Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Поликапролактон (PCL) (Sigma-Aldrich, Германия), поли-3-гидроксибутират (PHB) (Sigma-Aldrich, Германия), оксид графена (не проводящий оксид графена – GO, восстановленный оксид графена, отожженный в среде азота – NrGO и проводящий восстановленный оксид графена – rGO), поли-L-лактид (PLA), а также проводящий полианилин (PANi) использовались для получения гибридных полимерных скэффолдов. В работе были исследованы следующие концентрации GO или модифицированного GO от 0,1% до 1,5 % от массы полимерной матрицы. Из зависимости диаметра волокон от химического состава полученных гибридных скэффолдов установлено, что при изготовлении РНВ композита, включающего в состав нанопластинки GO и модифицированного GO в количестве до 1 вес% от массы РНВ, образуются волокна большего диаметра. Средний диаметр волокон увеличивается от 1,71 мкм (PHB 5%) до 2,045 мкм (PHB5%-rGO 1%). При получении композита PHB6%-PANi 2 – 3%, диаметр волокон скэффолдов увеличивается при добавлении 2 % PANi на 0,56 мкм, т.е. на 33 %; при добавлении 3 % PANi на 0,70 мкм, т.е. на 41 %. Нормированные ИК-спектры PHB и PHB-rGO скэффолдов до и после ферментативной деградации в PBS в течение 7 и 30 дней в диапазоне длин волн 1770-650 см-1 содержат все основные линии поглощения, характерные для PHB, которые свидетельствуют об изменении степени кристалличности материалов. Анализ результатов выявил уменьшение интенсивности молекулярной связи при 1180 см-1, соответствующей ассиметричным колебаниям С-О-С группы в аморфной фазе в течение ферментативной деградации в PBS. Кроме того, наблюдается увеличение интенсивности связей, соответствующих колебаниям молекул PHB в кристаллической фазе при 976, 1230 1275 и 1720 см-1. Наиболее вероятно, что данные результаты обусловлены ферментативной биодеградацией PHB, в первую очередь его аморфной фазы, которая деградирует in vivo значительно быстрее кристаллической фазы PHB, что согласуется с литературными данными. Полученные результаты исследований модуля упругости биодеградируемых скэффолдов на начальной стадии и через 7 и 30 дней выдержки в PBS, независимо от химического состава скэффолдов показало, что модуль Юнга снижается для всех материалов вследствие ферментативного растворения образцов в PBS. Несмотря на увеличение степени кристалличности, наблюдаемое из анализа ИК-спектров за счет более быстрой деградации аморфной фазы, данное явление обусловлено уменьшением диаметра волокон и появлением в них дефектов. Идентичные зависимости также наблюдаются для относительного удлинения и максимального напряжения, выдерживаемого материалами до разрушения. Следует отметить, что в случае PCL скэффолдов происходит резкое ухудшение физико-механических свойств материалов уже после недели выдержки в фосфатном буфере, что обусловлено более быстрым ферментативным растворением, подтверждаемым результатами контроля относительного изменения массы. Анализ РЭМ изображений позволил выявить следы ферментативной биодеградации скэффолдов в виде дефектов волокон, а также уменьшение диаметра волокон при увеличении длительности выдержки в буфере с липазой. Кроме того, установлено уменьшение относительной массы скэффолдов в течение 7 и 30 дней выдержки в PBS. Следует отметить, что PCL скэффолды деградируют значительно быстрее, чем PHB и PHB-rGO при контакте с липазой в PBS. Анализ ИК-спектров показал изменение кристалличности скэффолдов при погружении в PBS, что обусловлено растворением аморфной фазы полимера. Для расчета зависимости диэлектрической проницаемости пьезоэлектрических биодеградируемых полимерных пленок при различной концентрации и модификации GO от прикладываемой частоты напряжения использовались значения электрической емкости. На основе полученных зависимостей видно, что в случае GO, NrGO или rGO при их концентрации в полимере 1,0 или 1,5 вес.