Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе реализации проекта было синтезировано 18 водорастворимых порфиринов и порфириноидов с катионными и анионными заместителями, а также их металлокомплексы, проведена геометрическая оптимизация исследуемых структур в рамках теории функционала плотности в приближении B3LYP с базисным набором 6-31++G(d,p) в программном пакете Gaussian. Впервые получены водорастворимые цинковые комплексы инвертированных тетрасульфофенилпорфиринов. Проведены исследования фотостабильности и способности к генерации синглетного кислорода полученных соединений в среде изотонического буферного раствора с рН 7.4. Оценка способности полученых соединений генерировать синглетный кислород проведена путем мониторинга фоторазложения пиридоксина. Пиридоксин и его производные (Витамин В6) является важным ко-фактором во многих ферментативных реакциях, главным образом в метаболизме аминокислот. Облучение раствора пиридоксина белым светом с отсекающим светофильтром λ< 500 нм не вызывает никаких видимых изменений в его спектре по крайней мере в течение 1 часа. Во всех случаях фотосенсибилизированное окисление пиридоксина контролировали по снижению поглощения в максимуме при 323 нм. Наблюдаемые константы скорости фоторазложения (kobs) были рассчитаны из линейных начальных участков зависимости ln (A0/A) от времени облучения в программном пакете ORIGIN методом наименьших квадратов. Проведенные исследования показали, что фотодеградация пиридоксина происходит только в случае цинковых и оловянных комплексов порфиринов. В присутствии комплексов кобальта пиридоксин остается стабильным в течение всего время облучения, а цинковые комплексы инвертированных порфиринов сами являются крайне нестабильными при облучении. В результате обработки кинетических зависимостей, полученных из данных фоторазложения пиридоксина под действием порфиринов-фотосенсибилизаторов, были определены наблюдаемые константы скорости kobs. Методами спектрофотометрического и флуориметрического титрования, рН-метрии и квантовой химии было выполнено сравнительное исследование равновесий образования аксиальных комплексов полученных порфиринатов металлов с малыми органическими субстратами. Для исследования процессов с участием синтезированных водорастворимых металлокомплексов порфиринов и порфириноидов был использован разработанный нами ранее спектропотенциометрический метод с синхронной регистрацией электронных спектров поглощения, флуоресценции и рН. В качестве субстратов исследования аксиальной координации на металлопорфиринах в водной среде нами были выбраны следующие органические основания: пиридин (Py), имидазол (Im), N-метилимидазол (MeIm), гистамин (Hist), цистеамин (Cys), глутатион (Gly), теофиллин (Theo), аденин (Ade), гуанин (Gua) и никотиновая кислота (NA). В ходе эксперимента было обнаружено, что исследованные катионные порфиринаты цинка связывают органические основания достаточно слабо, для протекания реакции требовались значительные добавки лиганда. Кроме того, было обнаружено, что даже незначительные количества добавляемого субстрата существенно увеличивают рН растворов. С целью исследования влияния рН среды на водорастворимые порфиринаты цинка было проведено исследование взаимодействий растворов ZnP(4'-MePy)4, ZnP(3'-MePy)4 и ZnP(2'-MePy)4 с гидроксид-ионом в воде. Обнаружено, что в водных растворах, в условиях большого избытка молекул растворителя, способного координироваться на центральном ионе металла, возможно существование гексакоординированных аксиальных комплексов порфиринатов цинка с двумя молекулами воды. Последовательное защелачивание растворов приводит к замещению сначала одной, а затем и второй молекулы воды на гидроксид-анион. Последовательное присоединение ОН- -анионов подтверждают и данные квантово-химических расчетов. Рассчитаны значения энтальпий образования аксиальных комплексов исследованных порфиринатов цинка с водой и гидроксид-анионом в газовой фазе методом DFT B3LYP 6-31G(d,p), а также констант устойчивости моно- и дигидроксокомплексов исследованных порфиринатов цинка из экспериментальных данных. Полученные значения хорошо согласуются с данными расчета. Исследования, проводившиеся