Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В настоящее время остро стоит задача повышения эффективности действия и снижения токсического действия противотуберкулезных препаратов. Одним из путей ее решения является создание их системы доставки на основе наноносителей, позволяющих повысить локальную концентрацию лекарственного вещества органе-мишени, тем самым снижая терапевтическую дозу и побочные эффекты. Перспективным носителем лекарственных веществ считается детонационный наноалмаз (НА) благодаря оптимальной совокупности его физико-химических и биофармацевтических свойств: сверхмалый размер первичных частиц, высокоразвитая поверхность и наличие на ней функциональных групп, позволяющих проводить адсорбционную и ковалентную иммобилизацию лекарственных веществ, быстрое проникновение в клетку, биосовместимость и нетоксичность. Целью данного проекта является разработка подходов к получению систем доставки противотуберкулезных веществ на основе детонационного наноалмаза и изучение его поведения в живом организме. В первый год выполнения проекта в соответствии с планом были изучены физико-химические свойства промышленного НА и его функционализированных производных, полученных с помощью методом газофазного и жидкофазного химического модифицирования. Методом ПЭМ показано, что первичные частицы НА имеют округлую форму и размеры 4-6 нм. Доказано наличие алмазной фазы методами рентгеновского фазового анализа (максимум при 2θ = 43,9 градуса) и комбинационным рассеянием света (максимум при 1328 см-1). Площадь поверхности НА по методу БЭТ равна 250 м2/г. Методом РФЭС показано, что приповерхностный слой частиц НА состоит из 91% ат. углерода, 8% ат. кислорода, 1 % ат. азота. Методом элементного анализа показано, что содержание азота в объеме частиц доходит до 2,4 %. Методом динамического рассеяния света показано, что в гидрозоле размер агрегатированных частиц НА оказался равным 100 нм с небольшой долей 200-500 нм частиц (до 3%). Содержание протонных кислотных групп, определенное потенциометрическим титрованием, на поверхности НА составило 3,3 ммоль/мг. Содержание примесей не превышало 0,5% (метод ИСП-МС), основную часть которых составляли элементы Fe, Ti, W. Разработан способ очистки НА от основных примесей последовательной обработкой последовательной обработкой 0,1 М NaOH и HClконц. После очистки были получены НА с гидрированной (шифр НА-Н, смесь серной и азотной кислот, 120 оС, 24 ч), карбоксилированной (шифр НА-СООН, Н2, 800оС, 5 ч) и амидированный (шифр НА-NH2, 1) НА-СООН + SOCl2, 2) NH3, 150 oC, 3 ч) поверхностью для дальнейшей адсорбционной иммобилизации лекарственных веществ. После модифицирования содержание протонных для НА-Н упало до 90 ммоль/мг, а для НА-СООН увеличилось до 990 ммоль/мг. Процесс функционализации дополнительно подтверждался ИК-спектрами по исчезновению или увеличению максимума карбонильного углерода карбоксильной группы при 1730 см-1. Соответственно наблюдалось уменьшение (НА-Н) и увеличение (НА-СООН) содержание кислорода, полученное методом РФЭС. Размер агрегатированных частиц в гидрозоле НА-Н уменьшился до 50 нм, для НА-СООН остался прежний – 100 нм. Для ковалентной иммобилизации была разработана схема прививки противотуберкулезных веществ с использованием легко уходящего атома хлора в связи С-Cl в хлорированном и С-Br в бромированном наноалмазе. Хлорирование НА осуществляли последовательно после гидрирования НА в жидкой фазе при фотохимическом инициировании растворенного молекулярного хлора в четыреххлористом углероде при облучении видимым светом (150W) в течение 24 ч. Бромирование проводили в жидком броме при комнатной температуре в течение 12 ч. Элементный анализ показал содержание хлора в НА-Cl – 5,4% масс., брома в НА-Br – 7,8% масс. Для иммобилизации на поверхность НА были выбраны повсеместно используемые в клинической практике противотуберкулезные вещества – амикацин, изониазид, пиразинамид и рифампицин. Показано, что величина адсорбции амикацина (оценивалась по 3Н-метке, введенной в молекулу амикацина) зависит от типа функционализированной поверхности НА. Количество прочно связанного (хемосорбированного) амикацина оказалось равным 22 мг/г для НА-Н и 48 мг/г для НА-СООН. Адсорбцию других антибиотиков оценивали спектрофотометрически при длине волны 263-268 нм в водных и спиртовых растворах. Показано, что пиразинамид при pH = 3 и 5 не сорбировался на НА-Н и НА-СООН. При pH = 10 пиразинамид сорбировался только на НА-СООН в количестве 0,4%. При этом во всех исследованных дипазонах pH на НА-NH2 хемосорбировалось около 1% пиразинамида при ионной силе раствора 0,15 моль/л NaCl. Максимальное количество хемосорбированного рифампицина на поверхности НА-COОН достигало 2% масс. Максимальное количество хемосорбированного изониазида было максимальным для НА-СООН и находилось на уровне 2,5%. Можно сделать вывод о том, что для каждого конкретного вещества можно подобрать определенный функциональный покров НА, позволяющий получить его максимальную загрузку. Адсорбционный метод применим, когда химическая структура вещества не позволяет относительно простым способом его ковалентно привить на поверхность НА без потери активности, что