Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Поскольку настоящий проект предполагает работу по трем независимым направлениям, результаты выполнения проекта на первом году также приведены отдельно по каждому из них. Направление 1. «Расширение палитры красителей, пригодных для использования в системе флуоресцентного мечения, с использованием мутантных форм лигазы липоевой кислоты». Было выбрано семь аминокислотных остатков в последовательности липоат-лигазы (LplA) дикого типа, формирующих субстрат-связывающий “карман” фермента. Была создана и верифицирована библиотека мутантных форм LplA с заменами этих семи аминокислотных остатков, образующих «карман», связывающий субстраты по принципу «все на все». Создано четыре новых возможных субстрата (в количестве по 500 мг каждого) и наработано достаточное количество субстратов сравнения (кумаринового и резоруфинового, в количестве по ~500 мг каждого). Изучены оптические свойства новых веществ. Все полученные субстраты переведены в защищенную (ацетоксиметилированную) форму. На полученной выборке веществ и описанных в литературе мутантных формах LplA отработана система in vitro тестирования. Начата работа по синтезу расширенной группы субстратов. Результат исследования возможности введения линкерного заместителя в различные красители опубликован в журнале Tetrahedron Letters. Направление 2. «Создание новых пар флуороген/флуороген-активирующий белок на основе хромофоров флуоресцентных белков и белков NanoLuc и Y-FAST». Проведено первичное тестирование библиотеки потенциальных флуорогенов на белках Y-FAST и NanoLuc, иммобилизованных на аффинном сорбенте. Всего в тестировании было использовано 64 вещества из имеющейся библиотеки. Был проведен анализ полученных данных и показано, что ряд соединений из библиотеки проявляет значимое увеличение флуоресценции при взаимодействии с белком Y-FAST, но ни один из них не дает разгорания с белком NanoLuc. Структура соединений проявляющих разгорание с белком Y-FAST проанализирована, в результате чего сделаны выводы о наличие закономерностей между активностью и строением субстратов. На основе этих выводов предложены и синтезированы новые флуорогены для белка Y-FAST в количестве 30 штук. Для белка NanoLuc создано 24 новых потенциальных флуорогена имеющих структуру близкую структуре оригинального люциферина. Для всех новых соединений изучены оптические свойства. Новая партия флуорогенов также протестирована на белках, иммобилизованных на аффинном сорбенте. В результате выявлена еще большая группа веществ потенциальных флуорогенов для белка Y-FAST, а флуорогенов для белка NanoLuc по-прежнему не найдено. Все выявленные вещества, демонстрирующие высокую флуорогенность в отношении белка Y-FAST дополнительно изучены на «пустых» клеточных культурах, не экспрессирующих белок, что позволило отбросить соединения, демонстрирующие нецелевое окрашивание и окончательно сформировать круг потенциальных флуорогенов для более подробного изучения на втором году. Выводы о взаимосвязи между строением и оптическими свойствами различных производных хромофоров флуоресцентных белков, полученные в ходе работ по данному направлению опубликованы в журнале Chemical Сommunications. Направление 3. «Создание новых специфических низкомолекулярных сенсоров, обладающих выраженной флуорогенностью». Проведен синтез набора соединений, являющихся потенциальными флуоресцентными сенсорами с выраженной флуорогенностью, а именно создан набор потенциальных «сенсоров полярности» (два десятка веществ) и набор веществ, необратимо реагирующих с различными аналитами (6 штук). Изучены оптические свойства всех созданных веществ. Поведение полученных «сенсоров полярности» изучено на клеточных культурах, показано, что некоторые из них могут быть использован для селективного окрашивания клеточных органелл. Поведение веществ, реагирующих с аналитами изучено in vitro. Анализ полученных данных позволяет сделать выводы о взаимосвязи структура-свойства, предложить направления модификации созданных соединений и определить прочие перспективы и направления дальнейших исследований. В ходе работ выявлена серия веществ, которые могут быть использованы для селективного флуоресцентного окрашивания митохондрий или эндоплазматического ретикулума. Более подробное изучение этого феномена запланировано на второй год. Выводы о перспективности использования фотокислотных производных в роли сенсоров полярности, полученные в ходе работ по данному направлению опубликованы в журнале Journal of Phisical Chemistry B.