в буферных растворах, показали, что буферной емкости недостаточно для тех добавок оснований, которые требуются для изучения процессов координации малых молекул на порфиринатах цинка в водных средах. Исследования взаимодействия порфирината олова SnP(4'-MePy)4 с цистеамином показало, что в данном случае протолитические равновесия двух аксиально-связанных гидроксо-групп, которые наблюдаются при изменении рН раствора, являются преимущественными. Учитывая полученную информацию, в качестве объектов исследования образования комплексов с металлопорфиринами с целью создания систем доставки лекарственных препаратов и новых коньюгатов, обладающих терапевтическими свойствами, нами были выбраны водорастворимые квантовые точки (QD). Конъюгация квантовых точек с порфириновым сенсибилизатором позволит управлять свойствами обеих частиц, позволяя создавать более эффективные препараты с настраиваемыми характеристиками. Было проведено исследование образования синтезированных катионных металлокомплексов порфиринов с водорастворимыми квантовыми точками AIS/ZnS/GSH состоящих из ядра AgIn, оболочки ZnS и связанных с ней через тиольную группу молекул глутатиона в качестве амфифильных лигандов, обеспечивающих растворимость и агрегационную устойчивость квантовых точек в воде за счет диссоциации концевых карбоксильных групп. В результате прямого титрования квантовых точек AIS/ZnS/GSH тетракатионами исследованных порфиринатов металлов и их обратного титрования квантовыми точками AIS/ZnS/GSH было обнаружено двухступенчатое взаимодействие, которое в итоге приводит к полному тушению фотолюминесценции квантовых точек. На первом этапе образуется электростатический комплекс QD/MP(MePy)4 в результате. Взаимодействия отрицательно заряженной поверхностью квантовых точек и положительно заряженными тетракатионами порфиринатов металлов. Далее образуется финишный коньюгат QD/МР(MePy)4 в результате дополнительной аксиальной координации глутатиона на центральных ионах металлов порфиринатов МР(MePy)4. Дальнейшее добавление квантовых точек приводит к разгоранию их собственной флуоресценции за счет образования несвязанных QD в растворе. В случае порфиринатов кобальта удается добиться полного тушения флуоресценции коньюгатов за счет отсутствия собственной флуоресценции кобальтовых комплексов порфиринов. В случае порфиринатов цинка и олова коньюгаты обладают собственными спектрами флуоресценции, интенсивность и положение максимумов которых можно варьировать, в зависимости от соотношения QD/MP в составе коньюгата. Проведенные исследования фоторазложения пиридоксина показали, что коньюгаты QD/MP способны к генерации синглетного кислорода, причем эта способность, вероятно, зависит от состава комплекса. Для перехода к исследованиям механизмов образования, строения, устойчивости и спектральных свойств супрамолекулярных коньюгатов на основе сульфопроизводных тетрафенилпорфирина и инвертированного тетрафенилпорфирина с различными комбинациями заместителей методами синхронного UV-Vis - флуориметричекого - рН титрования исследованы равновесия дипротонирования метилированной инвертированной платформы тетрааниона 2-N-метил-5,10,15,20-тетракис-(4′-сульфонатофенил)-2-аза-21-карбапорфина HMeIP(4'-PhSO3H)4 хлорной кислотой в воде и самосборка H- и J-агрегатов. Метилирование инвертированного пиррольного кольца H2IP(4'-PhSO3H)4. позволяет зафиксировать таутомерную форму HMeIP(4'-PhSO3H)4 с внешним NH-протоном. На первой ступени протонирования платформы HMeIP(4'-PhSO3H)4. происходит смена типа бифуркатных внутримолекулярных водородных связей с NHN на HNH. На второй ступени протонирования они разрушаются и образуются межмолекулярные водородные связи с молекулами растворителя. Дипротонированная платформа H3MeIP2+(4'-PhSO3H)4 имеет геометрию упругого 1,3-альтерната, который обладает свойствами молекулярного и анионного рецептора. Равновесие второй ступени протонирования в воде полностью сдвинуто к аквакомплексу [H3MeIP2+(4'-PhSO3H)4](H2O)2, который образуется за счет водородного и электростатического связывания молекул растворителя в двух сайтах рецептора. Метилирование и инвертирование пиррольного кольца приводит к росту протонного