относится к молекуле рифампицина. Полученные системы НА-лекарство сохраняли до 90% хемосорбированного вещества в течение 24 ч. Ковалентная прививка противотуберкулезных веществ на галогенированную поверхность НА осуществлялась замещением аминогруппы на галоген в органических растворителях (ацетонитрил, дихлорбензол, третбутанол, N,N-диметилацетамид) по возможности в мягких условиях при температуре 4-80 оС в течение 12-72 ч. НА-Br показал слабую устойчивость в жидких органических растворителях. Поскольку разрыв связи С-Br в НА-Br происходил раньше времени реакции замещения на аминогруппу (в течение 1-2 ч), то было решено в дальнейшем использовать более устойчивый НА-Cl (гидролиз отсутствовал в течение 24 ч). После проведения синтеза показано, что количество привитого амикацина составило 7,4 %, изониазида – 2,3 %. По данным элементного анализа пиразинамид не привился на поверхность НА в установленном диапазоне времени и температуры, по-видимому, за счет мало реакционноспособной амидной группы. Было показано, что привитой амикацин в течение 30 сут в растворе не гидролизуется с поверхности НА, тогда как с НА-Н и НА-СООН уходит до 20 и 29% амикацина, соответственно. Таким образом были получены конъюгаты НА-аммикацин и НА-изониазид с высокой плотностью прививки, которые пригодны для дальнейшего исследования на биологических моделях. Для визуализации НА в организме на его поверхность была введена тритиевая метка методом термической активации трития. Показано, что удельная активность промышленного НА после удаления лабильной метки достигала 91 ГБк/г. После удаления лабильной метки, активность сохранилась на уровне 34 ГБк/г. Удельную активность НА удалось повысить мечением образца НА-Н до 90 ГБк/г за счет увеличения содержания С-Н связей на поверхности. Дополнительной дезагрегацией частиц и мечением монослоя частиц НА, нанесенного на стенки реактора, удалось достичь удельной активности в 2,6 ТБк/г. Выдерживание НА меченного тритием в течение 9 мес. в протонных растворителях показало отсутствие радиоактивности в жидкости и, следовательно, обмена трития на водород растворителя в связях Салм-3Н. Полученный образец в дальнейшем может быть использован для проведения биологических тестов на животных и фармакокинетических исследований. Введение тритиевой метки в НА дало возможность изучить биораспределение НА в организме животных ex vivo. Было использовано две линии экспериментальных животных: крысы белые беспородные и крысы линии Wistar. На белых беспородных крысах исследовано 3 пути введения приготовленного гидрозоля НА: внутривенный, внутрибрюшинный и ректальный. Показано, что через 15 мин после введения максимальное накопление в легких более чем в 6 раз выше при внутривенном пути введения, что можно рекомендовать для создания инъекционной лекарственной формы при лечении легочного туберкулеза. При этом концентрация частиц НА в крови при внутривенном способе введения была в 1,5 и 2 раза выше, по сравнению с внутрибрюшинном и ректальном способе введения, соответственно. На крысах линии Wistar было исследовано накопление и выведение НА в течение 24 ч. Показано, что через 30 мин после введения в легких накапливается максимальное количество НА (до 6% от введенной дозы), что в 30 раз превышает накопление по остальным органам. Таким образом показано, что НА имеют тропность к легким за счет своих морфологических и физико-химических характеристик поверхности, что может быть эффективно использовано при создании системы доставки противотуберкулезных веществ на основе НА.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Было изучено долговременное биораспределение детонационного наноалмаза (ДНА) на здоровых и инфицированных туберкулезом мышах и показало, что частицы быстро накапливаются органах и тканях мышей наблюдается уже через 15 мин после введения. Основными органами накопления ДНА у здоровых мышей являются легкие (до 10% от введенной дозы), почки (до 7%) и печень (до 4,5%). Биораспределение ДНА на зараженных животных показало существенное увеличение накопления в легких, однако в течение небольшого времени. Количество ДНА в легких увеличивается по сравнению со здоровыми животными с 10% до 17,5% за 15 мин, с 8% до 23% за 1 ч. К 6 ч количество наноалмазов в легких выравнивается и не изменяется на протяжении длительного времени. Полученные экспериментальные данные дают понимание длительности воздействия или нагрузки наноалмазов на основное депо их накопление – легких, что может быть учтено в клинической практике. Накопление ДНА в печени зараженных туберкулезом мышей уменьшается с 4,5 до примерно 2% за 15 мин после введения и постепенно накапливается к 24 ч до 4,5% от введенной дозы. Через 3 месяца происходит постепенное снижение количества ДНА в печени до 2% от введенной дозы, что также совпадает с данными биораспределения на здоровых животных. В почках зараженных мышей ДНА практически не накапливаются – максимальная нагрузка на орган – до 0,7% от введенной дозы за 15 мин, что существенно отличается от здоровых мышей (7,5% за 15 мин и в дальнейшем резкое уменьшение). Накопление ДНА в селезенке у больных мышей имеет схожую картину, однако количество частиц