Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Было проведено сравнение уровней экспрессии генов для цитокинов и хемокинов в образцах легочной ткани, полученных во время хирургического вмешательства, у двух групп больных с туберкуломой и фиброзно-кавернозным туберкулезом, а также сравнение этих показателей в самом очаге (стенка каверны или туберкуломы) и в сравнительно здоровой части легочной ткани, попавшей в резекционный материал. Биопсия была проведена у 16 оперированных больных фиброзно-кавернозным туберкулезом и 16 больных с туберкуломами. Методом TaqMan qRT-PCR анализировали следующие медиаторы воспаления: IL1b, IL6, IL8, IL11, IL12, IL17, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Ccl3, IFNg, TNFa, csf3, mmp9, используя уровень экспресс гена gapdh в качестве стабильного контроля. Результаты статистически анализировали с помощью системы GraphPad Multiple t-tests. Наибольшая разница в уровне экспрессии генов касалась сравнения "стенка каверны - паренхима того же легкого" и относилась к наиболее важным аттрактантам нейтрофилов: экспрессия генов для Cxcl1 (p ≤ 0.03), Cxcl2 (p ≤ 0.01), IL6 (p≤0.0001) и IL8 (p ≤0.01) была достоверно выше в окружающей каверну легочной ткани по сравнению с многослойной стенкой каверны. Таким образом, для ткани, прилегающей к каверне, характерно сопутствующее воспаление с постоянным привлечением нейтрофилов - важнейшего фактора патогенеза туберкулезной инфекции. Тяжесть течения этой формы туберкулеза, вероятно, обусловлено не только фиброзом и распадом ткани в самом очаге (каверне), но и привлечением мало эффективных для борьбы с микобактериями нейтрофилов, конкурирующих за фагоцитоз микобактерий с более эффективными макрофагами. Было получено 48 самок гибридов F1 между линиями 9.3.19.8 (конгенная по МНС-II c B6, IE-отрицательная, H2-IA аллель j) и B6 (IE-отрицательная, H2-A аллель b). Эти мыши были заражены туберкулезом (аэрозоль, 500 КОЕ на мышь) и через неделю им перенесли внутривенно очищенные на магнитных бусах иммунные (иммунизация 10мкг/мл ультразвуковым дезинтегратом микобактерий в неполном адъюванте Фрейда) клетки CD4+ от мышей В6 и 9.3 (чистота выделения клеток - 97-98%). Контролем служили гибриды F1 (9.3 х В6), которым не переносили клеток. Определение количества микобактерий в органах мышей через 1 и 3 месяца после заражения показало, что однократный перенос иммунных Т-клеток не изменяет темп размножения микобактерий в органах Группы мышей не отличались ни по популяционному составу клеток иммунной системы в легких, ни по срокам выживания. Таким образом, данная схема адаптивного переноса не выявляет различий между способностью Т клеток от доноров с разными аллелями класса II влиять на развитие заболевания. Полученные данные не опровергают результаты, полученные на культурах зараженных макрофагов и иммунных Т клеток, но ясно показывают, что для получение значимых эффектов in vivo требуются более сильные вмешательства. Вероятно, для получения подобного эффекта нужны неоднократные переносы, что делает эксперименты чрезвычайно дорогими. Было установлено, что адоптивный перенос DCreg зараженным ТБ мышам генетически чувствительной линии I/St способен индуцировать увеличение популяции Treg в ткани легкого. Увеличение пула Treg приводит к ослаблению туберкулезной легочной патологии, замедлению размножения микобактерий в органе и снижению инфильтрации ткани легкого нейтрофилами, то есть к избирательному снижению количества именно тех иммуноцитов, которые считаются основным фактором патогенеза при ТБ генетически чувствительных животных. Основным отличием в характере легочной патологии было отсутствие у реципиентов DCreg очагов деструкции легочной ткани и зон некроза, которые обнаруживались в контрольной группе. Хотя терапевтический эффект переноса клеток был умеренным, наши результаты можно рассматривать как доказательство действенности клеточной терапии для регуляции воспаления легочной ткани при ТБ. Ранее нами было показано, что сконструированный штамм M. tuberculosis, у которого генетически выключены 4 из пяти генов, кодирующих белки