Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Исследования, проведенные с беспозвоночными в ходе последних двадцати лет, показали, что внутренние среды организма ракообразных (гемолимфа, межклеточная среда гепатопанкреаса и др.) в норме не всегда являются стерильными. У многих организмов данные ткани могут быть обильно заселены различными микроорганизмами. При этом, обилие микроорганизмов в ракообразных не зависит от наличия или отсутствия каких-либо патологических процессов [Wang, Wang, 2015] и зачастую связано с выраженными симбиотическими отношениями. При этом, при помещении организма – хозяина в стрессовые для него условия, некоторые группы условно патогенных микроорганизмов могут активироваться и проявлять свои паразитические свойства. Таким образом, микробиом животных и обсемененность различных тканей ракообразных микроорганизмами является фактором, который необходимо учитывать при предсказании воздействия негативных условий среды на ракообразных. Вместе с тем, большое число симбионтных микроорганизмов зачастую выступает продуцентами новых природных соединений и является перспективным источником для биотехнологии и биомедицины. В ходе настоящего исследования проведены исследовательские и научно – поисковые работы, направленные на анализ разнообразия микроорганизмов, населяющих различные ткани ракообразных. Рассмотрены некоторые защитные механизмы ракообразных в ответ на моделируемое загрязнение экосистемы антибиотиками. Впервые рассмотрены вопросы взаимодействия микрофлоры гемолимфы с иммунной системой байкальских эндемичных амфипод и изучена реакция первичной клеточной культуры гемоцитов в ответ на внесение в гемолимфу ракообразных микроорганизмов. В ходе проводимых работ проведены исследования с бактериями, принадлежащими филе актинобактерии и проведены работы, направленные на оценку разнообразия генов вторичного метаболизма. Проведена оценка состава природных соединений, циркулируемых во внутренних средах ракообразных, и выполнен ряд подготовительных работ для исследований, запланированных к реализации в ходе второго года проекта. При тестируемых условиях среди культивируемой микробиоты доминантными группами выступали представители рода Pseudomonas sp. Данная группа микроорганизмов доминировала как на покровах амфипод, так и в гемолимфе. В рамках данного этапа исследования выделены штаммы Pseudomonas sp. (предположительно Pseudomonas frederiksbergensis DSM (13022T HAM), примечательны своими фенантренредуцирующими свойствами), доминирующие среди проанализированных образцов для оценки иммунной реакции амфипод. Анализ, проведенный посредством метода первичных клеточных культур, выявил, что у амфипод не происходит активации клеточного иммунитета, что выражается в отсутствии агрегации гемоцитов. Ввиду особой значимости актинобактерий в биотехнологии и биомедицине и их предполагаемой экологической значимости в жизнедеятельности байкальских эндемичных амфипод, проведены целевые работы, направленные на поиск и выделение актинобактерий и оценку заселенности тканей амфипод актинобактериями. Работы проведены с представителями двух крупных видов амфипод A. lappaceus longispinus и P. puzylii puzyllii. Выполнены множественные диссекции амфипод в асептических условиях и получены образцы головы (гепатопанкреаса) – проксимального отдела ЖКТ, уросомы, дорсальной поверхности тела с прикрепленной к ней мышцей, желудочно – кишечного тракта, вентральной поверхности тела. Данный блок исследований был направлен на селективное выделение актинобактерий и оценку распределения данной группы микроорганизмов. В ходе проведенных работ показано, что амфиподы вида A. lappaceus longispinus значительно более обсеменены актинобактериями, чем представители P. puzylii puzyllii. Вместе с тем, впервые проведены работы, характеризующие влияние антибиотика стрептомицина на некоторые физиологические и биохимические показатели стресс-ответа у амфипод вида E. verrucosus. Содержание амфипод в растворе антибиотика приводила к постепенному снижению содержания стрессовых белков и повышению активности фермента глутатион S-трансферазы. Важно отметить, что экспозиция в растворе стрептомицина в течение 6ти часов вела к активации процессов молекулярной детоксикации, которые продолжались не менее чем шестикратный период времени и восстановления организма до контрольных показателей за это время не происходило. В то же время, инъекция антибиотика в кровеносный сосуд не приводила к изменению содержания стрессовых белков. Таким образом, исследование проводится в соответствии с календарным планом. Часть материалов направлена к публикации в научные журналы. К настоящему времени обнаружены и сформированы новые для направления исследований, требующие рассмотрения и проработки в ходе будущих исследований и разработок.