% происходит значительное увеличение электрической емкости. Использование GO не позволяет увеличить электрическую емкость, что может быть связано с более высокой реакционной способностью rGO к агломерации внутри гибридных материалов, что создает мини-конденсаторы и увеличивает емкость композита. Из зависимостей диэлектрической проницаемости от частоты прикладываемого напряжения наблюдается характерный тренд, как и для электрической емкости в зависимости от типа и концентрации GO. Так, NrGO при концентрации 1,5 вес.% позволяет получить наиболее значительное увеличение диэлектрической проницаемости. rGO при идентичной концентрации также показывает существенное увеличение диэлектрической проницаемости по сравнению с пленками на основе чистого PHB и/или с добавлением GO. Следует отметить, что при высоких частотах смещения напряжения значения диэлектрической проницаемости и электрической емкости снижаются до значений пленок чистого PHB. Из полученных данных следует, что наибольший поверхностный потенциал генерируется в случае скэффолдов РНВ, содержащих в своем составе проводящий PANi в концентрации 3вес.%. Это может быть связано, в первую очередь, с увеличением диэлектрической проницаемости, что приводит к увеличению заряда, который аккумулируется на поверхности материала. Рассчитанные значения диэлектрической проницаемости согласуются с литературными данными для соответствующих полимеров. В случае с PHB пленками наблюдается увеличение диэлектрической проницаемости по сравнению с чистой PHB пленкой на 0,5-0,6 в случае 0,7 и 1,5% rGO, соответственно. В случае с пленками на основе поли-L-лактида (PLA) зависимость диэлектрической проницаемости от содержания rGO не обнаружена. Таким образом, в рамках выполнения работ по первому этапу НИР получены РНВ скэффолды с различным содержанием оксида графена (0,1 % до 1,5%), а также с PANi (2%, 3%), а также тонкие пленки на основе поли-L-лактида (PLA) с содержанием rGO от 0,1 % до 1,5 %. Результаты исследований, полученных скэффолдов и пленок на основе PLA и PHB показали, что добавление rGO приводит к увеличению кристалличности полученных образцов. Анализ РЭМ изображений позволил выявить последствия ферментативной биодеградации скэффолдов в PBS в виде появления дефектов волокон, а также постепенного уменьшения их диаметра при увеличении времени выдержки в фосфатном буфере с липазой. Кроме того, установлено уменьшение относительной массы скэффолдов в течение 7 и 30 дней выдержки в PBS. PCL скэффолды деградируют в PBS значительно быстрее, чем PHB и PHB-rGO в случае добавления в фосфатный буфер липазы. Анализ ИК-спектров показывает изменение кристалличности скэффолдов при погружении в буфер, что обусловлено более быстрым растворением аморфной фазы полимеров. Несмотря на увеличение кристалличности, изменение диаметра волокон и появление дефектов в них вследствие ферментативной деградации в буфере приводит к снижению модуля Юнга, относительного удлинения и максимального напряжения до разрушения при деформации. Наибольший поверхностный потенциал генерируется в случае скэффолдов РНВ, содержащих в своем составе проводящий PANi, в концентрации 3вес%, что может быть связано с увеличением диэлектрической проницаемости, влияющей на увеличение заряда, который аккумулируется на поверхности отдельных волокон. Результаты биологических исследований с использованием BMSCs позволили установить, что все группы образцов являются биосовместимыми. Исследованные материалы не влияют на изменение плотности клеток в сравнении с контрольной группой. Морфология клеток может контролироваться выбором типа исследованных материалов и их структуры (в частности, диаметром волокон). Результаты исследований пленок и скэффолдов не позволили установить однозначную закономерность влияния rGO на значение пьезоэлектрических констант и поверхностного потенциала, что требует проведения дополнительных исследований в рамках второго этапа НИР.