Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение первого года выполнения проекта разработаны оригинальные методики синтеза поликатионных и полианионных производных пиллар[5]аренов, содержащих заряженные фрагменты с различными по природе (форма, размер и липофильность) противоионами. Оптимизированы известные методики получения поликатионных и полианионных производных п-трет-бутилтиакаликс[4]арена и диоксида кремния. Нами был предложен альтернативный способ синтеза солей щелочных металлов на основе деказамещённого пиллар[5]арена с использованием в качестве растворителя метанола, что позволило упростить выделение целевых продуктов, которые были получены с количественными выходами. Оптимизация методик аминолиза пиллар[5]арена, содержащего десять сложноэфирных групп, N,N-диэтилэтан-1,2-диамином и N,N-диметилпропан-1,3-диамином, а именно увеличение соотношения эфир:амин до 1:3 позволила увеличить выходы целевых продуктов до 80%. Эти соединения были использованы как прекурсоры в синтезе водорастворимых водорастворимых пиллар[5]аренов, содержащих аммонийные фрагменты. Впервые проведена модификация наночастиц SiO2 (12 нм) 1,3-пропансультоном и 3-аминопропилтриэтоксисиланом и синтезированы наночастицы, содержащие амино- и сульфогруппы, структура, состав и индивидуальность которых подтверждены методами ЯМР 1Н, ИК, УФ спектроскопии, ТГ-ДСК, динамического светорассеяния. Разработаны и оптимизированы методики формирования 3D самособирающихся наноразмерных частиц с различным зарядом на поверхности на платформе полиионных производных пиллар[5]аренов, п-трет-бутилтиакаликс[4]аренов и диоксида кремния в водных средах путем комбинирования как одноименных, так и разноименных платформ посредством электростатических взаимодействий, и установлены закономерности нековалентной самоcборки путем варьирования условий самосборки (рН, концентрация растворов, структура и состав полиионных макроциклов) как в твердом виде, так и в растворе. В частности, варьирование способов получения синтезированных наночастиц диоксида кремния, модифицированных амино- и сульфогруппами, и условий проведения их взаимодействия (природы растворителя, температуры) были разработаны методики синтеза трех типов «буферных» смешанных субмикронных частиц с соответствующими ζ-потенциалами (-21.4 ± 1.3, 4.7 ± 0.4, 12.4 ± 0.8). Установлено, что эффективность адсорбции модельной ДНК (высокомолекулярной ДНК из тимуса теленка) в ряду изученных модифицированных частиц диоксида кремния увеличивается в соответствии с их дзета-потенциалами (ζ) «буферных» смешанных субмикронных частиц (4.7), аминированных наночастиц (11.3), сшитых субмикронных частиц (12.4) 6%, 10%, 28%, соответственно. Показано, что взаимодействие изученных модельных белков (БСА и лизоцима) с синтезированными наночастицами диоксида кремния, модифицированными сульфогруппами, усиливается при понижении pH среды. Предложен новый подход к конструированию самособирающихся наночастиц для распознавания биомакромолекул основанный на формировании интерполиэлектролитных смешанных систем катионных и анионных макроциклов. Так же предложен и успешно реализован подход с использованием макроциклов и диоксида кремния. Обнаружено, что в зависимости от конформации тиакаликс[4]арена (конус, 1,3-альтернат) формируются интерполиэлектролитные смешанные частицы с различным размером стабильностью и морфологией. Обнаружено различное поведение систем (изменение ζ-потенциала) в зависимости от конфигурации тиакаликсарена к разбавлению вследствие различной упаковки макроциклов в структуре интерполиэлектролитных ассоциатов. Выявлено, что поведение смешанной системы «отрицательно заряженный тиакаликсарен в конфигурации конус + положительно заряженный пиллар[5]арен» при разбавлении аналогично системе «положительно заряженный тиакаликсарен альтернат + отрицательно заряженный тиакаликсарен конус». Наблюдается уменьшение ζ-потенциала, связанное с десорбцией потенциал определяющих ионов с поверхности дисперсной фазы. Что однозначно подтверждает наше предположение об упаковке макроциклов в структуре интерполиэлектролитных ассоциатов. А именно, что отрицательно заряженный сульфотиакаликсарен в конфигурации конус составляет основу сферического интерполиэлектролитного ассоциата - обратной мицеллы. Напротив, заряженные макроциклы ориентированы вокруг обратной мицеллы за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий. В обоих случаях образуются бислойные структуры. Очевидно, что при разбавлении полиэлектролитных ассоциатов конус + конус и конус + 1,3-альтернат (тиакаликс[4]арен) с поверхности снимается несколько