семейства Rpf (ΔACDE), имеет сильно сниженную вирулентность и медленно размножается in vivo. Мы использовали этот штамм для заражения чувствительных к туберкулезу мышей I/St и более резистентных мышей В6 и оценили ключевые параметры легочной патологии, воспаления и иммунного ответа в моделях хронической и реактивационной инфекции. Прогрессирующий рост микобактерий ΔACDE был отмечен только в легких мышей I/St, тогда как в легких мышей B6 количество КОЕ постепенно снижалось. При этом, конденсированные туберкулезные очаги в легких мышей B6 появлялись уже на 4-й неделе после заражения, тогда как у мышей I/St их образование задерживалось. На поздней фазе инфекции в легких мышей I/St очаги сливались, приводя к развитию интенсивной пневмонии, а у мышей В6 они оставались конденсированными и воспаление было ограниченным. Характерным были отличия в притоке в легкое нейтрофилов и макрофагов как на ранней, так и на поздней фазе инфекции: больше нейтрофилов присутствовало в легких мышей I/St, а больше макрофагов - в легких B6. Экспрессия генов хемокинов, регулирующих приток нейтрофилов, была выше в легких мышей I/St. Напротив, на ранней и поздней фазах инфекции у мышей B6 в легких был выше уровень регуляторов воспаления IFN-γ, IL-6 и IL-11. В целом, с помощью новой модели инфекции с очень медленным развитием мы выявили три важных признака плохого контроля за развитием туберкулезного процесса: усиленный приток нейтрофилов в легочную ткань, задержку в образовании ранних гранулем и слияние очагов, приводящее к разлитой пневмонии, на поздней фазе инфекции.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Полностью охарактеризована динамика иммунного ответа на туберкулезную инфекцию (ТБ) и воспаления легочной ткани у мышей линий В6 и 9.3, отличающихся только по аллелю классического гена МНС класса II - H2-A-бета. У более резистентных мышей В6 на всех фазах развития инфекционного процесса в легкие постоянно приходит и остается больше T-клеток CD4+, считающихся одним из важнейших факторов защиты от инфекции и главными активаторами зараженных макрофагов. Обширное диффузное воспаление у мышей 9.3 на поздних фазах инфекции затрудняет приход в орган иммунных Т-клеток CD4+ из кровотока, популяция рано пришедших клеток долго не обновляется, и в очаге инфекции приобретает избыточно активированный фенотип, что ведет к гибели клеток (апоптоз + ранний некроз). У мышей В6 способность поддерживать приток новых иммунных клеток в легкие сохраняется вплоть до очень поздней фазы инфекции, что обеспечивает лучшую защиту. У более чувствительных мышей 9.3 раньше начинается и дольше продолжается приток в зараженную ткань легкого нейтрофилов. Различие между линиями мышей по этому фенотипу проявляются только на тех фазах инфекции, когда в полной мере присутствует адаптивный ответ Т-клеток, хотя сам фенотип относится к врожденному иммунитету. Реакция нейтрофилов в данном случае вторична по отношению к Т-клеточной регуляции воспаления. Мы исследовали контроль восприимчивости и тяжесть течения инфекции, вызванной менее вирулентным видом микобактерий - M. avium, важным патогеном для носителей иммунодефицитов, поскольку он никогда не исследовался в аспекте генетики МНС. Полученные данные показали, что при инфекции, вызванной M. avium, линии мышей с разными аллелями единственного гена класса II H2-Aβ четко отличаются по степени легочной патологии, времени выживания после заражения, притоку нейтрофилов в легкие и продукции хемокинов и цитокинов, регулирующих трафик нейтрофилов и активацию Т-лимфоцитов. Парадоксальным образом, мыши, несущие аллель H2-Aβb, обеспечивающий заметный протективный эффект против M. tuberculosis по сравнению с аллелем H2-Aβj, оказались более восприимчивы к инфекции, вызванной M. avium, причем это касалось сразу нескольких параметров развития заболевания. В опубликованной работе (Linge I et al.,Infect Genet Evol. 2019;74:103933. doi: 10.1016/j.meegid.2019.103933) обсуждены возможные причины этого явления аспекте различий двух возбудителей по вирулентности, чувствительности к NO, внутриклеточной локализации