сродства HMeIP(4'-PhSO3H)4 и отменяет феномен синхронного дипротонирования порфириновой платформы в исходном H2P(4'-PhSO3H)4,обусловленный образованием более прочного аквакомлекса [H4P2+(PhSO3-)4](H2O)2. Исходный тетраанион HMeIP(4'-PhSO3H)4 и аквакомплекс [H3MeIP2+(4'-PhSO3H)4](H2O)2 представляют собой мономеры самосборки хиральных H и J-агрегатов. Движущей силой образования H-агрегатов является ионная самосборка с участием сульфонатных групп мономеров и фоновых катионов-спейсеров. Движущей силой самосборки J-агрегатов является образование более прочных анионных комплексов в результате межмолекулярного замещения молекул воды в [H3MeIP2+(4'-PhSO3H)4](H2O)2 сульфонатными группами мономеров. Результаты исследования опубликованы в статье (V.B. Sheinin, O.M. Kulikova, O.I. Koifman. Invertion and methylation of pyrrole ring in tetrasulfophenylporphyrin: basicity, aggregation properties, chirality. J. Mol. Liq., 2019, 277, 397-408) и тезисах докладов международных конференций.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе реализации проекта были получены супрамолекулярные наноразмерные органо-неорганические наноконьюгаты водорастворимых металлопорфиринов с полупроводниковыми квантовыми точками и наночастицами коллоидного золота. Методами синхронного спектрофотометрического, флуориметрического и потенциометрического титрования, спектроскопии кругового дихроизма, и компьютерного моделирования проведено исследование строения макроциклических комплексов металлов с квантовыми точками, а также гибридных супрамолекулярных агрегатов на основе полученных водорастворимых металлокомплексов порфиринов. Исследованы и оптимизированы условия образования, строение, стабильность и спектральные свойства гибридных супрамолекулярных систем, собирающихся за счет различных типов нековалентных взаимодействий. Изучена фотостабильность полученных систем, их способность к генерации синглетного кислорода в условиях, близких к физиологическим. При электростатическом взаимодействии коллоидных наночастиц Au30900/Cit с цинковым комплексом 5,10,15,20-тетракис(4'-N-метилпиридил)порфина друг за другом образуются два различных наноконьюгата постоянного состава со спектрами поглощения отличными от спектров исходных реагентов. Образование первого более прочного соединения, сопровождается падением интенсивности и красным сдвигом полос Соре и ППР коньюгированных реагентов, которые сохраняют свою спектральную идентичность. Образование второго коньюгата сопровождается ростом интенсивности полосы Соре, в то время как полоса ППР практически не меняется. Высказано предположение о том, что первым образуется наноконьюгат только с одним тетракатионом, который понижает способность наночастицы к дальнейшей коньюгации. Решение вопроса о стехиометрическом составе полученных наноконьюгатов требует дополнительных исследований по определению аналитических значений коэффициентов экстинкции наночастиц AuNС/Cit с ядром Au30900, в том числе с использованием оптических порфириновых зондов. Молярный коэффициент экстинкции коллоидного раствора наночастиц Au/Cit c большим ядром, вычисленный по формуле для истинного молекулярного раствора не подходит для определения реальной стехиометрии этих наноконьюгатов. Определение аналитических значений коэффициентов экстинкции больших наночастиц Au/Cit требует нового подхода. Оптические порфириновые зонды являются перспективными аналитическими реагентами для решения этой задачи. Впервые полученные хиральные Н-агрегаты водорастворимого инвертированного тетрасульфофенилпорфирина, которые демонстрируют интенсивное расщепление в спектрах КД, с выраженной амплитудой экситонных куплетов. Переход к агрегатам J-типа в данном случае происходит при более высоких нейтральных значениях рН, по сравнению с неинвертированным тетрасульфофенилпорфирином. Было проведено исследование хиральности наноконьюгатов металлокомплексов тетраметилпиридил порфирина с золотыми наночастицами. Анализ спектров КД показал отсутствие хиральности в подобных структурах даже при использовании полисахаридного темплата (альгината натрия). В данном случае решением будет подбор подходящего полисахарида в качестве темплата, либо