Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Направление по выделению белковых компонентов крови для дальнейшего их количественного приборного анализа развивается в настоящее время в отношении многих маркеров различных патологий. При создании различных вариантов биосенсоров (различных как по форме, так и по принадлежности к широкому спектру методов приборной оценки, основанных, например, на принципах гигантского комбинационного рассеяния, поверхностного плазмонного резонанса и др.) общей является проблема закрепления антител на специальных носителях. Проблема закрепления антител также является актуальной при конструировании наноматериалов биомедицинского назначения и систем магнитной сепарации биологических жидкостей для извлечения и концентрирования их компонентов. Особой значимостью при этом обладает аспект воспроизводимости методик модификации поверхностей антителами и количественного описания модифицированной поверхности, что становится возможным только при развитии специальных приложений современных физико-химических методов анализа биологических объектов. В отчетном периоде с использованием предложенных в заявке методов и подходов была выполнена совокупность исследовательских работ, соответствующая заявленным планам работ по проекту и нацеленная на получение функциональных систем на основе магнитных наночастиц для извлечения и концентрирования плазминогена. Был проведен синтез магнитных наночастиц по двум методикам, позволивший получить наночастицы с размерами до 50 нм и их агрегаты, и модификацию их поверхности сывороточным альбумином, закрепленным по свободнорадикальному механизму. Впервые методами калориметрии было проведено исследование влияния соли (0,15М и 0,3М NaCl) и pH буфера (6,0, 6,6, 7,5) на термодинамические характеристики процессов с участием сывороточного альбумина и магнитных наночастиц. На основе полученных методом изотермической титрационной калориметрии (ИТК) результатов, дополненных результатами дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), сделаны выводы как о взаимодействии белка с поверхностью частиц, так и о конформационных перестройках белка вследствие адсорбции на поверхности, выявлено влияние на процессы изменения состава буфера. Наибольшую устойчивость в условиях конкурентных адсорбционных процессов с участием фибриногена и иммуноглобулина G, исследованных при выполнении проекта методами спектрофотометрии УФ/видимой области, ДСР с измерением дзета-потенциала, методом ФМР, впервые методами ДСК и впервые с приложением метода ИТК, демонстрировали покрытия, полученные при использовании 0,05М фосфатного буфера pH 6,0. Заявленный в проекте план работы на отчетный период был частично модифицирован с целью гарантированного решения задачи обеспечения биомедицинской функциональности получаемых систем на основе магнитных частиц, поставленной в заявке. Таким образом, в отчетном периоде был проведен подбор условий модификации поверхности магнитных частиц антителами к плазминогену и подбор моноклональных антител к различным эпитопам плазминогена, обеспечивающие извлечение плазминогена из раствора; были выполнены первые работы по оценке количества и активности извлеченного белка, а также первые работы по элюции плазминогена с поверхности магнитных частиц; были проведены первые успешные исследования возможности образования сендвича антитело-плазминоген-антитело на поверхности магнитных частиц для количественного определения извлеченного белка-плазминогена модифицированными магнитными частицами из раствора. В проекте решается как задача адаптации современных приборных физико-химических методов анализа к сложным объектам исследования, так и задача обеспечения биомедицинской функциональности получаемых систем на основе магнитных частиц. Получаемые при выполнении проекта результаты будут способствовать углублению имеющихся фундаментальных и прикладных представлений о причинах и протекании химических и конформационных превращений молекул белков в составе белок-содержащих покрытий на поверхности магнитных наночастиц в процессе создания и функционирования наносистем, а также превращений молекул белков на поверхности магнитных наночастиц при введении наночастиц с модифицированной поверхностью в биологические жидкости и предопределяющих особенности биораспределения наносистем в организме.