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Поскольку настоящий проект состоит из трех независимых частей, результаты выполнения проекта на втором году также приведены отдельно по каждой из них. Часть 1. «Расширение палитры красителей, пригодных для использования в системе флуоресцентного мечения, с использованием мутантных форм лигазы липоевой кислоты». Был проведен синтез потенциальных субстратов мутантных форм лигазы липоевой кислоты (всего более 25 веществ за два года). Были изучены свойства полученных веществ. Проведен отбор функциональных вариантов лигаз LplA из библиотеки репрезентативностью около 100 000 индивидуальных клонов на предмет переноса на полипептидный субстрат четырех флуорофоров. Было проведено два раунда отбора с подтвержденной степенью обогащения до 6 раз, что свидетельствует об эффективности проводимой селекции. Помимо отбора функциональных лигаз LplA, способных акцептировать новые функционализированные производные липоевой кислоты, из библиотеки ее мутантных форм был осуществлен поиск пар «мутантная форма LplA-субстрат» с помощью молекулярно-динамического моделирования. На 16500 сгенерированных мутантов получено 8746 уникальных последовательностей. На основе данных молекулярно-динамического моделирования были получены генетические конструкции, кодирующие пять самых «перспективных» вариантов Lpla методом последовательного сайт-специфического мутагенеза. Полученные данные свидетельствуют, что полученные липоат-лигазы с недостаточной эффективностью акцептируют в качестве субстрата новые производные липоевой кислоты. Наиболее разумное объяснение состоит в слишком сильном связывании исходного субстрата с лигазой, что мешает корректному удалению продукта в ходе модификации. В дальнейшем будет проведена оптимизации данного подхода для увеличения каталитической эффективности отбираемых вариантов лигазы LplA. Часть 2. «Создание новых пар флуороген/флуороген-активирующий белок на основе хромофоров флуоресцентных белков и белков NanoLuc и FAST». Для белка FAST. Исходя из результатов полученных на первом году выполнения проекта, был предложен набор новых перспективных флуорогенов. При этом основной упор был направлен на создание библиотеки веществ с максимальным разнообразием окраски, в том числе создании веществ, обладающих длинноволновыми положениями максимумов абсорбции и эмиссии. Был проведен синтез расширенной библиотеки веществ и скрининг их взаимодействия с белком. В результате был отобран набор кандидатов, демонстрирующих заметное разгорание. Все выявленные вещества, демонстрирующие высокую флуорогенность, были дополнительно изучены на «пустых» клеточных культурах, не экспрессирующих белок FAST. Также было проведено тестирование наиболее перспективных кандидатов на генно-инженерных конструкциях FAST. Предложенные пары были всесторонне изучены с использованием препаратов выделенных белков. Были определены константы связывания, положения максимумов эмиссии и абсорбции, квантовые выходы в свободном и связанном состоянии. В результате этих работ нами выявлена серия веществ, флуоресценция которых заметно увеличивается при взаимодействии с белком FAST, которые в паре с ним могут быть использованы для создании генетически-кодируемых меток. Созданный нами ряд характеризуется заметным цветовым разнообразием - максимумы эмиссии от 510 до 660 нм. Один из флуорогенов был изучен более подробно. Были окрашены более сложные генетически конструкции, изучен фотобличинг комплекса и доказана обратимость связывания. Результат опубликован в журнале Chemistry- A European Journal. Для белка NanoLuc. Исходя из результатов полученных на первом году выполнения проекта, нами был предложен набор новых потенциальных флуорогенов. Был проведен синтез нового набора веществ и скрининг их взаимодействия с белком. Вещества, демонстрирующие высокую флуорогенность, были дополнительно изучены на «пустых» клеточных культурах, не экспрессирующих белок. Предложенные пары были всесторонне изучены с использованием препаратов выделенных белков. Были определены константы связывания, положения максимумов эмиссии и абсорбции, квантовые выходы в свободном и связанном состоянии. В результате были найдены флуорогены, демонстрирующие умеренное разгорание с белком NanoLuc и выявлены взаимосвязи между строением и свойствами. Работы по поиску эффективных флуорогенов будут продолжен на третьем году. Часть 3. «Создание новых специфических низкомолекулярных сенсоров, обладающих выраженной флуорогенностью». Исходя из результатов первого года, был предложен и синтезирован расширенный круг флуорогенных веществ. Были изучены оптические свойства полученных веществ. Полученные «сенсоры полярности» были изучены на клеточных культурах, а поведение прочих веществ под действием аналитов было изучено in vitro. Анализ полученных данных позволил выявить наиболее перспективные кандидаты на роль новых сенсоров или предложить новые структуры для синтеза на третьем году. Вещества, продемонстрировавшие высокую селективность во флуоресцентном мечении, были более подробно изучены, в частности было проведено сравнение с существующими селективными красителями. Был выявлен один краситель пригодный для селективного и потенциал-независимого окрашивания митохондрий и два красителя селективных в отношении ЭПР. Показано, что предложенные сенсоры на аналиты из-за низкой чувствительности не могут быть использованы в живых системах. Результаты этого исследования были опубликованы в журнале Dyes and Pigments. Некоторые выводы о возможном использовании производных хромофора GFP в роли красителей чувствительных к окружающей среде за счет возможного переноса протона в возбужденном состоянии также были опубликованы в журнале Journal of chemical physics.