Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Целью проекта является определение возможности управляемой деградации субмикронных носителей, путем варьирования толщиной его оболочки. В качестве подхода к созданию таких носителей, был использован метод последовательного адсорбции полимеров (LbL) из растворов на поверхность темплатных сферических частиц карбоната кальция различного размера, с последующим растворением последних. В качестве компонентов при конструировании капсул были использованы биодеградируемые материалы (BSA (бычий сывороточный альбумин), PVP (поливинилпирролидон), tannic acid (дубильная кислота), декстран сульфат (Dex), Parg (полиаргинин)). Для доказательства теории, что с помощью данных капсул можно обеспечить персонализированный подход путем использования альбумина конкретного пациента, одним из компонентов был выбран сывороточный альбумин человека (HSA). В ходе работы были получены носители со следующими варьируемыми параметрами: число бислоев (от 2 до 8), размером (100-200, 300-500 и 800-1000 нм) и составом полимеров (Parg/Dex, PVP/TA, BSA/TA и HSA/TA). Полученные носители были охарактеризованы посредством сканирующего электронного микроскопа, DLS и проточной цитометрии. Исследована морфология капсул в зависимости от разного количества слоев. Были исследованы размер/наличие/степень агрегации капсул в биологических жидкостях (физиологический раствор, сыворотка и кровь) в зависимости от количества слоев методом проточной цитометрии с визуализацией. Степень агрегации капсул увеличивалась в порядке увеличения количества слоев и в порядке: физиологический раствор <сыворотка <плазма <кровь. При образовании агрегатов, их размер не превышал размеров форменных элементов. Также отмечено, что стабильность частиц уменьшалась при уменьшении размера: 100-200 нм<300-500 нм< 800-1000 нм. В отношении состава оболочки, замечено более сильное взаимодействие носителей на основе BSA/TA, HSA/TA, и PVP/TA с белками плазмы и клетками крови по сравнению с оболочкой на основе Parg/Dex. Данные результаты можно объяснить наличием дубильной кислоты на внешнем слое данных носителей, способной связывать белки, в том числе находящиеся в плазме и крови человека. В отличие от декстрана, последнего слоя носителей Parg/Dex, обладающего отрицательным зарядом, что предположительно обеспечивает более слабое взаимодействие с клетками. В случае капсул, в состав которых входит дубильная кислота, более высокую способность связываться с белками и тем самым вызывать агрегацию, потенциально можно снизить путем предварительной инкубации с плазмой человека, которому будут введены данные носители. Для обеспечения наведения носителей в органах посредством градиента магнитного поля при получении носителей использовались наночастицы магнетита (МNP). MNP были синтезированы с использованием метода химического осаждения, как описано выше. Средний размер 10 нм определяли с использованием метода DLS и изображений TEM. Для увеличения загрузки MNP нами был разработан метод FIL [Sergei V. German, Marina V. Novoselova, et all. High-efficiency freezing-induced loading of inorganic nanoparticles and proteins into micron- and submicron-sized porous particles. Scientific Reports, 2018], который состоял из последовательной циклической загрузки частиц MNP и окрашенного красителем бычьего сывороточного альбумина в частицы ватерита. После получения частиц на их поверхности сформировалась cсоответствующая оболочка (BSA/TA), (PVP/TA), (HSA/TA) или (Parg/Dex). Так, для дальнейших исследований были получены носители со следующими варьируемыми параметрами: число бислоев (от 2 до 8), размером (100-200 нм, 300-500 нм, 800- 1000 нм) и составом полимеров: 2,4,6 и 8- ми бислойные носители MNPs+BSA-Cy7(Parg/Dex) размерами 100-200, 300-500 и 800-1000 нм; 2,4,6 и 8-ми бислойные носители MNPs+BSA-Cy7(PVP/TA) размерами 100-200, 300-500 и 800-1000 нм; 2,4,6 и 8-ми бислойные носители MNPs+BSA-Cy7(BSA/TA) размерами 100-200, 300-500 и 800-1000 нм; 2,4,6 и 8-ми бислойные носители MNPs+BSA-Cy7(HSA/TA) размерами 100-200, 300-500 и 800-1000 нм. Несмотря на включение в состав достаточного количества (0,21 мг) красителя, спектры флуоресценции исходных образцов показывают, что капсулы практически не флуоресцируют. Возможно, это связано эффектом «тушения», опосредованным взаимодействием красителя с частицами магнетита, а также с самой оболочкой [Yu, C. J., Wu, S. M. & Tseng, W. L. Magnetite nanoparticle-induced fluorescence quenching of adenosine triphosphate - BODIPY conjugates: Application to adenosine triphosphate and pyrophosphate sensing. Anal. Chem. 85, 8559–8565 (2013)]. Так, известно, что дубильная кислота также гасит молекулу BSA [Soares, S.; Mateus, N.; De Freitas, V. Interaction of different polyphenols with Bovine Serum Albumin (BSA) and Human Salivary -Amylase (HSA) by fluorescence quenching. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 6726–6735.] и этим можно объяснить более высокую интенсивность флуоресценции для капсул на основе Parg/Dex (в которой гаситель в формуле один – это частицы магнетита). Предыдущие исследования по использованию MNP в качестве гасителей флуоресценции редки. Было показано, что покрытые цитратом NP Fe3O4 способны взаимодействовать с молекулами доксорубицина посредством электростатического притяжения, тем самым подавляя их флуоресценцию. Для подтверждения этой теории интенсивность флуоресценции на примере капсул MNPS(BSA-Cy7/ТA) и (BSA-Cy7/TA), а также BSA-Cy7 и чистый Cy7-краситель (в качестве контролей) сравнивали после инкубации на 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 16, 24 часов в физиологическом растворе, крови и плазме. Для капсул сравнивали спектры флуоресценции суспензий и полученных супернатантов. Была исследована флуоресценция (построены спектры флуоресценции) полученных носителей в воде, солевом растворе, плазме в различные промежутки времени. Был обнаружен и исследован эффект «тушения» капсул, опосредованным взаимодействием красителя с частицами магнетита, а также с самой оболочкой. Показано, что данный эффект носителей можно использовать как индикатор разрушения частиц, в особенности при проведении исследований in vivo (изменение сигнала флуоресценции в данном случае будет служить индикатором степени разрушения оболочки под действием ферментов). Для того, чтобы оценить кинетику деградации капсул различного размера, состава и толщины, опосредованной различным количеством слоев оболочек, 10000 капсул каждого вида инкубировали при 37С в солевом растворе, плазме, крови и ферментами: пепсином (на графиках условия обозначены ка «gut») и панкреатином (на графиках условия обозначены как «intestine»). Интенсивность флуоресценции оценивали до, через 1, 5, 12, 24, 36, 48, 72 и 96 часов инкубации с помощью флуоресцентного томографа IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). Все капсулы были достаточно стабильны в физиологическом растворе, и краситель был прочно связан в оболочке. Однако, когда образцы инкубировали с плазмой и кровью, наблюдалось постепенное увеличение флуоресценции образцов. Можно отметить влияние количества слоев на кинетику высвобождения, которое прямо пропорционально количеству слоев. Наиболее выраженный эффект для всех типов капсул можно отметить после инкубации с раствором панкреатина. Так, степень разрушения капсул увеличивалась в ряду: солевой раствор <кровь <плазма ≤ раствор пепсина ≤ раствор панкреатина. Полученные результаты позволяют отметить, что профили деградации для капсул, образованных посредством водородных взаимодействий (BSA/TA, HAS/TA и PVP/TA) похожи. Наиболее выраженный эффект раствора панкреатина замечен для капсул, образованных за счет электростатических взаимодействий, на основе Parg/Deх. Далее, в качестве тестового эксперимента мы исследовали эффективность этих субмикронных капсул в качестве адресуемого носителя в сочетании с наночастицами магнетита при системном внутривенном введении. Исследования распределения носителей в органах в условиях приложения внешнего магнитного поля к одному из бедер животного (слева) показали, что носители накапливались в основном в легких. Замечено, что в лапе, помещенной в магнитное поле, концентрация носителей была на 70% выше, чем в неадресной лапе. Кроме того, системная токсичность этого носителя для внутривенного введения была подробно изучена. Были изучены острые эффекты внутривенных инфузий капсул MNPs (BSA / TA) на гемодинамические показатели, гемостаз, дыхательную систему, сердечно-сосудистую систему, функцию почек и печени. Результаты показали, что носители (BSA / TA) в представленных дозах были гемосовместимыми и не оказывали значительного влияния на дыхательную систему, функцию почек и печени. Сочетание управляемого биораспределения субмикронных носителей с помощью градиентного магнитного поля и мультимодальной визуализации in vivo дает нам новую возможность улучшить концепцию персонализированной медицины на основе адресной и контролируемой доставки лекарств.