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Направление по выделению белковых компонентов крови для дальнейшего их количественного приборного анализа развивается в настоящее время в отношении многих маркеров различных патологий. При создании различных вариантов биосенсоров (различных как по форме, так и по принадлежности к широкому спектру методов приборной оценки, основанных, например, на принципах гигантского комбинационного рассеяния, поверхностного плазмонного резонанса и др.) общей является проблема закрепления антител на специальных носителях. Проблема закрепления антител также является актуальной при конструировании наноматериалов биомедицинского назначения и систем магнитной сепарации биологических жидкостей для извлечения и концентрирования их компонентов. Особой значимостью при этом обладает аспект воспроизводимости методик модификации поверхностей антителами и количественного описания модифицированной поверхности, что становится возможным только при развитии специальных приложений современных физико-химических методов анализа биологических объектов. В отчетный период с использованием предложенных в заявке методов и подходов, а также дополнительных подходов, была выполнена совокупность исследовательских работ, нацеленная на получение функциональных систем на основе магнитных наночастиц для извлечения и концентрирования плазминогена. Заявленный в проекте план работы на отчетный период был частично модифицирован и дополнен с целью обеспечения биомедицинской функциональности получаемых систем на основе магнитных частиц, в том числе, за счет снижения эффектов неспецифической сорбции белков на немодифицированные и модифицированные магнитные наночастицы. Ниже приведена детальная информация о выполненных в отчетном периоде работ и полученных научных результатах в отчетный период. Магнитные наночастицы (магнетит) (МНЧ) для получения систем для извлечения и концентрирования плазминогена были синтезированы, как и на первом этапе выполнения работы, методом соосаждения солей железа (II) и (III) в щелочной среде и методом частичного восстановления железа (III) до Fe (II) при повышенной температуре в среде этиленгликоля. С целью дальнейшей функционализации частиц моноклональными антителами их поверхность была модифицирована сывороточным альбумином с использованием свободнорадикального способа [Розенфельд М.А., Бычкова А.В. и др. «Способ получения белковых покрытий на поверхности твердых тел, содержащих ионы металлов переменной валентности», патент РФ на изобретение № 2484178 от 10.06.2013, приоритет от 08.09.2011.; Бычкова А.В. Создание устойчивых макромолекулярных покрытий на магнитных наночастицах для применения в биологии и медицине: дис. … канд. хим. наук: 02.00.04: защищена 26.12.2012: утв. 30.05.2013.]. Закрепление сывороточного альбумина на поверхности МНЧ было доказано с использованием разработанных ранее методик с применением “фибриногенового теста”, а также с применением в аналогичном тесте иммуноглобулина G, который, как и фибриноген, обладает высоким сродством к поверхности наночастиц, и позволяет проводить качественную оценку устойчивости покрытия из сывороточного альбумина, ковалентно закрепленного на поверхности наночастиц. Детектирование относительной толщины и устойчивости белкового покрытия на МНЧ проводили методами электронного магнитного резонанса по сдвигу центра кривой поглощения МНЧ в поле вследствие изменений условий магнитного резонанса при формировании покрытия из сывороточного альбумина и из иммуноглобулина G в конкурентном адсорбционном процессе, а также методами динамического светорассеяния, спектрофотометрии УФ/видимой области. При нанесении покрытий из сывороточного альбумина на поверхность МНЧ варьировали pH 0,05М фосфатного буфера в диапазоне 6,0-7,5 и содержание NaCl в нем (0М, 0,15М и 0,3М). Воспроизводимая методика модификации частиц сывороточным альбумином поверхностью была получена при синтезе частиц в лаборатории по методу соосаждения. Дополнительно в течение отчетного периода были использованы наночастицы магнетита, синтезированные коллегами в РХТУ [Muradova A.G., Zaytseva M.P., Sharapaev A.I., Yurtov E.V. Influence of temperature and synthesis time on shape and size distribution of Fe3O4 nanoparticles obtained by ageing method // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2016. Vol. 509. P. 229–234.], поверхность которых была покрыта диоксидом кремния и аминирована в водной среде 3-аминопропилтриметоксисиланом (АПТМС), средний размер частиц по данным электронной микроскопии составлял 100 нм. Также в работах, нацеленных на подбор оптимальных условий создания функциональных систем извлечения плазминогена, было продолжено использование в качестве контрольной системы коммерчески доступных магнитных частиц с размерами от 300 нм с первичными модифицирующим слоем (глиоксаль-активированной поверхностью или аминогруппами). Для всех работ, изложенных в отчете и предполагающих отделение свободного белка от частиц, модифицированных