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках второго этапа проекта исследованы способы увеличения содержания кристаллической фазы в пьезобиополимерах – полилактиде (PLLA) и полиоксибутирате (PHB) с целью увеличения пьезоэлектрического отклика. Исследованы следующие серии образцов: - PLLA скэффолды из чистого полимера с микро-, субмикро- и нановолокнами. - PLLA скэффолды из чистого полимера, а также композиты PLLA c восстановленным оксидом графена (rGO) и PLLA c оксидом графена (GO) с содержанием наполнителя 0,2; 0,7; 1,0 масс.%, приготовленные методом электроформования. - PHB скэффолды из чистого полимера, а также композиты PHB c rGO и PHB c GO с содержанием наполнителя 0,2; 0,7; 1,0 масс.% от массы полимера, приготовленные методом электроформования. - PLLA и PHB плёнки из чистых полимеров и содержащих добавки rGO / GO в количестве 0,7 масс.% от массы полимера, приготовленные методом полимеризации из раствора. Исследовано влияние размера волокон и отжига на содержание кристаллической фазы. Выполнены сравнительные исследования пленок со скэффолдами, полученными методом электроформования. Изменение параметров раствора и условий процесса электроформования позволило получить три типа PLLA скэффолдов с различным диаметром волокон, морфология которых исследована с использованием растровой микроскопии, а диаметр волокон рассчитан в программе ImageJ: микроволокно - 1,43 (±0,47) мкм, суб-микроволокно - 0,68 (±0,18) мкм и нановолокно - 0,21 (±0,08) мкм. Термогравиметрический анализ выявил высокую термостабильность микроволокон до 320 °С, сопоставимую по значениям с исходными PLLA гранулами. Сравнительный анализ ИК-спектров образцов с разным диаметром волокон показал наличие идентичных полос поглощения характеристических групп, что свидетельствует об отсутствии изменений в молекулярной структуре PLLA независимо от способа получения волокон. Обнаружены полосы поглощения симметричных и асимметричных деформационных колебаний функциональных групп ̶ CH3, C = O, C ̶ O в диапазонах около 2994, 2920–2850, 1735–1758, 1182 – 1048 см−1, соответственно. Симметричные и асимметричные колебания –CH3 группы также обнаруживаются в диапазонах около 1357–1450 см−1. Изменения в фазовом составе образцов обнаружены при более детальном анализе отдельных областей ИК-спектров. Полосы C = O групп в области 1751 - 1757 см−1 и 955 см−1 характерны для аморфной фазы, а при 1744 см−1 для α-кристаллической фазы PLLA. Также кристаллическая фаза представлена несколькими малоинтенсивными полосами поглощения и плохо разрешёнными пиками в областях: для α-фазы при 921 см−1, для α’-фазы при 923 - 925 см−1 и 916 – 918 см−1, а также β-фаза при 908 – 912 см−1 и обусловлено С ̶ С колебаниями CH3 групп. РФА анализ не обнаружил наличия кристаллической фазы ни у одного из исследуемых образцов, что в соответствии с литературными данными свидетельствует о рентгеноаморфном или нанокристаллическом фазовом составе волокон PLLA. С целью увеличения кристалличности PLLA в соответствии с литературными данными проведена термическая обработка микроволокон при температурах 140 и 160 ºС. Результаты РЭМ показывают, что данная обработка при температуре (160 ºС) не приводит к деформированию структуры полимерных волокон, при этом обнаружено уменьшение среднего диаметра волокон от 1,64 (± 0,36) мкм до 1,21 (±0,8) мкм. Отжиг приводит к организации более компактной кристаллической упаковки доменов, что согласуется с результатами других исследователей и повышает содержание кристаллической фазы в образце. Об этом также свидетельствуют данные ИК-спектроскопии; наблюдается уменьшение интенсивности полосы поглощения С ̶ О групп при 955 см-1, соответствующих аморфной фазе и значительно увеличивается интенсивность колебаний при 921 см-1, принадлежащих деформационным колебаниям С ̶ С, СН3 групп (α-фаза PLLA). РФА также позволил выявить наличие пика при 2θ = 16,6º и небольшого пика при 2θ = 19,0°, что соответствует α-фазе PLLA (карта № - 00-054-1917). Внесение rGO / GO в количестве 0,2; 0,7; 1,0 масс.% в полимерные матрицы PLLA и PHB оказывает влияние на морфологию волокон. Сравнительная оценка РЭМ PLLA волокнистых образцов показывает тенденцию к уменьшению среднего диаметра волокон с увеличением содержания rGO / GO от 1,64±0,38 мкм для чистого PLLA до 1,02±0,40 мкм для PLLA 1% rGO и до 1,12±0,25 мкм для PLLA 1 масс.