и антигенных различий. Разработана схема получения микобактерий, прошедших in vivo кратковременное пребывание внутри нейтрофилов, а затем полученных в виде чистой популяции с помощью комбинации выделения нейтрофилов на ступенчатом градиенте перколла и изоляции чистых бактерий. Метод показал свою состоятельность. Первое сравнение транскриптомов M. tuberculosis из нейтрофилов и из культуральной среды методом высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina показало, что в поглощенных нейтрофилами микобактериях повышается экспрессия генов, вовлеченных в персистирование микобактерий в условиях стресса и гипоксии, а также глиоксалатного шунта. Также выявлено повышение экспрессии генов семейства MmpL4, известных факторов вирулентности, отвечающих за мембранный транспорт низкомолекулярных веществ. Подготовлены еще по 8 образцов РНК из групп больных с туберкуломами и фиброзно-кавернозным туберкулезом, подвергшихся хирургическому вмешательству (по 2 образца от каждого больного, один из стенки очага, другой из относительно отдаленного участка легочной ткани) для анализа методами RNA-seq. Образцы отправлены коллегам в Борстель, они приступили к секвенированию и анализу методами биоинформатики. Методом qrt-PCR исследована в динамике транскрипция малой РНК MTS1338 в микобактериях, экстрагированных из легких мышей на разных фазах инфекции - от начальной до терминальной. У мышей В6 высокий уровень экспрессии оставался очень высоким практически на всем протяжении эксперимента, а у мышей I/St снижался в терминальной фазе болезни. Пик экспрессии MTS1338 приходится на ту стадии инфекции, когда адаптивный иммунный ответ хозяина на микобактерии достигает максимума. Поскольку на этой стадии у мышей В6 наблюдается достоверно более высокий уровень продукции IFN-γ по сравнению с мышами I/St, мы сравнили экспрессию MTS1338 в инфицированных макрофагах в присутствии и отсутствии экзогенного IFN-γ. В IFN-γ-активированных макрофагах экспрессия MTS1338 оказалась достоверно выше, что было обусловлено более высоким уровнем продукции активных форм азота - важного триггера транскрипции РНК MTS1338. Последующие эксперименты показали, что коститутивная гипер-экспрессия MTS1338 помогает микобактериям выживать в условиях низкого значения рН и вызывает серьезные изменения в профиле транскрипции многих генов (показано методами RNA-seq), сходные с теми, которые наблюдаются при адаптации к неблагоприятным условиям в организме-хозяине. Эти данные только что опубликованы (Salina Е et al. Frontiers Cell Infect. Microbiol, DOI: 10.3389/fcimb.2019.00405). Дополнительные данные доступны по ссылке https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2019.00405/full#supplementary-material.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Методами NGS проведено полномасштабное профилирование транскриптома микобактерий после их фагоцитоза нейтрофилами in vivo в сравнении с микобактериями того же штамма в культуре, которые используются для заражения животных в эксперименте. Данные RNA-seq независимо подтверждены методом количественного qrt-PCR. Показано существенное увеличение экспрессии ключевых генов синтеза PDIM (ppsC, ppsD, mas, fadD26, papA5), генов секретируемых иммунногенных белков mpt83, mpt70. Не подтверждено изменения экспрессии генов ESX-1 локусов esxA и esxB. В целом, изменения в транскриптоме микобактерий, захваченных нейтрофилами, отражают две противоположных тенденции: (1) попытка направить гибель клетки-хозяина (нейтрофила) по пути некроза за счет активации синтеза PDIM, что способствует размножению микобактерий, и (2) переход к к снижению уровня метаболизма и экспрессии факторов вирулентности, в частности, репрессия системы секреции ESX-1. Однако обе тенденции неблагоприятны для защиты хозяина: не говоря уже о размножении микобактерий, переход в более латентное существование снижает иммуногенность микобактерий и "прячет" их от иммунного ответа хозяина. Таким образом подтверждено, что фагоцитоз микобактерий нейтрофилами - это путь, который хорошо контролируется биохимией самих микобактерий. В сочетании с неэффективностью подавления роста микобактерий в нейтрофилах (в отличие от макрофагов), показанной ранее (Eruslanov EB, Lyadova IV, Kondratieva TK, Majorov KB, Scheglov IV, Orlova MO, Apt AS. Neutrophil responses to Mycobacterium tuberculosis infection in genetically susceptible and resistant mice. Infect Immun. 