белком, были использованы коммерчески доступные магнитные штативы для магнитной сепарации (MagRack 6), а также самостоятельно сконструированные при выполнении проекта механические устройства на основе магнитов Nd-Fe-B, предполагающие использование железных якорей-стержней и позволяющие эффективную магнитную сепарацию в пластиковых кюветах в течение 1 часа магнитных наночастиц, размеры которых не превышали 50 нм, что не является возможным при использовании MagRack 6. В течение отчетного периода все виды магнитных частиц исследованы методом электронного резонанса. Полученные спектры использованы для оценки относительной толщины белкового слоя при модификации поверхности частиц. При реализации процедур с использованием спиновых зондов и меток показано снижение их сигнала на поверхности магнитных частиц, затрудняющее одновременную оценку белок-белковых взаимодействий на поверхности функциональных систем методами магнитного резонанса – методом ферромагнитного и электронного парамагнитного резонанса. Функционализация антителами магнитных наночастиц с первичным модифицирующим слоем была реализована после модификации частиц глутаровым альдегидом. Было показано, что выбранные для работы моноклональные антитела и антитела, модифицированные пероксидазой хрена, взаимодействуют с плазминогеном как в растворе, так и в результате присоединения антител к поверхности частиц Для контроля посадки антител на поверхность частиц с первичным модифицирующим слоем, а также для контроля извлечения плазминогена использовался количественный метод определения белка по Бредфорду, а также данные по оптической плотности на длине волны 280 нм. Реакцию образования преципитата наблюдали биохимически, а также на 450 нм. Антитела были использованы как индивидуально, так и в смесях. Использование смеси антител способствовало более полному извлечению плазминогена из раствора в 0,1М фосфатном буфере pH 7. Также в отчетном периоде были детектированы эффекты неспецифической сорбции плазминогена и МАТ поверхностью частиц, модифицированных сывороточным альбумином, и коммерческих и синтезированных в лабораторных условиях частиц с аминогруппами, в связи с чем ряд биохимических работ в течение второго этапа проекта был нацелен на преодоление эффектов неспецифического связывания и адаптацию перечисленных выше подходов к количественной оценке связывания белков различными частицами с целью сопоставления эффективности коммерческих и синтезированных частиц, а также с целью выявления вклада неспецифической сорбции в интерпретируемые результаты. Например, было показано, что при концентрации частиц на стадии извлечения белка около 0,45 мг, выполняемой с использованием частиц, не модифицированных МАТ, максимальное количество плазминогена, связываемого поверхностью аминированных частиц, составляет 0,43 мг белка на 1 мг частиц, коммерческих частиц с аминогруппами – 0,52 мг белка на 1 мг частиц, а частиц, модифицированных сывороточным альбумином, - 1,12 мг на 1 мг частиц, что связано, вероятно, с соотношением поверхность/объем (удельной поверхностью частиц). При этом связывание плазминогена частицами, на поверхности которых находятся ковалентно присоединенные МАТ, приводит к увеличению количества связанного плазминогена в 1,3-2,5 раз в случае частиц с аминогруппами (как полученных в лабораторных условиях, так и коммерчески доступных), но практически не влияет на количество связанного плазминогена в случае частиц, модифицированных сывороточным альбумином, что может быть обусловлено с различной доступностью МАТ для реакции антитело-антиген, предопределяемого, в свою очередь, не только химией, но и кривизной поверхности частиц. В качестве химических веществ-агентов, приводящих, согласно литературным данным, к снижению неспецифической сорбции белковых компонентов крови, был выбран полиэтиленгликоль (ПЭГ). С применением метода спектрофотометрии УФ/видимой области по изменениям оптической плотности растворов на 450 нм (методика на примере взаимодействия иммуноглобулина G и магнитных наночастиц (МНЧ) представлена в статье, являющейся отчетной по проекту [Bychkova et al., BBA - Proteins and Proteomics 1868 (2020) 140300]) было доказано взаимодействие плазминогена с моноклональными антителами в реакции антитело-антиген в присутствии ПЭГ с молекулярными массами 2000 и 15000. На текущем этапе работы по проекту реализуются ковалентные процедуры модификации поверхности частиц МАТ, включающие использование ПЭГ и обеспечивающие снижение неспецифической сорбции белков, что исходно не было включено в планы работ по проекту, но оказалось необходимым для решения задачи получения систем извлечения плазминогена. Были выполнены