увеличивается с 0,2 до 1,5% и такая тенденция сохраняется вплоть до 3 месяцев нахождения ДНА в организме. Это может быть связано с нарушением работы селезенки, также как и легочной ткани при туберкулезе, повышению проницаемости клеток для наночастиц и активной работой макрофагов в легочной ткани, которые поглощают как микобактерии, так и окружающие наночастицы ДНА. Изучение биораспределения ДНА в организме здоровых и зараженных туберкулезом мышей и показано значительное в 2,5 раза увеличение максимального накопления ДНА в легочной ткани, что необходимо учитывать при разработке систем доставки лекарственных веществ на его основе. Гистологические исследования показали, что через 7 дней после введения ДНА наблюдается реактивная реакция основных органов на введения ДНА, которая впоследствии не обнаруживается на более поздних сроках нахождения частиц ДНА в тканях. Исследование тканей легких методом ПЭМ показало, что ДНА не вызывают ультраструктурных изменений клеток альвеолярного эпителия, не активируют альвеолярные макрофаги, располагающиеся на поверхности альвеолы. На самом раннем сроке эксперимента (7 дней) происходит активация эндотелия, которая выражается в формировании «ажурных мембран» эндотелиальных клеток, в повышении их проницаемости для эритроцитов, в появлении одиночных тромбоцитарных пластинок и явлений эритростаза. Наблюдается чёткая динамика изменения локализации наночастиц. На 7 дней эксперимента наночастицы выявляются в цитоплазме эндотелиальных клеток. Данная локализация наночастиц регистрируется и на более поздних сроках эксперимента (14 и 90 дней), но уже не является преимущественной. Через 14 и 30 дней – наночастицы встречаются не только в эндотелии, но и в интерстициальных гистиоцитах, через 90 дней – ещё встречается локализация наночастиц в эндотелиальных клетках, но преимущественной является локализация наночастиц в гистиоцитах. Через 180 дней эксперимента наночастицы не выявляются в эндотелии, их присутствие регистрируется только в интерстициальных макрофагах – гистиоцитах. При этом следует отметить, что на сроке эксперимента 90 дней выявляются конгломераты наночастицы, которые локализованы внутри гистиоцитарной цитоплазматической вакуоли и характеризуются меньшей электронной плотностью, по сравнению с ранее выявленными конгломератами. Данные признаки могут свидетельствовать о возможности выхода частиц из макрофагов-гистиоцитов или их деградации внутри макрофагов-гистиоцитов. Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод о возможности поглощения эндотелиальными клетками ДНА после их введения в кровь. Наночастицы преодолевают эндотелиальный барьер с последующей локализацией в гистиоцитах интерстициальной ткани лёгких. Возможность локализации наночастиц в интерстиции приводит к активации пула макрофагальных клеток, увеличению их присутствия в интерстициальной ткани и за счёт этого - к утолщению стенок альвеол. Изучение антибактериальной активности конъюгата ДНА-амикацин, показало, что для ряда больничных культур минимальная ингибирующая активность увеличивается в 2-4 раза (Staphylococcus aureus, Pseudomonas putida, Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes. В тестах на противотуберкулезную активность количество микобактерий уменьшалось конъюгата ДНА-амикацин и амикацин, между которыми не было статистически достоверных различий. Исследование цитотоксического действия препаратов на эукариотические клетки, проведенное на интактных МФ, показало, что лизис интактных МФ под воздействием препаратов ДНА-амикацин и амикацина в концентрациях 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 1 мкг/мл (по амикацину), достоверно не отличался от спонтанного, т.е. препараты не обладали цитотоксическим действием в исследованных концентрациях. В концентрации 5 мкг/мл лизис интактных МФ под воздействием амикацина также был на уровне спонтанного, а под воздействием ДНА-амикацин - достоверно выше спонтанного (на 40%), т.е. показана цитотоксичность наночастиц. Морфологическая картина культуры МФ через 1 и 2 суток после заражения МБТ не отличалась от интактных.. Через 3 суток после заражения (соответствует 2 дню лечения) в поле зрения видны погибшие клетки в виде фрагментированных остатков. Через 6 суток после заражения в поле зрения видны остатки погибших клеток. На месте погибших МФ визуализируются колонии микобактерий. Уровень лизиса на 6 сутки после заражения составил 91,64. Морфология культуры МФ, культивируемых с амикацином и ДНА-амикацин в отношении микобактерий туберкулеза концентрациях, визуально не отличалась и была подобна контрольной культуре инфицированных МФ. Морфологические отличия появлялись только при культивировании с препаратами в концентрации 5 мкг/мл, и выражались в большем числе жизнеспособных МФ, культивируемых с амикацином. Таким образом, показано, что в отношении МБТ ДНА-амикацин был менее активен по сравнению с амикацином как в модели in vitro, так и ex vivo. Выявлена тенденция ДНА-амикацин к протективной активности в отношении зараженных МФ. В отношении МБТ конъюгат ДНА-амикацин показал схожую активность как в модели in vitro, так выделенных инфицированных макрофагов из животных ex vivo.