% GO. Для скэффолдов на основе чистого PHB средний диаметр волокон составляет 1,66 (± 0,32) мкм. Композиты PHB с содержанием rGO / GO – 0,2 масс.% показывают увеличение среднего диаметра волокон до 1,94 (± 0,27) мкм и 1,89 (± 0,32) мкм, соответственно. Добавка 0,7 масс.% rGO / GO приводит к снижению среднего диаметра волокон до 1,30 (± 0,26) мкм и 1,27 (± 0,21) мкм, соответственно. Дальнейшее увеличение содержания rGO / GO до 1 масс.% приводит к получению волокон, близких по диаметру к волокну из чистого полимера PHB и составляет для PHB 1% rGO 1,77 (± 0,28) мкм и для PHB 1% GO 1,61 (± 0,32) мкм. Получаемые PLLA и PHB композиты с rGO / GO имеют однородную структуру волокон, т.е. достигается относительно тонкая дисперсия нанопластинок rGO / GO в полимерных пьезоматрицах. В случае композитов PLLA, содержащих добавки rGO / GO, не установлено существенных изменений в термостабильности от исходной полимерной матрицы, что связано с малым содержанием нанонаполнителя rGO / GO. Анализ ДСК PLLA композитов с rGO / GO согласуется с ранее установленной корреляционной зависимостью степени кристалличности (Хс) от диаметра волокон и, следовательно, уменьшение среднего диаметра волокон с увеличением содержания rGO / GO приводит к снижению Хс от 48 % для чистого PLLA до 43,0 % для PLLA 1 масс.% rGO и до 42,7 % для PLLA 1 масс.% GO. Напротив, данные РФА анализа свидетельствуют о положительном влиянии добавок на фазовый состав композитов PLLA и PHB. Результаты РФА анализа скэффолдов PHB и его композитов с rGO / GO (0,2; 0,7; 1,0 % масс.%) демонстрируют характеристические рефлексы кристаллической фазы PHB, наблюдаемые при значениях 2θ в области 13,4 – 13,6° (020), 16,8 – 16,9º (110) – наиболее интенсивные в области 21,2 – 21,4º (101), 22,2 - 22,4º (111), 25,2 - 25,5º (031/130), 26,9 – 27,1º (040), принадлежащие к α-фазе, а также малоинтенсивные в области 19,9 - 20,1º (021), принадлежащие к β-фазе. С внесением добавок rGO / GO наблюдается изменение дифракционной картины относительно чистого скэффолда PHB. Рефлексы в области 2θ = 13,4 – 13,6°, 16,8 – 16,9º становятся более узкими и интенсивными, причём это происходит даже при минимальном содержании 0,2 масс.% rGO / GO в PHB. Интенсивность рефлексов также увеличивается пропорционально увеличению содержания добавок rGO / GO в скэффолдах. Рефлекс в области 2θ = 19,9 - 20,1º на дифрактограмме PHB 1 % rGO / GO скэффолдов подтверждает образование β-фазы. РФА анализ плёнок показал, что все полученные образцы из чистых полимеров PLLА и PHB и плёночные композиты rGO / GO содержат кристаллическую фазу. В случае дифрактограмм плёнок PLLA и плёночных композитов обнаружены рефлексы при 2θ = 15,0° (010), в области 16,6 – 16,7º (200/110) – наиболее интенсивный, в области 18,9 - 19,1º (014/203), 22,4 º (210) принадлежащие к плоскостям α-фазы. Наличие β-фазы находится при значениях 2θ = 16,74º (200/110), 19,2º (201/111) и 22,4 – 22,5º (210), и 25,2 – 25,5 (202/112) только у образцов, содержащих добавки rGO / GO. Для плёнок PHB и плёночных композитов получена дифракционная картина, свидетельствующая о кристаллической структуре образцов и о влиянии добавок rGO / GO на механизмы кристаллизации, т.к. наличие определённых рефлексов и их интенсивность зависят от состава образца. На дифрактограммах в случае всех исследуемых образцов обнаружены характерные рефлексы кристаллической фазы PHB при значениях 2θ в области 13,4 – 13,6° (020), 16,8 – 16,9º (110) – наиболее выделяющиеся, а также менее интенсивные в области 21,2 – 21,4º (101), 22,2 - 22,4º (111), 25,2 - 25,5º (031/130), 26,9 – 27,2º (040), 29,2 – 29,5º (002), 30,4 – 30,6º (012), 36,2 – 30,5º (122), 37,4º (230), 40,5º (151), 43,5 – 43,8º (142), 44,2 – 44,5º (241), 47,5º (161), 48,3 - 48,6º (103), принадлежащие к плоскостям α-фазы, а также малоинтенсивный пик в области 19,9 - 20,1º (021) принадлежащий к плоскостям β-фазы. Дифрактограммы образцов чистого PHB и PHB 0,7 масс.