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Работы второго года проекта были направлены на углубленный анализ материалов исследований, проводимых в первый год, верификацию проведенных анализов и реализацию исследовательского плана. Так, продолжены работы по масс-спектрометрической оценке состава низкомолекулярных природных соединений, циркулирующих в гемолимфе и недифференцированных тканях байкальских эндемичных амфипод видов Eulimnogammarus cyaneus и E. verrucosus. Анализ состава низкомолекулярных природных соединений проводили с использованием методов высокоэффективной и ультра-высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографических системах UPLC Ultimate 3000 (Dionex, США) с масс-спектрометрическим детектором типа орбитальная ловушка (орбитрэп) Thermo Fisher Scientific LTQ-XL, а также с применением аналитической системы жидкостной хроматографии с масс-селективным высокоскоростным детектором Shimadzu -8060 Triple Quad. В ходе масс-спектрометрического анализа было установлено, что амфиподы изучаемых видов – E. cyaneus и E. verrucosus обладают схожим составом низкомолекулярных природных соединений. Анализ сходства обнаруженных масс с природными соединениями, зарегистрированными в базе данных «Dictionary of natural products», указывает на высокое сходство некоторых соединений с половыми ферромонами насекомых и антиоксидантов. Последние, по – видимому, амфиподы получают с пищей. В то же время, в составе экстракта амфипод вида E. verrucosus были обнаружены природные соединения, характерные для бурых водорослей. В составе экстрактов обнаружены фрагменты природных соединений, соответствующие Флороглюцинолу, который является обязательным фрагментом веществ, относящимся к классу Флоротаннинов. Данные молекулы известны своими антиоксидантными и защитными свойствами от ультрафиолетового повреждения. Посредством анализа фрагментации молекул было установлено, что в составе экстрактов амфипод присутствует соединение 4'-Бромэкол (ММ 448,9786 Да). Это связано в составом кормовой смеси, потребляемой амфиподами в естественной среде обитания. В то же, время, согласно предварительным данным, зеленые эндемичные водоросли литоральной зоны озера Байкал синтезируют данные природные соединения в концентрациях, сопоставимых с иными бурыми водорослями (проверено на примере Draparnaldioides baikalensis). Вместе с тем, в ходе реализации проекта проведено исследование антибактериальной активности гемолимфы амфипод вида E. verrucosus и проведена визуализация белков гемолимфы и антимикробных пептидов гемоцитов с использованием одномерного электрофореза. Проведены работы, направленные на оценку локализации антимикробных пептидов. При изучении антимикробной активности нативной гемолимфы установлено, что наиболее выраженная ингибирующая активность отмечалась против грамотрицательных бактерий E. coli и микроскопических грибов S. cerevisiae. Активность гемолимфы против штаммов K. rhizophila, C. glabrata отмечалась достаточно низкой, тогда как активности против штаммов P. putida, B. subtilis и S. carnosus не отмечали вовсе. Для индукции синтеза антимикробных пептидов гемоцитами проведена оценка реакции гемоцитов на присутствие иных, в т.ч. и условно-патогенных для амфипод микроорганизмов. Установлено, что экспозиция гемоцитов совместно с чужеродными микроорганизмами не приводила к индукции синтеза белков, обнаруженных ранее в плазме. На организменном уровне в ходе проводимых экспериментов, длительностью 24 часа, активации синтеза антимикробных пептидов также не отмечали, что проявлялось в отсутствии увеличения зоны ингибирования роста микроорганизмов растворами гемолимфы. В рамках проводимых исследований выполнен анализ природных соединений актинобактерий, культивируемых в питательных средах, содержащих в своем составе 1% высушенных и гомогенизированных амфипод. Установлено, что из 15 испытанных штаммов только 2 штамма, культивируемых на среде, содержащей добавку из амфипод, синтезировали дополнительные природные соединения. Такими штаммами выступили Streptomyces sp. IB2019A327-22 и Amicolatopsis sp. IB2018A129-1. Культивирование на питательной среде SM17, содержащей добавку из сухих амфипод, приводило к синтезу штаммом Streptomyces sp. IB2019A327-22 липофильного (время удерживания 18,2 мин.) природного соединения с m/z 745,2256. В то же время штамм Amicolatopsis sp. IB2018A129-1 синтезировал 3 природных соединения с m/z 215,2980 (время удерживания – 11.75 мин.), m/z 487,1121 (время удерживания – 13,8 мин.), m/z 476,7664 (время удерживания – 16.22 мин.). Примечательно, что данные соединения не проявляют схожести с природными соединениями, зарегистрированными в крупнейшей базе данных природных соединений Dictionary of Natural Products (CRC - press). Представляется значимым отметить, что ни один из проверенных штаммов не проявил способности к синтезу антимикробных природных соединений при культивировании в питательной среде, содержащей экстракт амфипод. Это может быть связано как с отсутствием симбиотической связи актинобактерий с изучаемыми амфиподами, так и с наличием роли актинобактерий, не связанной с синтезом антимикробных природных соединений для организмов, из которых они были выделены. В рамках исследований, направленных на разработку новых подходов по селективному выделению актинобактерий и иных симбионтных микроорганизмов, на примере амфипод вида E. verrucosus проведены работы по выделению симбионтных штаммов. Установлено, что состав газовой среды термостата оказывает бо'льший эффект, чем состав питательной среды, в которой происходит выделение чистых культур микроорганизмов. По многолетним наблюдениям установлено, у амфипод прослеживается связь с актинобактериями рода Rhododoccus sp. и Pseudomonas frederiksbergensis. Принимая во внимание участие данных микроорганизмов в процессах разложения труднодеградируемых загрязнителей, присутствующих в том числе и в зоне пробоотборов, данные бактерии, по- видимому, способствуют поддержанию жизнедеятельности амфипод и защите их от негативного воздействия токсикантов, присутствующих в окружающей среде.