КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-74-00120

НазваниеНовые длинные некодирующие РНК - потенциальные биомаркеры для диагностики рака печени

РуководительБуренина Ольга Юрьевна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2020 

Конкурс№29 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаДлинные некодирующие РНК, биомаркеры, гепатоклеточная карцинома, рак печени

Код ГРНТИ34.15.25

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Данный проект направлен на идентификацию и изучение свойств ранее не описанных длинных некодирующих РНК (днРНК), ассоциированных с раком печени, в частности с гепатоклеточной карциномой (ГКК) и детской гепатобластомой (ГБЛ). Эти онкологические заболевания характеризуются отсутствием выраженной симптоматики, поэтому часто диагностируются уже на поздних стадиях, когда лечение малоэффективно. Используемые в клинической практике белковые маркеры, например, альфа-фетопротеин (АФП), имеют низкую чувствительность и специфичность. Таким образом поиск принципиально новых биомаркеров является актуальной задачей для исследования. Длинные некодирующие РНК – обширный класс регуляторных молекул, выполняющих различные функции в клетке. Последние исследования свидетельствуют о крайне важной роли днРНК при онкогенезе. На сегодняшний день известно около 40 днРНК, ассоциированных с раком печени, однако механизмы их функционирования малоизучены. Тем не менее, простота детекции и измерения концентрации днРНК с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени позволяет использовать их в качестве диагностических маркеров. При этом многие днРНК циркулируют в организме человека внутри внеклеточных везикул вместе с биологическими жидкостями, и их определение не сопряжено с дорогостоящими и высокоинвазивными процедурами. Ранее мы провели предварительный биоинформатический поиск днРНК с измененной экспрессией при ГКК, и выбрали наиболее перспективных кандидатов для дальнейшего изучения. В настоящей работе планируется верифицировать полученные результаты и провести характеристический анализ главной днРНК-мишени и ее потенциального гомолога в мыши; выяснить, участвует ли она в пролиферации гепатоцитов, и определить ее возможных белковых партнеров. Для оценки диагностического потенциала данной днРНК будут определены уровни ее экспрессии в образцах печени пациентов с ГКК и ГБЛ.

Ожидаемые результаты
В ходе реализации данного проекта будет идентифицирована и охарактеризована новая, ранее не изученная, днРНК человека, и ее потенциальный гомолог в мыши. По предварительным данным эта днРНК активно экспрессируется в печени человека, однако ее концентрация существенно падает при развитии ГКК. При этом в других тканях и органах эта РНК практически не детектируется. Мы планируем проверить эти данные и количественно оценить содержание днРНК в различных клеточных линиях (ГКК и условной нормы гепатоцитов) и в печени человека и мыши, а также определить ее тканеспецифичность. Мы ожидаем подтверждения факта дерегуляции экспрессии днРНК при канцерогенезе, и планируем провести статистический анализ и определить ее концентрацию в образцах печени пациентов с ГКК и ГБЛ (по сравнению с нормой). В ходе проведенных исследований будет сделан вывод о возможностях использования этой молекулы в качестве диагностического маркера. Эксперименты in vitro по нокдауну исследуемой днРНК-мишени и, напротив, ее индуцируемой суперэкпрессии в клеточных линиях, позволят ответить на вопрос, является ли она важной для инвазивной и миграционной активности гепатоцитов и их пролиферации. Определение белковых партнеров методом «РНК-pull-down» позволит предположить вероятные механизмы функционирования этой днРНК, и определить дальнейшую стратегию исследования. Таким образом, мы ожидаем, что в результате реализации настоящего проекта будет открыта новая печень-специфичная днРНК, потенциально обладающая онкосупрессорными свойствами, и оценена возможность ее использования в качестве диагностического биомаркера ГКК и ГБЛ.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Многие длинные некодирующие РНК (днРНК) принимают активное участие в процессах канцерогенеза и потому рассматриваются как потенциальные биомаркеры. В данной работе была впервые охарактеризована новая печень-специфичная днРНК человека и подтверждена ее экспрессия в здоровой донорской печени. Установлено, что данная днРНК синтезируется в дифференцированных клетках условной нормы печени HepaRG и полностью отсутствует в раковых клеточных линиях печени HepG2 и Huh7. Этот факт позволяет использовать эти линии для суперэкспрессии днРНК и последующего изучения её биологической роли. На данном этапе работы получены соответствующие генетические конструкции – векторы для интеграции в эукариотический геном. Также проведен биоинформатический поиск вероятных гомологов данной днРНК в различных млекопитающих и проанализированы образцы общей РНК, выделенных из печени мыши, голого землекопа и домашней свиньи. Однако, ни в одной из животных моделей не было детектировано предполагаемой днРНК. Для оценки возможности использования днРНК в качестве потенциального биомаркера для диагностики рака печени были проанализированы препараты общей РНК, выделенные из образцов гепатоцеллюлярной карциномы и гепатобластомы человека. Во всех случаях наблюдалось существенное снижение уровня экспрессии днРНК в опухолях по сравнению с прилегающими условно нормальными тканями, что наглядно демонстрирует диагностический потенциал этой молекулы.