порфиринового компонента наноконьюгата, изначально обладающего хиральностью. Также планируется использовать порфириновые коньюгаты, исследование которых показало возможность получения оптически активных структур и эффективного управления их хиральностью, однако это предмет будущих исследований. Исследование было направлено на конструирование органо-неорганических наноконьюгатов, образованных за счет нековалентных взаимодействий, и обладающих свойствами системы «выкл/вкл». В настоящее время проводятся исследования фотофизических свойств квантовых точек и их комплексов с фотосенсибилизаторами в водных растворах, однако существует еще очень мало данных по их стабильности, способности к образованию синглетного кислорода и даже строению. В данной работе было проведено исследование образования наноконьюгатов синтезированных катионных и анионных металлокомплексов порфиринов с водорастворимыми квантовыми точками AIS/ZnS/GSH, AIS/GSH и AIS/ZnS/PEI. В текущем отчетном периоде было продолжено исследование образования наноконьюгатов квантовых точек AIS/ZnS/GSH с металлопорфиринами. В качестве соединения сравнения для подтверждения электростатической природы образующихся на начальном этапе коньюгатов нами были выбраны анионные ZnP(4'-PhSO3H)4 и ZnP(4'-PhSO3H)3(4'-PyMe+I-). В рН нейтральном растворе, положительные заряды протонированных аминогрупп глутатиона лигандной оболочки полностью скомпенсированы в цвиттерионной паре глутаминового фрагмента. По этой причине анионы ZnP4– и ZnP3- не взаимодействуют с глутатионовой лигандной оболочкой квантовых точек, которая в целом имеет суммарный отрицательный заряд. Тетракатион ZnP(n'-MePy)44+ быстро находит открытую грань квантовой точки и хемосорбируется на ее поверхности, образуя коньюгат (QDn-)-ZnP4+. Это взаимодействие протекает необратимо с очень высокой скоростью уже в момент добавления титранта. Образование (QDn-)-ZnP4+ сопровождается обоюдным тушением люминесценции реагентов, красным сдвигом полос в спектрах поглощения и снижением интенсивности поглощения ZnP4+ относительного исходного (H2O)ZnP4+ Поглощение коньюгата (QDn-)-ZnP4+ представляет собой суперпозицию исходного спектра QDn- и спектра ацидокомплекса (≡S-)-ZnP4+, лежащего на поверхности грани SH квантовой точки (падение интенсивности поглощения и люминесценции). Возможность образования альтернативного тиолатного комплекса с глутатионом-лигандом было опровергнуто отрицательным тестом на взаимодействие ZnP(4'-MePy)4 с избытком свободного глутатиона в водном растворе. Кроме того, для сравнения был проведен эксперимент с CuP(4'-MePy)4, металлопорфирином, не склонным к аксиальной координации. В результате было обнаружено взаимодействие, которое в итоге приводит к полному тушению фотолюминесценции квантовых точек. Сильное смещение максимума поглощения (с 425 нм до 435 нм) происходит благодаря расположению порфирина на поверхности грани квантовой точки за счет π-π-стэкинга. Проанализировать взаимодействие порфиринатов металлов с квантовой точкой можно используя метод Бенеши-Гильдебранд. Были расчитаны кажущиеся константы ассоциации комплексов. К значению Ka следует относиться с осторожностью, поскольку квантовая точка имеет множественные сайты связывания для молекул металлопорфирина, а также не установленная точно стехиометрия и заселение лигандной оболочки квантовой точки препятствуют определению абсолютного значения Ka и стехиометрии образующегося комплекса. Однако достаточно большая величина Ka показывает, что комплексообразование между металлопорфирином и квантовой точкой довольно сильное и что его можно достичь в относительно разбавленных растворах. Квантовые точки AIS/GSH состоят из ядра AgInS, и связанных через тиольную группу молекул глутатиона в качестве амфифильных лигандов, обеспечивающих растворимость и агрегационную устойчивость квантовых точек в воде за счет диссоциации концевых карбоксильных групп. Водный раствор квантовых точек AIS/GSH характеризуется монотонным спектром поглощения и максимумом фотолюминесценции при 600 нм. В отсутствие оболочки ZnS, адсорбция металлопорфирина происходит непосредственно на поверхности QD, образование (QDn-)-MP4+ сопровождается более сильным