исследования, нацеленные на элюцию плазминогена, извлеченного из раствора с помощью частиц, модифицированных антителами. Подбор условий элюции включал анализ влияния добавок в виде ε-аминокапроновой кислоты (до 0,20М) и NaCl до 0,5М в 0,1М фосфатный буфер pH 7, фактора времени и температуры для наиболее эффективного разрыва связи антитело-антиген, контролируемого по количеству плазминогена в надосадке (определялось методом Бредфорда), полученном после отделения на магните модифицированных антителами частиц. Методом ИТК была также проведена оценка влияния буферов на белок-белковое взаимодействие и подтвержден факт различного связывания МАТ и плазминогена в различных буферах, однако исследование частиц методом ИТК или прямой перенос полученных в растворе данных на явления, имеющие место на поверхности частиц, показал себя крайне затруднительным вследствие присутствия дополнительных эффектов, например, в виде неспецифической сорбции белков поверхностью частиц, а также присутствия дополнительных агентов. Кроме того, на основе полученных экспериментальных данных есть основания предполагать различную доступность и локальную концентрацию молекул в растворе и на поверхности частиц, что обусловливает различное протекание взаимодействий белков в растворе и на поверхности частиц. Плазминоген для исследований был выделен препаративно из человеческого сырья (плазмы) в ИБХФ РАН. Для определения активности плазминогена как компонента фибринолитической системы после препаративного выделения из плазмы, а также при работе с магнитными частицами использованы наборы НПО “Ренам” и методика, разработанная на первом этапе выполнения проекта. Фибринолитическая активность плазминогена была доказана как при его связывании поверхностью частиц (непосредственно на поверхности частиц активны до 50% плазминогена), так и после десорбции. Были продолжены работы по количественной оценке присутствия в растворе антител, модифицированных пероксидазой хрена, с применением 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида (ТМБ). Были построены калибровочные для оценки концентрации плазминогена, извлеченного с помощью частиц, путем создания сендвича антитело-аналит(плазминоген)-антитело и использования раствора ТМБ по принципам иммуноферментного анализа (ИФА). Было показано неполное связывание вторых МАТ с плазминогеном (МАТ связываются из избытка не более чем с 40% белка на поверхности частиц). Нечеткая воспроизводимость этой процедуры, по-видимому, обусловлена варьированием результата модификации частиц первыми МАТ, варьированием посадки плазминогена (плотностью посадки белка, конформационными вариациями), неспецифической сорбцией белков, что снижает вероятность использования методики для количественного определения связывания плазминогена частицами. Однако, очевидной остается возможность применения методики для подтверждения факта связывания плазминогена частицами при извлечении из буфера или плазмы. В течение отчетного периода на всех системах была показана возможность многократного использования частиц для извлечения плазминогена. Согласно результатам совокупности исследований по проекту, наиболее перспективными для дальнейших работ, нацеленных на извлечение компонентов крови, являются частицы с аминированной поверхностью. Они обладают относительно высокой магнитоуправляемостью (на отделение их с помощью коммерческого магнитного штатива достаточно минут), характеризуются низкой неспецифической сорбцией плазминогена в сравнении с коммерчески доступными частицами, подвергаются модификации различными антителами и обеспечивают извлечение и элюцию плазминогена. Применение метода ИТК позволяет эффективно осуществлять подбор условий модификации поверхности частиц белком, а также описывать белок-белковые взаимодействия в растворе и переносить их на реализуемые на поверхности частиц (например, на стадии извлечения белка-аналита из раствора и элюции белка-аналита с поверхности частиц). Метод электронного магнитного резонанса был использован на всех стадиях модификации и использования частиц в проекте для оценки концентрации магнитных частиц, толщины белкового покрытия на частицах. Применение методов электронного магнитного резонанса оказывается наиболее эффективным в аспекте исследования относительной толщины белкового покрытия на частицах с диаметрами около 50 нм и оценки концентрации частиц на различных стадиях извлечения и элюции белка-аналита. На примере индивидуальных частицах с размерами до 50 нм обнаружены различия между образцами, тогда как на частицах с размерами выше 100 нм детектировать их не удается, по всей вероятности, вследствие повышения магнитного момента частиц.