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе выполнения проекта было продолжено изучение свойств и функций новой длинной некодирующей РНК (днРНК) HELIS (от англ. «HEalthy LIver Specific»). Были выведены стабильные клеточные линии для суперэкcпрессии HELIS и обнаружены их фенотипические отличия от исходных клеток дикого типа, в частности снижение скорости миграции клеток. Также установлено, что эффективность индуцируемой экспрессии HELIS зависит от корректного сплайсинга этой днРНК. Разработан протокол детекции HELIS в полученных клеточных линиях методом Нозерн-блоттинга с использованием DIG-меченных зондов. На основании предполагаемой вторичной структуры HELIS осуществлён дизайн и синтез антисмысловых олигонуклеотидов (ASO), оптимизированы условия нокдауна HELIS в клетках HepaRG и продемонстрировано влияние этой днРНК на процессы дифференциации данной клеточной культуры. Методом РНК-FISH впервые установлена клеточная локализация HELIS в субъядерных структурах как клеток HepaRG, так и в трансгенных линях Huh7и HepG2 с суперэспрессией HELIS. Оценен диагностический потенциал HELIS на выборке из 77 пар образцов (норма/опухоль) печени пациентов. Впервые показано, что HELIS по-разному экспрессируется при канцерогенезе различной этиологии. Установлена достоверная корреляция уровня экспрессии HELIS со степенью дифференцировки опухоли и ее размерами. На основании полученных результатов для HELIS и трех ранее описанных днРНК предложена потенциальная диагностическая панель, позволяющая дифференцировать доброкачественные и злокачественные новообразования в печени.

 

Публикации

1. Буренина О.Ю., Зацепин Т.С., Ким Э.Ф., Метелин А.В., Скворцов Д.А., Рубцова М.П., Донцова О.А. Сравнительный анализ экспрессии генов длинных некодирующих РНК в клеточных культурах гепатоцитов и печени человека Доклады Российской Академии наук. Науки о жизни, - (год публикации - 2020)

2. Буренина О.Ю., Лазаревич Н.Л., Кустова И.Ф., Шавочкина Д.А., Мороз Е.А., Кудашкин Н.Е., Патютко Ю.И., Метелин А.В., Ким Э.Ф., Скворцов Д.А., Зацепин Т.С., Рубцова М.П., Донцова О.А. Panel of potential lncRNA biomarkers can distinguish various types of liver malignant and benign tumors Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, - (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1007/s00432-020-03378-5

3. Буренина О.Ю.,Лазаревич Н.Л., Кустова И.Ф., Шавочкина Д.А., Мороз Е.А., Кудашкин Н.Е., Патютко Ю.И., Метелин А.В., Ким Э.Ф., Скворцов Д.А., Зацепин Т.С., Рубцова М.П., Донцова О.А. Panel of potential lncRNA biomarkers can distinguish various types of liver malignant and benign tumors Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, - (год публикации - 2020)

4. Буренина О.Ю., Лазаревич Н.Л., Зацепин Т.С., Рубцова М.П., Донцова О.А. Novel long non-coding RNA as a potential biomarker of liver cancer FEBS Open Bio, V. 9 (Suppl. 1). P. 40. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12674

5. Буренина О.Ю., Лазаревич Н.Л., Зацепин Т.С., Рубцова М.П., Донцова О.А. Новая длинная некодирующая РНК – потенциальный биомаркер рака печени Acta Naturae, Спецвыпуск. Т. 2. С. 18-19. (год публикации - 2019)

6. Буренина О.Ю., Лазаревич Н.Л., Зацепин Т.С., Рубцова М.П., Донцова О.А. Новая длинная некодирующая РНК HELIS – потенциальный биомаркер нормальных гепатоцитов человека Гены и клетки, Т. 14. С.43-44. (год публикации - 2019)

Возможность практического использования результатов
не указано