слоев (включая бислой). Количество удаляемых слоев зависит от конформации макроциклов, поэтому поверхностный заряд изменяется по-разному. Исследовано распознавание модельных биополимеров (ДНК из тимуса теленка, лизоцима и бычьего сывороточного альбумина) синтезированными интерполиэлектролитными частицами на основе одноименных платформ: отрицательно заряженный тиакаликсарен в конфигурации конус + положительно заряженный тиакаликсарен в конфигурации конус и положительно заряженный тиакаликсарен альтернат + отрицательно заряженный тиакаликсарен конус и проведено сравнение с исходными макроциклами. Показано, что распознавание этих биополимеров селективно и определяется типом биополимера, способностью к формированию наноассоциатов и природой (зарядом) функциональных групп на поверхности интерполиэлектролитного ассоциата.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В течение второго года выполнения проекта оптимизированы методики формирования 3D самособирающихся наноразмерных частиц и определены закономерности нековалентной самоcборки синтезированных макроциклов и функционализированного диоксида кремния при различных рН. Ранее в литературе интерполиэлектролитные ассоциаты получали только на основе полимеров. В данном проекте предложен и успешно применяется подход с использованием макроциклов и диоксида кремния. Впервые на основе наночастиц модифицированного диоксида кремния (28 нм) и карбоксилатного производного пиллар[5]арена (40 нм) разработана методика получения смешанных полиэлектролитных частиц «диоксид кремния – пиллар[5]арен» с размером около 60 нм согласно методу сканирующей электронной микроскопии, при этом стабильность коллоидной системы смешанных полиэлектролитных частиц оказалась в два раза выше по сравнению с растворами компонентов их составляющих. Согласно методам ДСР, ПЭМ и СЭМ смешанные полиэлектролитные частицы представляют собой агрегаты из модифицированного диоксида кремния, который является ядром ассоциатов, а внешний их слой образован полианионным компонентом – карбоксилатным производным пиллар[5]арена. Оценены условия самосборки интерполиэлектролитных ассоциатов «диоксид кремния – пиллар[5]арен» при различных рН (рН=1.65, рН=7.4, рН=9.18). Показано, что стабильность частиц (величина ζ-потенциала) одинакова в воде и нейтральном фосфатном буфере (0.01 M, 0.0027 KCl, 0.137 NaCl, pH 7.4), что позволило нам использовать интерполиэлектролитные ассоциаты «диоксид кремния – пиллар[5]арен» для взаимодействия с белками в условиях, близких к физиологическим. Методом УФ-спектроскопии показано, что все полученные интерполиэлектролиты «диоксид кремния – пиллар[5]арен» способны связывать лизоцим и БСА, в то время как способность к формированию стабильных коллоидных систем в присутствии биополимеров оказалась различной: аминомодифицированный диоксид кремния в водном растворе формирует ассоциаты только с БСА. Ассоциаты на основе пиллар[5]арена и смешанные полиэлектролитные наночастицы на основе двух платформ образуют стабильные коллоидные системы с лизоцимом. Взаимодействие лизоцима со всеми полиэлектролитными частицами сопровождается их координацией на поверхности частиц, о чём свидетельствует смена заряда образующихся ассоциатов по сравнению с исходными частицами. БСА связывается частицами, вероятно, за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий, причем последние играют значительную роль, способствуя образованию агрегатов относительно крупного размера, повышая, таким образом, полидисперсность системы с одновременным понижением стабильности. Полученные результаты открывают новые возможности для дизайна супрамолекулярных систем, которые могут найти применение в медицине для адресной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных соединений. Впервые на примере двух различных макроциклов - тиакаликс[4]арена и пиллар[5]арена, различающихся по количеству, типу и пространственному расположению функциональных групп, мы продемонстрировали простой метод синтеза интерполиэлектролитных агрегатов «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен». Способность этих интерполиэлектролитных агрегатов, имеющих положительно заряженную поверхность, образовывать стабильные наночастицы с ДНК из тимуса теленка была подтверждена комплексом физических методов (УФ, КД и флуоресцентная спектроскопия, ДСР и СЭМ). Варьируя соотношение агрегатов «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен» / ДНК, наибольшая компактизация ДНК была достигнута при соотношении компонентов 1:3. Для сравнения дополнительно было исследовано взаимодействие положительно заряженного