красным сдвигом полос в спектрах поглощения, большим снижением интенсивности поглощения MP4+ и полным затуханием флуоресценции, как квантовой точки, так и металлопорфирина Для исследования функции «включения» флуоресценции, к финишному коньюгату QD/MP, в котором флуоресценция обоих компонентов «выключена», был добавлен раствор тиамина. Более известный как витамин B1, тиамин играет важную роль в процессах метаболизма углеводов, жиров и белков. Вещество необходимо для нормального роста и развития и помогает поддерживать надлежащую работу сердца, нервной и пищеварительной систем. Тиамин, являясь водорастворимым соединением, не запасается в организме и не обладает отравляющими свойствами. При добавлении раствора тиамина к раствору финишного наконьюгата удалось восстановить интенсивность флуоресценции практически до значений флуоресценции свободного порфирина Подобную систему можно рассматривать в качестве прототипной модели систем «выкл/вкл» для адресной доставки фотосенсибилизаторов. Были расчитаны кажущиеся константы ассоциации комплексов. Квантовые точки AIS/GSH/PEI состоят из ядра AgInS, оболочки ZnS и связанных через тиольную группу молекул полиэтиленимина (PEI) в качестве амфифильных лигандов, обеспечивающих растворимость и агрегационную устойчивость квантовых точек в воде за счет диссоциации концевых амино групп. Полиэтиленимин представляет собой гидрофильный полимер, содержащий первичные, вторичные и третичные аминогруппы, обеспечивающие общий положительный заряд наночастицы. Для обеспечения начальной электростатической пристыковки к положительно заряженной лигандной оболочке был выбран тетраанион ZnP(4'-PhSO3H)44- Исследования фотостабильности и генерации синглетного кислорода проводили в среде изотонического буферного раствора с рН 7.4 в стандартной 1 см оптической кювете при постоянном перемешивании и температуре 25оС. Учитывая потенциальное применение металлокомплексов порфиринов и их коньюгатов с нанокристаллами в качестве фотосенсибилизаторов PDT, мы провели качественную оценку способности этих соединений генерировать синглетный кислород путем мониторинга фоторазложения пиридоксина. Во всех случаях фотосенсибилизированное окисление пиридоксина контролировали по снижению интенсивности полосы поглощения с максимумом при 323 нм. Наблюдаемые константы скорости фоторазложения (kobs) были рассчитаны из линейных начальных участков зависимости ln (A0/A) от времени облучения в программном пакете ORIGIN методом наименьших квадратов. Связывание порфиринового фрагмента с наночастицей существенно влияет на оптический отклик обоих компонентов. При облучении системы, содержащей только AuNP либо AgInS/GSH, фоторазложения пиридоксина при облучении не наблюдается Однако было показано, что коньюгаты AgInS/GSH/МР и AuNP/МР способны к генерации синглетного кислорода. В результате обработки кинетических зависимостей, полученных из данных фоторазложения пиридоксина под действием порфиринов-фотосенсибилизаторов и их наноконьюгатов, были определены наблюдаемые константы скорости kobs. Меняя соотношение компонентов в наноконьюгате можно изменять его способность к генерации синглетного кислорода, что наглядно показано на примере коньюгатов AgInS/GSH/ZnT(4-MePy+)4 Современные методы визуализации нанообъектов не могут показать тонкое строение поверхности коллоидных квантовых точек in situ и образования их наноконьюгатов с молекулами металлопорфирина. В нашей работе эта задача решалась в два этапа. Вначале, на основании имеющихся экспериментальных данных, методами компьютерной химии была построена размерно-пропорциональная 3D модель поверхности QDs AIS/ZnS/GSH. Затем методом синхронного спектрофотометрического и флуориметрического титрования c рН-контролем было проведено сравнительное исследование поверхности AIS/ZnS/GSH в воде с помощью функционализированных оптических порфириновых зондов. В нашей работе эта задача решалась в приближении компьютерной химии. Для построения размерно-пропорциональной модели поверхности квантовой точки AIS/ZnS/GSH был использован метод ММ+, геометрия металлокомплексов порфиринатов цинка была оптимизирована в рамках теории функционала плотности DFT B3LYP 6-21G(d,p).