% GO содержат несколько рефлексов, которые не обнаружены в случае PHB 0,7 масс.% rGO при значениях 2θ в области 12,2 – 12,5° (020), 29,2 – 29,5º (002), причём последний является самым интенсивным, характерным для кристаллического PHB. При сравнении результатов РФА анализа PLLA, PHB скэффолдов, плёнок и композитов, можно заключить, что в зависимости от способа получения, образуются материалы с разной степенью кристалличности, причем лимитирующим фактором выступает продолжительность подвижности молекулярных цепей, влияющая на качество формирования надмолекулярной структуры полимеров. Внесение добавок способствует процессу кристаллизации, а также определяет фазовый состав и структуру материала. Для образцов, содержащих 0,7 масс.% наполнителя rGO / GO в матрице PLLA, прослеживается тенденция к образованию α и β кристаллических фаз, для PLLA 0,7 масс.% rGO образуется преимущественно β-фаза, тогда как ИК-спектры PLLA композитов, содержащих 1 масс.% rGO / GO добавок, демонстрируют практически полное совпадение спектральных профилей и имеют малоинтенсивную полосу поглощения в области 912 см−1, что свидетельствует о преобладании β-фазы. ИК-спектроскопия PHB и композитов PHB в составе с rGO / GO позволила установить наличие характерных полос PHB для –CH валентных колебаний при 3000–2940 см−1, C=O валентных колебаний в области 1725 см−1, соответствующих кристаллической фазе PHB, для C–H ассиметричных и симметричных деформационных колебаний СН3 групп при 1456, 1380 см−1, соответственно, C–O–С валентные колебания в области 1280 см−1, также соответствующие кристаллической фазе PHB, –CН деформационные колебания при 1262 см−1 и C–O–С валентные колебания при 1262, 1228, 1182, 1101 см−1. Характерные полосы, отвечающие за валентные колебания C–O при 1056 см−1, C–CH3 при 1045 см−1. После добавления rGO / GO описанные полосы присутствуют на спектре, новых полос не обнаружено. Следует отметить, что полоса поглощения при 1747 см−1, соответствующая C=O валентным колебаниям аморфной фазы PHB, на спектре отсутствует. Таким образом, добавки rGO / GO к полимерным матрицам PLLA в количестве 0,7 и 1 масс.% и к PHB в количестве 0,2; 0,7; 1 масс.% приводят к формированию β-фазы. Установлена пьезоэлектрическая доменная структура РНВ волокон, демонстрирующая явный вертикальный и латеральный ПСМ отклик. По мере увеличения содержания rGO в РНВ микроволокнах наблюдается более равномерное распределение потенциала поверхности, а также увеличение его среднего значения, что обусловлено наличием полярных карбоксильных и гидроксильных групп в rGO. РНВ микроволокна демонстрируют не только латеральный ПСМ отклик, а также вертикальный благодаря наличию зигзагообразной β-фазы, обладающей гексагональной кристаллической структурой. Добавление rGO позволяет увеличить вертикальный и латеральный ПСМ отклики РНВ микроволокон как по поверхности всего волокна, так и отдельных доменов. Максимальный эффект достигнут при 0,7 масс.% концентрации rGO. Влияние rGO на пьезоэлектрические свойства РНВ полимера может быть обусловлено повышением кристалличности, увеличением содержания β-фазой или изменение электрических и механических свойств, как диэлектрическая проницаемость и модуль Юнга. Биологические исследования in vivo позволили установить, что введение в состав РНВ-скэффолдов rGО не вызывает значимых изменений параметров биосовместимости и остоиндуктивных характеристик, что будет детально изучено при выполнении работ в рамках следующего этапа. Таким образом, разработанные в рамках второго этапа проекта способы получения гибридных скэффолдов для регенеративной медицины позволили получить экспериментальные образцы материалов на основе чистых пьезополимеров и гибридных пьезополимеров в составе с оксидом графена различной формы, структуры на нано-, микро- и мезоуровне, с оптимизированными физико-механическими и электрофизическими свойствами, а также иерархической пористостью, в частности, имитирующей многомодальную пористость костной ткани.