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Поскольку настоящий проект состоит из трех независимых частей, результаты выполнения проекта также приведены отдельно по каждой из них Часть 1. «Расширение палитры красителей, пригодных для использования в системе флуоресцентного мечения, с использованием мутантных форм лигазы липоевой кислоты». В связи с избыточной репрезентативностью ранее полученной библиотеки липоат-лигаз в ходе работ третьего года нами была de novo создана альтернативная библиотека, в которой замены аминокислот в субстратсвязывающем «кармане» производились только на три аминокислоты – аланин, валин и глицин. На данной библиотеке также был проведен отбор методом проточной цитометрии. Были отбораны дважды позитивные клетки, достоверно несущие как представителей библиотеки, так и полипептидный субстрат, содержащий последовательность LAP, ковалентно связанную с флуорофором. Два проведенных раунда селекции подтверждают правильность положений для замен, а также выбор аминокислотных остатков, так как количество положительных окрашенных клонов возрастает на порядок на каждом цикле. Таким образом, выявлены варианты липоат-лигазы, способные ковалентно присоединять синтетические флуорофоры к 13-членной аминокислотной последовательности-мишени. Однако дальнейшие исследования показали, что исследуемые лигазы имеют тенденцию к спонтанному захвату субстрата даже в отсутствии АТФ, а потому не могут быть использованы для эффективного ферментативного мечения, так как будут давать нецелевой сигнал ассоциированный с лигазами. Часть 2. «Создание новых пар флуороген/флуороген-активирующий белок на основе хромофоров флуоресцентных белков и белков NanoLuc и FAST». Для белка FAST: Создана серия флуорогенов для белка FAST, характеризующихся разнообразной окраской. Показано, что они могут быть использованы для генетически-кодируемого флуоресцентного мечения живых систем. Поиск флуорогенов осуществлен с помощью «химического мутагенеза», когда новые пары белок:флуороген выявляются не с помощью мутагенеза белка, а с помощью скринирования больших библиотек соединений. Предлагаемый нами подход позволяет использовать один и тот же белок для мечения самыми разными цветами. Созданная нами линейка веществ позволяет равноэффективно проводить мечение, подходящее для самых разных фильтров, при использовании одной и той же генетической конструкции. Предложенный нами пары могут быть использованы в самых разных исследованиях. Методом ЯМР впервые определена структура флуороген-активирующего белка FAST как свободном виде, так и в виде комплекса с лигандом. Определено строение кармана и ключевые взаимодействия, отвечающие за связывание. Обнаружено, что при связывании с лигандом происходит существенно изменение строение белка, а именно структуризация его N-концевой части. Опираясь на это знание, мы решили сократить белок FAST на 26 аминокислотных остатков, нашли подходящий лиганд и, таким образом, создали самую короткую генетически кодируемую флуороген активирующую метку – белок nanoFAST, содержащий всего 98 аминокислот и подходящий для флуоресцентной микроскопии. Данный результат может стать основой для прорыва в технологиях генетически-кодируемого флуоресцентного мечения. Показано, что для мечения с использованием FAST могут быть использованы и другие гетероциклы, нежели упомянутые ранее роданины и имидазолоны. Результат работ опубликован: Mineev K.S. et al NanoFAST: structure-based design of a small fluorogen-activating protein with only 98 amino acids // Chem. Sci., 2021, Advance Article Sokolov, A.I., Myasnyanko, I.N., Baleeva, N.S., Baranov M. S. Styrene Derivatives of Indole and Pyranone as Fluorogenic Substrates for FAST Protein. // Russ J Bioorg Chem, 2021, 47, 334–337 Для белка NanoLuc: Исходя из результатов, полученных на первых двух годах выполнения проекта, был предложен набор новых потенциальных флуорогенов, проведен их синтез и скрининг на выделенном белке. Выявлено несколько веществ, чья флуоресценция усиливается в 20-70 раз при взаимодействии с белком. Однако все созданные вещества демонстрировали заметное нецелевое окрашивание в живых клетках. Таким образом, созданные нами флуорогены не могут быть использованы в паре с белком nanoLuc для генетически-кодируемого флуоресцентного мечения, однако могут быть потенциально использованы для каких-то работ с этим белком in vitro. Часть 3. «Создание новых специфических низкомолекулярных сенсоров, обладающих выраженной флуорогенностью». Проведен синтез дополнительной библиотеки возможных «сенсоров полярности». Изучены оптические характеристики веществ. Проведено тестирование на клеточных культурах. Выявлено два вещества, дающих селективное окрашивание эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Один из полученных красителей показал очень яркий и контрастный сигнал, сопоставимый по фотостабильности с флуоресцентными белками. Показано, что он может быть использован для окрашивания ЭПР в самых разных эукариотических клетках. Селективность окрашивания подтверждена с помощью эксперимента по совместной локализации с коммерчески доступным ER-трекером Red. Высочайшая фотостабильность сигнала, обусловленная постоянным обменом связанного и свободного красителя, говорит о высокой перспективности использования предложенного нами флуорогена. Таким образом, все заявленные работы по всем трем частям проекта выполнены в полном объеме, достигнуты значимые результаты, соответствующие заявленному плану работ, а также опубликованы статьи в научных журналах.