пиллар[5]арена (как компонента интерполиэлектролитных ассоциатов «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен») c ДНК. СЭМ показал два типа агрегатов (полиплекс и мицеллоплекс), образованных пиллар[5]ареном и интерполиэлектролитными агрегатами «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен». Метод ДСР показал эффективную упаковку высокомолекулярной ТT-ДНК в наноразмерные агрегаты с гидродинамическим диаметром 109 и 186 нм с использованием пиллар[5]арена и агрегатов «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен» соответственно. Методом флуоресцентной спектроскопии предложен механизм взаимодействия пиллар[5]арена и агрегатов «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен» с ДНК, используя флуоресцентную метку – краситель 4,6-диамидино-2-фенилиндиол (DAPI), взаимодействующий с ДНК при невысоких соотношениях [DAPI]/[ДНК] предпочтительно связываясь с парами A−T. Увеличение концентрации красителя привело к дополнительной возможности связывания в малых бороздках по фосфатным группам ДНК. Характер связывания можно легко контролировать, регулируя соотношение красителя и биополимера. Наблюдалось смещение максимума эмиссии, которое обусловлено преимущественным связыванием как красителя, так и лиганда (пиллар[5]арена и агрегатов «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен») с фосфатными группами ДНК. Показано, что упаковка ТT-ДНК поликатионными пиллар[5]аренами и интерполиэлектролитными агрегатами «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен» сохранила вторичную структуру ДНК в своей нативной форме без искажения ее спиральности. Это важное преимущество для разработки эффективных систем биомолекулярной доставки. На основании полученных результатов мы предположили, что макроциклы, тиакаликс[4]арен и пиллар[5]арен можно рассматривать как полезные инструменты для построения ансамблей с молекулами ДНК, которые либо входят во внутреннее пространство мицеллоплекса (в случае интеролиэлектролитного агрегата «тиакаликс[4]арен-пиллар[5]арен») или расположены на их поверхности (в случае пиллар[5]арена). ДНК здесь использовалась не только как компонент наноструктурированного материала, но и как матрица для сборки наноструктур. Следовательно, мицеллы могут быть использованы в качестве матриц для сборки молекулярных наноструктур (молекулярная литография) и для биомедицинских применений. Основным применением полиплексов является банкинг ДНК - безопасное долгосрочное хранение генетического материала человека.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В течение третьего года выполнения проекта оптимизированы методики формирования 3D самособирающихся наноразмерных частиц и определены закономерности нековалентной самоcборки синтезированных макроциклов (тиакликс[4]арен и пиллар[5]арен). Ранее в литературе интерполиэлектролитные ассоциаты получали только на основе полимеров. В данном проекте предложен и успешно применяется подход с использованием макроциклов. Выявлены особенности совместной сборки макромолекулярных наноматериалов на основе фосфорсодержащих тиакаликс[4]аренов с использованием двух подходов. Используя подход «металлорганический каркас», были синтезированы новые фосфонатсодержащие наноматериалы, используя тиакаликс[4]арен и Ag+ в качестве строительных блоков. Кроме того, показано, что дисперсность систем зависит от типа терминальной функциональной группы (кислота или соль). Наличие зарядов в концевом фрагменте приводит к уменьшению монодисперсности системы и ее ζ-потенциала. Замена неорганического катиона Ag+ на органический катион (тетракисгуанидиносодержащий п-трет-бутилтиакаликс[4]арен) позволила синтезировать новые интерполиэлектролитные наноматериалы для биомедицинского применения с использованием полифункциональных заместителей макроциклических платформ. В обеих системах сформированы монодисперсные системы с частицами нанометрового размера (74 и 62 нм) с отрицательно заряженной поверхностью. Было исследовано взаимодействие двух типов интерполиэлектролитных наночастиц с модельными белками (лизоцимом, бычьим сывороточным альбумином и гемоглобином). Эти наночастицы полиэлектролита способны избирательно связывать лизоцим, сохраняя при этом конформацию белка. В будущем их способность избирательно взаимодействовать с модельными белками может привести к появлению многофункциональных систем, способных модулировать активность белков и ферментов, а также нековалентную самосборку бионаноматериалов, для создания систем адресной доставки лекарств и систем для диагностики и лечения различных заболеваний. На примере двух противоположно заряженных