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках третьего этапа проекта проведено комплексное исследование влияния восстановленного оксида графена (rGO) на морфологию, кристаллическую и молекулярную структуру биоразлагаемых скэффолдов на основе поли-L-лактида (ПЛЛА). Анализ полученных результатов исследований позволил сделать следующие основные выводы: • с использованием метода электроспиннинга отработаны способы получения волокнистых трехмерных скэффолдов на основе ПЛЛА и rGO без видимых микродефектов; • добавление rGO приводит к незначительному снижению диаметра волокон с 1,96±0,29 мкм для ПЛЛА до 1,82±0,32 мкм для ПЛЛА с 1,0 мас.% rGO; • анализ результатов термогравиметрии показал, что добавление rGO с концентрацией до 1,0 мас.% не влияет на термостойкость полимерных ПЛЛА скэффолдов. Были рассчитаны температуры стеклования и плавления скэффолдов: Tg = 62,5±0,25°C и Tm = 177,4±0,2°C, соответственно; • анализ результатов исследований с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии позволил установить, что кристалличность 40,21±0,9% ПЛЛА незначительно снижается до 38,62±0,15 % после добавления rGO, что также оказывает существенное влияние на структуру ПЛЛА, так как на рентгенограммах обнаружены рефлексы, соответствующие α- и β-фазам. • добавление 0,7-1,0 мас.% rGO в ПЛЛА-скэффолды оказывает наиболее выраженное влияние на кристаллическую структуру гибридных матриц. Присутствие α- и β-фаз при добавлении rGO в ПЛЛА приводит к более выраженному пьезоэлектрическому отклику по сравнению с пьезоматрицами без наполнителя. Результаты проведенных исследований пьезоэлектрического отклика свидетельствуют о том, что метод электроспиннинга является перспективным для получения волокнистых скэффолдов на основе пьезополимерных материалов (поли-3-гидроксибутират (РНВ), что детально изучено на предыдущих этапах работы, а также поли-L-лактид (ПЛЛА)). При этом, использование в качестве нанонаполнителей rGO существенным образом определяет механизмы фазо- и структурообразования пьезополимерных композитов. Ключевым вызовом является установление наиболее перспективной концентрации наполнителя, который позволяет изменять/контролировать/увеличивать пьезоэлектрический отклик. Рост концентрации наполнителя до уровня 0,7 или 1 мас. % позволяет существенно увеличить средние значения пьезоэлектрического отклика по сравнению с исходными матрицами РНВ (исследованного детально на предыдущих этапах работы) или ПЛЛА. Количество наполнителя играет ключевую роль, так как влияет на механизмы образования электроактивной пьезополимерной фазы и, как показывают, проведенные исследования, необходимая концентрация rGO находится на уровне 0,7-1 мас. %. При имплантационных тестах под кожу и в костную ткань обнаружено, что ПЛЛА/rGО-скэффолды биосовместимы, гистопатогенных эффектов в зоне имплантации не отмечено. При имплантации под кожу у белых крыс ПЛЛА/rGO-скэффолдов воспалительные изменения не обнаружены. Во всех случаях периферическая часть скэффолда интенсивно заселена соединительнотканными элементами, в центральной части интенсивность колонизации фибробластами снижается, либо отсутствует. В большинстве случаев матрица васкуляризована. При имплантации в костную ткань ПЛЛА/rGO-скэффолдов отмечались локальные пери- и эндостальные реакции. Волокна матрицы не визуализируются в результате врастания в ткань, в зоне имплантации отмечается наличие васкуляризованного соединительнотканного регенерата, спаянного с соединительной тканью надкостницы краев дефекта кортикальной кости, в отдельных участках которого имеются небольшие области интрамембранозного окостенения. Полученные в условиях субкутанной и костной имплантаций у белых крыс результаты позволяют заключить, что все исследованные в рамках проекта ПЛЛА скэффолды и гибриды на их основе являются биосовместимыми и могут быть эффективно использоваться для восстановления дефектов костной ткани, а также имеют большой потенциал использования в других биомедицинских приложениях.