборы данных на синхротроне Diamond. Также был определен сайт инициации упаковки для малой субъединицы терминазы бактериофага G18 методом СHIP-seq. Кроме этого, при помощи недавно разработанного алгоритма PhageTerm был определен конец геномной ДНК бактериофага G18, формируемый в результате нуклеазного раскуса, вносимого терминазой, он соответствует позиции 27296. Наконец, для моторной АТФазы бактериофага phiKo получены высокоспецифичные антитела, которые будут использованы для поиска компонентов терминального комплекса бактериофага phiKo методом ко-иммунопреципитации.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В течение второго года выполнения проекта были завершены работы по большей части задач. Были подобраны условия кристаллизации малой субъединицы терминазы бактериофага G18 и моторной АТФазы бактериофага phiKo и впоследствии решены их 3D структуры. Были созданы альтернативные экспериментальные модели для подтверждения сайта инициации упаковки для малой субъединицы терминазы бактериофага G18, одна из которых основана на близком родстве бактериофагов G18 и phiFa. Для бактериофага phiFa предложена модель упаковки геномной ДНК в капсид. Подтверждение этой модели позволило пересмотреть организацию его генома, что в свою очередь объяснило наблюдаемые в экспериментах особенности процесса адаптации CRISPR систем III типа. Результаты этой работы опубликованы. Охарактеризован профиль экспрессии моторной АТФазы бактериофага phiKo во время инфекции, проведены эксперименты по ко-иммунопреципитации связанных с ней белков. Результаты работы представлены на конференции FEMS Congress 2019.

 

Публикации

1. Артамонова Дарья, Карнеева Карина, Медведева Софья, Климук Евгений, Колесник Матвей, Северинов Константин Spacer acquisition by Type III CRISPR-Cas system during bacteriophage infection of Thermus thermophilus Nucleic Acids Research, - (год публикации - 2020).