макроциклов (карбоксилатного и аммонийного пиллар[5]аренов), различающихся по типу функциональных групп, длине алкильного линкера, природы противоиона, мы впервые продемонстрировали возможность получения стабильных интерполиэлектролитных агрегатов нанометрового размера (до 9 нм). Было обнаружено, что сами макроциклы не собираются в системы с мономодальным размерным распределением. Тогда как при смешении противоположно заряженных макроциклов в ряде случаев при определенной концентрации и по истечении некоторого (разного для разных систем) времени образуются стабильные агрегаты. Кроме того, было выявлено влияние природы противоиона на стабильность систем. Так, при смешении аммонийного пиллар[5]арена с пропилиденовым линкером с карбоксилатными пиллар[5]аренами стабильность систем возрастает при переходе от относительно небольшого катиона натрия к три-н-бутиламмонию в качестве противоиона. Укорочение линкера с пропилиденового на этилиденовый при переходе привело к обратной картине. Монодисперсные системы образовывались в системах, где в качестве противоиона в карбоксилатном макроцикле были относительно небольшие катионы натрия и калия. Важно отметить, что поверхность агрегатов практически не имеет заряда (ζ не более 1.8 мВ для всех стабильных систем). Это говорит о том, что данные системы могут быть использованы для взаимодействия как с положительно заряженными биомолекулами (белки), так и с отрицательно заряженными молекулами ДНК. На примере одной из системы были синтезированы фотопереключаемые тройные агрегаты, стабильные в полярных растворителях. На примере двух различных макроциклов тиакаликс[4]арена и пиллар[5]арена, различающихся по количеству, типу и пространственному расположению функциональных групп, мы впервые продемонстрировали простой метод синтеза интерполиэлектролитных агрегатов и показали способность этих интерполиэлектролитных агрегатов с положительно заряженной поверхностью образовывать стабильные наночастицы с ДНК из молок лосося. Размер и структура различных комплексов были подробно охарактеризованы с помощью ДСР, КД и УФ-видимой спектроскопии. Было обнаружено, что полиплексы на основе макроцикла аммонийного пиллар[5]арена образуют крупные агрегаты с конденсированной в ядре ДНК. По сравнению с полиплексами мицеллоплексы (на основе интерполиэлектролита каликс[4]арен/пиллар[5]арен) более стабильны. Впервые мы обнаружили сходство в упаковке цепи ДНК между полиплексами и мицеллоплексами. Вторичная структура ДНК из молок лосося была изменена после упаковки из-за электростатических взаимодействий. Таким образом, эти результаты имеют перспективу при разработке системы доставки биомакромолекул в будущем. Впервые для полиэлектролитных частиц на основе сульфобетаиновых тиакаликс[4]аренов, содержащих одновременно аммонийную и сульфогруппу в конфигурация конус, частичный конус и 1,3-альтернат была оценена цитотоксичность к ряду линий клеток в тестах in vitro. При этом дополнительно исследовали данные системы в присутствии иона серебра, как наиболее агрессивной формой серебра. Были протестированы опухолевые культуры клеток М-HeLa клон 11 (эпителиоидная карцинома шейки матки, сублиния HeLa, клон M-HeLa; HuTu 80 – аденокарцинома двенадцатиперстной кишки человека; MCF-7 - аденокарцинома молочной железы человека; клетки печени человека. Цитотоксичность на раковых и нормальных клеточных линиях человека изучали в концентрациях рекомендованных для скрининга новых противоопухолевых агентов (1– 100 µМ). В ряду протестированных систем только ассоциаты на основе тиакаликсарена, в конформации частичный конус с катионом серебра избирательно действует на клеточную линию карциномы шейки матки (IC50=38.9±2.6 µM). По цитотоксической активности данный комплекс в два раза превосходит препарат сравнения иматиниба мазилат (IC50=85.1±6.4 µM). При этом его цитотоксичность против нормальных клеток печени (IC50=102±7.9 µM) незначительно отличается от известного противоопухолевого препарата (IC50=102±7.9 µM). В отношении клеточных линий MCF-7 и HuTu 80 все исследованные системы оказались не активны. Таким образом, в ходе третьего этапа было показано, что образованные путем нековалентной самосборки интерполиэлектролитные ассоциаты на основе макроциклических платформ, проявляют селективность в распознавании биополимеров, причем эта селективность обусловлена типом биополимера и зависит от природы интерполиэлектролитного ассоциата, а именно, заряда, количества, и типа функциональных групп их пространственного расположения относительно макроциклической платформы, находящихся в структуре исходного макроцикла.