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью следующего этапа было перейти от «модельных капсул» с меченным белком к исследованию эффективности загрузки терапевтических агентов (в нашем случае доксорубицина). Для этого были подобраны эффективные для каждого типа частиц методы инкапсуляции. Так, наиболее подходящим методом загрузки доксорубицина в 300-500 нм и 1 мкм частиц стал ИКА метод. В связи с возникшими трудностями загрузки доксорубицина в частицы, полученные по методике на основе желатина, был подобран новый метод синтеза 100-200 нм частиц, для которых наиболее эффективным способом загрузки оказался метод адсорбции. Далее на основе полученных частиц были созданы капсулы, загруженные доксорубицином со следующими варьируемыми параметрами: число бислоев (от 2 до 8), размером (100-200 нм, 300-500 нм, 1000 нм) и составом полимеров: - 2,4,6 и 8- ми бислойные носители (Parg/Dex) размерами 300-500 и 1000 нм - 2,4,6 и 8-ми бислойные носители (PVP/TA) размерами 300-500 и 1000 нм - 2,4,6 и 8-ми бислойные носители (BSA/TA) размерами 100-200 (core-shell), 300-500 и 1000 нм - 2,4,6 и 8-ми бислойные носители (HSA/TA) размерами 100-200 (core-shell), 300-500 и 1000 нм. Полученные носители были охарактеризованы посредством сканирующего электронного микроскопа, DLS, NTA NanoSight. Исследована морфология капсул в зависимости от разного количества слоев. Агрегативная устойчивость полученных образцов была сопоставима с результатами, полученными в случае с инкапсулированным белком. Для полученных образцов была определена кинетика выхода цитостатика при инкубации в воде и PBS. Отмечено, что интенсивность выхода цистостатика была более высокая по сравнению с образцами с белком на первом году реализации проекта вследствие более низкой молекулярной массы вещества. Интенсивность выхода вещества была обратно пропорциональна количеству слоев и размеру носителя. Так же заметен более интенсивный свободный релиз из капсул Parg/Dex и PVP/TA, оболочки который являются более тонкими, по сравнению с BSA/TA и HSA/TA. При проведении исследований на фибробластах и клетках карциномы толстой кишки была определена эффективность интернализации полученных частиц и влияние их состава на время деградации. Показано, что эффективность интернализации (поглощения) капсул клетками была обратно пропорциональна размеру капсул. Для капсул размером 100-200 нм она составила в среднем 96,1±1,07%; 300-500 нм – 84,6±1,77%; 1мкм- 68,35±4,53%. При анализе деградации различных капсул отмечено следующее: 1) Скорость деградации в клетках была пропорциональна количеству слоев в оболочке, а также размеру самих частиц. 2) капсулы на основе Parg/Dex разрушались в клетках медленнее по сравнению с капсулами на основе BSA/ТА, HSA/TA и PVP/TA, и продолжительный период времени сохраняли свою структуру. 3) Небольшое количество даже 2-бислойных капсул Parg/Dex можно было наблюдать в клетках после 5 дней инкубации, в то время как разрушение структур 2-бислойных капсул на основе BSA/TA, PVP/TA и HSA/TA отмечали уже после 48-72 ч. 4) 8- бислойные капсулы оказались достаточно устойчивые к деградации внутриклеточными ферментами клеток и достаточное их количество в клетках можно наблюдать даже после окончания срока наблюдения (7 дней). Далее была исследована цитотоксичность капсул различного состава частиц с доксорубицином на клетках: фибробластах и карциномы толстой кишки. Эффективность капсул была обратно пропорциональна их размеру. Капсулы размером 100-200 нм и 300-500 нм оказались наиболее эффективными в отношении клеток карциномы толстой кишки. В определенные промежутки времени эффект от данных капсул был выше, чем от свободно доксорубицина. Капсулы на основе Parg/Dex разрушаются, и тем самым проявляют свою эффективность медленнее по сравнении с другими капсулами, но поскольку эта оболочка более тонкая, выход через оболочку (за счет диффузии) на первых промежутках времени более высокий. Капсулы на основе PVP/TA разрушаются быстрее, чем Parg/Dex и при этом выход через оболочку (за счет диффузии) на первых промежутках времени также достаточно высокий. Для капсул на основе BSA/TA и HSA/ТА характерна более быстрая деградация и более медленный релиз на первых промежутках времени по сравнению с капсулами на основе Parg/Dex и PVP/TA. При анализе влияния количества слоев на деградацию полученных структур и, следовательно, на эффективность их действия на клетки можно отметить следующее: 1) эффект был обратно пропорционален количеству слоев; 2) для 2-бислойных капсул более выраженный цитотоксический эффект в среднем возникает на 3,4 сутки, для 4-бислойных капсул – на 4-5, для 6 – на 6-7; 3) 8-бислойные капсулы оказались достаточно плотными структурами, и возможности МТТ теста не позволили отменить момент их деградации, поэтому заметен только небольшой эффект скорее всего связанный с диффузией вещества через оболочку. В результате, на основе полученных исследований были разработаны «коктейли» носителей (смеси капсул с различными параметрами), позволяющие обеспечивать пролонгированный выпуск определенной дозы доксорубицина. Получены смеси, каждый вид частиц в которой был связан с определенным красителем (Су3, Су5 и Су7), а также загружен в избытке частицами магнетита (для детектирования in vivo момента разрушения каждого вида частиц в смеси) для продолжения тестирования терапевтического эффекта и биораспределения in vivo.