Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В последнее десятилетие активно разрабатываются и внедряются в медицинскую практику системы направленной доставки и пролонгированного высвобождения лекарств на основе полимерных наночастиц. Такие системы обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными лекарственными формами: повышается биодоступность слаборастворимых в воде лекарственных соединений, за счет селективности действия снижается токсический эффект препаратов на здоровые органы и ткани, могут быть преодолены физиологические барьеры (например, гематоэнцефалический). Таким образом, терапевтическая эффективность широкого спектра препаратов может быть существенно повышена путем разработки соответствующей наносомальной лекарственной формы. Для решения этой задачи необходимо разработать методы для создания биосовместимых и биоразлагаемых наночастиц на основе сополимеров лактида с контролируемыми строением, структурой и свойствами. Варьируя строение и состав сополимеров можно управлять размерами частиц, увеличивать эффективность их загрузки лекарственным веществом, контролировать скорость их разложения и высвобождения лекарственного препарата. План выполнения проекта включает три этапа, основными объектами изучения являются биоразлагаемые сополимеры на основе лактида различного состава и молекулярной архитектуры, а также наночастицы на их основе. Первый этап проекта был посвящен синтезу статистических сополимеров лактида и гликолида, лактида и е-капролактона, отработке методов получения наночастиц на их основе с контролируемыми размерами, загрузке частиц противораковыми агентами и исследованию их цитотоксического действия. Исследована кинетика гомо- и сополимеризации D,L-лактида в расплаве в присутствии новых биосовместимых катализаторов – ацетилацетоната циркония и субсалицилата висмута. Показано, что предложенные катализаторы лишь незначительно уступают традиционному 2-этилгексаноату олова по своей активности. Построенные кинетические кривые позволили подобрать оптимальные условия реакции и синтезировать поли(D,L-лактид), а также его сополимеры с е-капролактоном (90:10 и 75:25) и гликолидом (90:10, 75:25, 70:30) со степенью конверсии до 97% и молекулярной массой от 22 до 185 кДа. Изучено влияние молекулярного состава синтезированных полимеров, метода и условий получения частиц на их размер и морфологию. Показано, что методом нанопреципитации можно варьировать средний диаметр получаемых наночастиц от 76 до 212 нм за счет изменения концентрации смешиваемых растворов. Метод двойной эмульсии позволил получить наночастицы со средним диаметром от 170 до 240 нм. С помощью комплекса современных методов исследования (атомно-силовая и электронная микроскопия, малоугловое рентгеновское рассеяние) изучена морфология наночастиц, определен радиус инерции и построены гистограммы распределения частиц по размерам. Синтезированы и охарактеризованы противораковые препараты на основе комплексов платины – оксалиплатин и цисплатин. Методами нанопреципитации и двойной эмульсии получены наносомальные лекарственные формы оксалиплатина и доцетаксела. Метод нанопреципитации оказался более эффективным для загрузки оксалиплатина в наночастицы на основе поли(D,L-лактид-со-гликолида). Исследование антипролиферативной активности полученных образцов ненагруженных наночастиц подтвердило их биосовместимость. МТТ-тесты образцов, загруженных оксалиплатином, были проведены на нескольких раковых линиях клеток и одной здоровой линии для изучения избирательности действия. Показано, что оксалиплатин в наносомальной лекарственной форме обладает в 3 раза более высоким цитотоксическим действием, чем чистый оксалиплатин, и характеризуется повышенной избирательностью действия. Коэффициент селективности вырос с 1,3 для обычного препарата оксалиплатина до 3,3 – 3,5 для наночастиц с оксалиплатином.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Последние десятилетия активно разрабатываются различные наноразмерные носители для доставки противораковых лекарственных препаратов. Большинство противораковых агентов представляют собой низкомолекулярные вещества. Вследствие этого после введения противоракового препарата в организм происходит его неселективное проникновение как в пораженные, так и здоровые клетки, что приводит к снижению эффективной дозы лекарства в целевых тканях и возрастанию общей токсичности. Использование наносомальных форм противораковых препаратов благодаря так называемому эффекту повышенной проницаемости и удерживания позволяет аккумулировать лекарственное вещество в опухолях и пораженных тканях, обеспечивая тем самым снижение обжей токсичности. Более того, инкапсулирование лекарств в частицы-носители позволяет преодолеть как низкую растворимость в воде гидрофобных лекарственных веществ, так и предотвратить преждевременное гидролитическое разложение гидрофильных лекарственных веществ, повышая тем самым их стабильность и биодоступность. В водной среде амфифильные блок-сополимеры самоорганизуются в частицы типа «ядро-корона». Гидрофобное ядро способно солюбилизировать различные молекулы, тогда как гидрофильная