2005 Mar;73(3):1744-53. doi: 10.1128/IAI.73.3.1744-1753.2005; Yeremeev V, Linge I, Kondratieva T, Apt A. Neutrophils exacerbate tuberculosis infection in genetically susceptible mice. Tuberculosis (Edinb). 2015; 95(4):447-51. doi: 10.1016/j.tube.2015.03.007), представляется доказанной гипотеза о патогенной, а не защитной функции нейтрофилов при туберкулезе. 2. Для гена S100A8/9 была обнаружена избирательная повышенная экспрессия в легких мышей 9.3. Экспрессия S100A8/9 выше у мышей 9.3, чем у В6, даже до инфекции, а геномные отличия между линиями касаются только области генов класса II, поэтому эти данные будут предметом анализа разными способами в нашей будущей работе, а ось сигналов в направлении МНС-II - S100A8/9 станет зоной пристального внимания. Ген S100A8/9 (а также многие другие гены семейства S100) в геноме мыши занимает положение, точно совпадающее с локализованным нами ранее (Sánchez F, Radaeva TV, Nikonenko BV, Persson AS, Sengul S, Schalling M, Schurr E, Apt AS, Lavebratt C. Infect Immun. 2003;71(1):126-31. doi: 10.1128/iai.71.1.126-131.2003) QTL, участвующим в контроле туберкулеза. Поскольку мыши 9.3 и В6 имеют одинаковую генетическую основу, данный локус проявляет себя как экспрессионный, а не структурный полиморфизм (eQTL) - пока еще редкий пример в генетике туберкулеза. 3. Проведена оценка особенностей легочной патологии и параметров иммунного ответа в легких при индукции туберкулезной инфекциями микобактериями с существенно сниженной вирулентностью за счет культивирования в особых условиях, позволяющих достичь состояния метаболизма во многом сходных с тем, что принято называть "латентной инфекцией" при описании форм клинического туберкулеза. Было показано, что у чувствительных мышей I/St количество микобактерий в легких и селезенке было выше на ~1.5 порядка по сравнению с резистентными мышами B6, что сопровождалось диффузной пневмонией, избыточной инфильтрацией легких активированными Т-лимфоцитами CD44+CD62L-, и гибелью через 7-9 месяцев после заражения. У мышей B6 образовывались локальные очаги воспаления на фоне повышенной продукции воспалительных цитокинов IL-6 и IL-11 и более сбалансированной активации Т-клеток в легких. Количество CFU у мышей B6 оставалось стабильным на протяжении всего 18-месячного периода наблюдений и все животные выжили. Таким образом, разработана модель, позволяющую сравнивать фатальную реактивацию ТБ с постоянным стабильным носительством микобактерий и охарактеризован иммунный ответ в легких, на фоне которого проявляются эти полярные фенотипы. На ранней стадии туберкулезного процесса для защиты хозяина требуется быстрое образование гранулем и образование компактных очагов инфекции. Затем постоянная выработка цитокинов воспаления IL-6 и IL-11 в сочетании с IFN-gamma позволяет долго сохранять очаговый характер воспаления и не допускать развитие разлитого воспаления легочной ткани с ее некрозом, что без лечения приводит к гибели хозяина. 4. С помощью технологии Cre/Flox выведена линия мышей на генетической основе В6 с избирательным генетическим выключением IL-6 в В-лимфоцитах. Проведены эксперименты по исследованию влияния избирательного (кондиционного) нокаута на образование В-клеточных фолликулов в легких, само количество В-лимфоцитов и присутствие фолликулярных Т-хелперов. Показано, что генетическое блокирование продукции IL-6 в В-лимфоцитах приводит к снижению числа В-клеток CD19+ и Tfh CD4+CXCR5+ в легких и селезенке в первые недели после заражения. Таким образом, при туберкулезном воспалении продукция IL-6 В-лимфоцитами на ранних фазах инфекции способствует образованию в легочной ткани фолликулов типа третичных лимфоидных органов, в состав которых входят несколько типов клеток, в том числе функционально важная популяция Tfh.