корона обеспечивает стабилизацию частицы. Блок-сополимерные наночастицы благодаря возможности инкапсулировать широкий ряд препаратов являются перспективными средствами доставки противораковых агентов. В зависимости от молекулярного строения блок-сополимера, типа лекарства и условий приготовления можно получать частицы-носители с регулируемыми размером, морфологией, солюбилизирующей способностью, скоростью разложения и пр. План выполнения проекта включает три этапа, каждый из которых посвящен синтезу и исследованию биосовместимых сополимеров лактида различной молекулярной структуры. На втором этапе проекта были синтезированы амфифильные блок-сополимеры лактида и этиленгликоля, ε-капролактона и этиленгликоля различного состава и строения, на их основе методами диализа, нанопреципитации и двойной эмульсии получены водные суспензии наночастиц. Комплексно исследовано влияние молекулярной структуры блок-сополимеров и метода получения наночастиц на их размер, морфологию, поверхностный заряд и солюбилизирующую способностю по отношению к противораковому агенту оксалиплатину. Исследована кинетика полимеризации с раскрытием цикла L-лактида, D,L-лактида и ε-капролактона в присутствии монофункционального макроинициатора метилового эфира поли(этиленгликоля) мПЭГ и бифункционального макроинициатора поли(этиленгликоля) ПЭГ в расплаве с использованием катализатора октоата олова. Построенные кинетические кривые позволили подобрать оптимальные условия реакции и синтезировать блок-сополимеры со степенью конверсии до 95% и молекулярной массой от 6 до 80 кДа. Показано, что методом диализа на основе двойных и тройных блок-сополимеров L-лактида и этиленгликоля могут быть получены наночастицы с частично кристаллическим поли(L-лактидным) П(L)ЛА ядром, характеризующиеся не сферической морфологией с невысоким характеристическим отношением порядка 1,1 – 1,3, размер которых не меняется при значительном увеличении длины кристаллизующегося П(L)ЛА блока (https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.langmuir.8b03379). Показано, что методом нанопреципитации могут быть получены блок-сополимерные наночастицы с регулируемым размером и кристаллической структурой ядра. Двойные блок-сополимеры этиленгликоля и D,L-лактида в воде формируют сферические частицы с аморфным поли(D,L-лактидным) П(D,L)ЛА ядром. Гидродинамический радиус таких частиц растет от 16 до 28 нм с увеличением длины П(D,L)ЛА блока от 62 до 173 мономерных звеньев. Двойные блок-сополимеры этиленгликоля и L-лактида самоорганизуются в сферические частицы с частично кристаллическим П(L)ЛА ядром, причем увеличение длины П(L)ЛА блока приводит к росту кристалличности ядра частиц. Размер полученных частиц увеличивается от 11 до 27 нм с ростом длины П(L)ЛА блока от 18 до 45 мономерных звеньев, тогда как дальнейший рост длины П(L)ЛА до 64 мономерных звеньев не приводит к изменению размера частиц. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния для полученных мПЭГ-б-ПЛА частиц была подтверждена структура «ядро-корона». Метод двойной эмульсии позволяет получать сферические частицы на основе блок-сополимеров лактида и этиленгликоля со средним гидродинамическим диаметром порядка 100 нм и узким распределением по размерам. Методом нанопреципитации получены наносомальные лекарственные формы противоракового агента оксалиплатина. Установлено, что длина и кристалличность поли(лактидного) блока, формирующего ядро частицы, в значительной степени влияют на эффективность загрузки лекарства. Так, в ряду мПЭГ-б-П(D,L)ЛА сополимеров с увеличением длины П(D,L)ЛА блока от 62 до 173 мономерных звеньев наблюдается снижение содержания оксалиплатина в частицах от 3,8 до 1,5 масс. % (при исходной загрузке оксалиплатина 5 масс. % от массы блок-сополимера). В ряду мПЭГ-б-П(L)ЛА сополимеров с увеличением длины П(L)ЛА блока от 18 до 64 мономерных звеньев также наблюдается уменьшение содержания лекарства от 5,4 до 0,9 масс. %. Обнаружено, что при близких степенях полимеризации гидрофобного блока содержание оксалиплатина в мПЭГ113-б-П(D,L)ЛА62 частицах выше, чем в мПЭГ113-б-П(L)ЛА64 частицах и составляет 3,8 и 0,9 масс. %, соответственно. Показано, что наибольшая эффективность загрузки оксалиплатина может быть достигнута в случае частице на основе мПЭГ-б-ПЛА сополимеров с относительно невысокой степенью полимеризации гидрофобного полилактидного блока (менее 70 звеньев).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Третий этап проекта был посвящен созданию биоразлагаемых наносомальных форм на основе разветвленных и сверхразветвленных блок-сополимеров полилактид-б-полиэтиленгликоль с числом лучей от 3 до 64. В последнее время разветвленные (в частности звездообразные) полимеры рассматриваются как перспективные материалы для многих биомедицинских применений (Prog. Polym. Sci. 89, 159–212 (2019); Prog. Polym. Sci. 46, 55–85 (2015)). Они привлекают внимание за счет гибко регулируемой архитектуры, востребованных физико-химических свойств, среди которых можно выделить низкую вязкость разбавленных растворов, способность инкапсулировать биологически активные молекулы и высокое содержание концевых групп, которые могут быть функционализированы для придания нужных свойств, например для связывания с таргетным лигандом. Для создания и исследования наносомальных форм противораковых препаратов на основе наночастиц звездообразных амфифильных полимеров были поставлены следующие задачи: - синтезировать звездообразные полилактиды с числом лучей 3, 4, 6, 32, 64 и провести их тщательную характеризацию для подтверждения молекулярного строения; - провести модификацию звездообразных полилактидов блоками полиэтиленгликоля для получения амфифильных соединений; - подробно изучить влияние молекулярного строения на размер и морфологию самоорганизующихся наноструктур; - получить загруженные доцетакселом наносомальные формы, изучить их цитотоксическую активность и кинетику высвобождения активного агента. В результате выполнения работы получены следующие результаты: (1) Установлено, что загруженные противораковым агентом наночастицы PLA-b-PEG со средним диаметром от 30 до 100 нм и содержанием действующего вещества около 3.15 % демонстрируют многократно (от 3 до 10 раз) более высокую эффективность по сравнению со свободным оксалиплатином на всех исследованных линиях клеток. Поскольку оксалиплатин используется преимущественно для лечения колоректального рака, отдельно стоит отметить результат, полученный на линии карциномы толстой кишки HCT116. Цитотоксическая активность наносомальной формы была в среднем в 6 раз выше, чем у свободного оксалиплатина, что делает разработанную форму перспективной для таргетной терапии этого заболевания. (2) Исследована цитотоксическая активность и кинетика высвобождения активного агента для наносомальной формы доцетаксела, полученной методом простой эмульсии на основе линейных амфифильных блок-сополимеров PLA-b-PEG с высокомолекулярным PLA-блоком. В экспериментах на различных линиях клеток наночастицы со средним диаметром около 200 нм и содержанием доцетаксела 0.6 и 1.26 % демонстрировали снижение цитотоксической активности, повышение избирательности действия в отношении раковых клеток, а также пролонгированный характер высвобождения агента. Варьирование длины гидрофобного блока в составе сополимеров оказывает значительное влияние на эффективность инкапсулирования доцетаксела, которая возросла с 12 до 26 % при увеличении молекулярной массы PLA-блока от 50 до 100 кДа. За счет избирательности и пролонгированного действия разработанная наносомальная форма является перспективной заменой традиционной форме доцетаксела, применение которой сопровождается множеством побочных эффектов из-за токсичности данного агента. (3) Наночастицы на основе синтезированных разветвленных блок-сополимеров получали методами диализа и наноосаждения. Показано, что водные дисперсии формирующихся путем самоорганизации частиц на основе 3-,4- и 6-лучевых сополимеров, как правило, содержат две фракции – индивидуальные наночастицы размером менее 50 нм (основная фракция) и примесь их вторичных агрегатов большего размера, которая может быть легко удалена центрифугированием или фильтрованием. Увеличение степени полимеризации гидрофобного поли-L-лактидного блока в ряду 3-х, 4-х и 6-ти лучевых блок-сополимеров приводит к росту среднего гидродинамического диаметра частиц от 10 до 45 нм, тогда как количество лучей слабо влияет на размер частиц. Индивидуальные наночастицы характеризуются дискообразной морфологией и радиусом инерции от 4 до 13 нм, а присутствующие в водной среде агрегаты представляют собой «рыхлые» агломераты индивидуальных наночастиц. Частично кристалличная структура ядра частиц характерна для систем на основе 3- и 4-лучевых блок-сополимеров с длинным (50 звеньев) блоком PLLA. Самоорганизация блок-сополимеров с более коротким PLLA-блоком и с большим числом лучей приводит к формированию наночастиц с аморфным гидрофобным ядром. Наночастицы на основе сверхразветвленных сополимеров Boltorn-PLA-PEG характеризовались мономодальным распределением по размерам и сферической морфологией. Средний диаметр варьировался от 160 до 250 нм и зависел от молекулярного строения сополимера. (4) Наносомальные формы противоракового агента доцетаксела были получены на основе наночастиц звездообразных (3, 4 и 6-лучевых) блок-сополимеров PLLA-b-PEG с самым коротким гидрофобным блоком (10 звеньев). Средний диаметр наночастиц после загрузки лекарственного агента не изменился и составил 13 нм. Независимо от числа лучей в исходном полимере наночастицы демонстрировали высокую эффективность солюбилизации доцетаксела (94-99 %), обеспечивающую содержание активного агента в наноформе от 4 до 5.5 %. Установлено, что кинетика высвобождения доцетаксела имеет пролонгированный характер, за 72 часа высвобождается около 40 % действующего вещества. Важно, что на начальных стадиях не наблюдается «взрывного» высвобождения, характерного для многих полимерных лекарственных форм. Исследование цитотоксической активности наносомальных форм на нескольких линиях клеток показало, что наноформа не уступает в своей эффективности свободному доцетакселу, что является отличным результатом, учитывая лишь 40%-е высвобождение активного агента за время инкубирования с клетками.