Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Фотосинтез требует баланса между эффективным светосбором и защитой от фотоповреждения. У цианобактерий фотозащита антенных комплексов фикобилисом связана с функционированием фотоактивного оранжевого каротиноидного белка (OCP), который при интенсивном освещении активируется, переходя в красную форму, и обеспечивает тушение флуоресценции светособирающей антенны. Недавно идентифицированный так называемый белок восстановления флуоресценции (Fluorescence Recovery Protein, FRP) связывается с фотоактивированным OCP и ускоряет его релаксацию и отсоединение от фикобилисомы, тем самым возвращая её в исходное состояние, обеспечивающее перенос энергии возбуждения на фотосинтетические реакционные центры. Молекулярный механизм функционирования FRP до недавних пор оставался малоизученным. Более того, поскольку имеющиеся представления в основном были полученных при изучении белков Synechocystis, принципиально могут существовать разные механизмы регуляции ОСР-зависимого нефотохимического тушения флуоресценции ФБС у разных видов цианобактерий. Это обусловлено относительно низкой гомологией белков семейства FRP. Помимо филогенетического анализа, мы провели детальный структурно-функциональный анализ двух FRP с низким уровнем гомологии из Anabaena и Arthrospira maxima и сравнили их с FRP из Synechocystis (SynFRP). С помощью метода основанного на регистрации малоуглового рассеяния рентгеновского излучения (SAXS) было установлено, что все типы FRP в растворе принимают димерные формы с похожей конформацией. Используя алгоритмы CONSURF было показано, что наиболее консервативные участки в данных белках находятся в области отвечающей за образование димера и области "головы" FRP, которая предположительно взаимодействует с ОСР. Принимая аналогичные димерные конформаций в растворе три разных типа FRP оказались способны взаимодействовать с ОСР из Synechocystis, ускоряя его переход из красной активной формы в оранжевую, что говорит о наличии идентичных участков для взаимодействия с ОСР у FRP с низкой степенью гомологии. Эти наблюдения позволяют сузить область поиска сайтов взаимодействия ОСР и FRP до ограниченного количества остатков. Интересно отметить, что наиболее эффективным в плане инактивации ОСР из Synechocystis оказался FRP из другого вида. Изучение взаимодействия трех вариантов FRP с различными мутантами ОСР, моделирующими различные стадии фотоцикла позволило установить что ОСР способен в динамическом равновесии образовывать комплексы с FRP в соотношении 1 к 1 и 1 к 2 которые по разному представлены в системах с различными типами FRP. Это говорит о мономеризации FRP при взаимодействии с ОСР и динамическом равновесии между димерами и мономерами FRP образующимися в результате конверсии ОСР в исходное оранжевое состояние. Все типы FRP были способны восстанавливать флуоресценцию потушенных за счет активных форм ОСР фикобилисом и предотвращать возникновение тушения при фотоактивации ОСР. Результаты работы были опубликованы нами в журнале BBA - Bioenergetics. Данная работа послужила фундаментом для следующих экспериментов, позволивших установить структуру комплекса ОСР-FRP и выявить сайты белок-белкового взаимодействия. Далее нами были разработаны варианты FRP с определенным олигомерным состоянием (L49E и L33C/I43C) и тщательно изучено их функциональное взаимодействие с OCP. Анализ структуры в растворе с помощью SAXS, дополненный ковалентной стабилизацией белковых контактов (disulfide trapping), позволил выявить топологию метастабильных комплексов OCP и FRP с различной стехиометрией. Показано что первичный сайт взаимодействия ОСР с FRP расположен в С-домене ОСР и в неактивном состоянии закрыт от взаимодействия короткой α-спиралью, которая отсоединяется при фотоактивации ОСР. Установлено что фотоактивированный ОСР не может плотно связываться с мономерным FRP, таким образом, только димерный FRP обладает подходящим интерфейсом для взаимодействия с OCP, который компактизуясь индуцирует мономеризацию FRP, за счет этого образуется еще менее стабильный комплекс 1 к 1, распад которого завершает релаксацию ОСР. Показано также что in vitro при высоких концентрациях ОСР могут образовываться комплексы с FRP 2 к 2. Анализ структуры комплекса показывает, что такое состояние нестабильно из-за возникающих молекулярных клешей и, вероятно, должно дополнительно способствовать мономеризации FRP. Способность FRP к быстрой спонтанной димеризации значительно повышает эффективность работы FRP при высоких концентрациях OCP. Таким образом нами были выявлены ключевые молекулярные интерфейсы взаимодействия ОСР и FRP, которые позволяют не только лучше понять механизм регуляции фотозащитных механизмов цианобактерий, но и способствовать созданию оптических триггерных систем и биосенсоров. Результаты исследования опубликованы в журнале Nature Communications. Сообщение о данной работе было опубликовано агентством РИА Новости в разделе Наука под заголовком "Биологи из МГУ "взломали" систему фотосинтеза у фитопланктона" https://ria.ru/science/20181005/1530043892.html В нами было впервые показано что С-домен ОСР способен не только связывать кето-каротиноиды, образуя димеры фиолетового цвета, но и обладает рядом функциональных свойств, обусловленных структурой данного белка. Оказалось, что С-домен ОСР и ряд его природных гомологов способен вытаскивать каротиноиды из мембран и доставлять их в апо формы ОСР и гомологи N-домена. Данный процесс по своей сути является аналогом сборки фотоактивного ОСР, которая происходит каждый раз после фотоактивации. Поэтому в рамках данного проекта мы провели исследование свойств С-домена ОСР и его природного аналога из Anabaena (Nostoc) PCC 7120 и установили трехмерную структуру белка CTDH без каротиноида. CTDH содержит остаток цистеина в положении 103. С помощью метода кристаллографии были идентифицированы два интерфейса, образующих димер CTDH, один стабилизированный дисульфидной связью между мономерами и второй за счет контакта β-листов мономера. С помощью метода SAXS было показано, что в растворе димеры образуются за счет взаимодействия β-листов. Такая структура вероятно представляет собой интермедиат, который образуется при взаимодействии с белками гомологичными N-домену ОСР при передаче каротиноида. Анализ кристаллической структуры выявил значительные отличия между положениями С-концевого хвоста в CTDH и в полноразмерном ОСР, что говорит о подвижности данного структурного элемента, который оказался функционально значимым для реакций переноса каротиноидов. Эти результаты позволили предложить детальную модель редокс зависимого транспорта каротиноидов с помощью водорастворимых белков гомологичных С-домену ОСР. Результаты исследования были опубликованы в первом выпуске нового журнала Nature Publishing Group под названием Communications Biology.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Основной задачей проекта является исследование структурно-функциональной организации фотоактивного оранжевого каротиноидного белка (Orange Carotenoid Protein, OCP), который является одним из ключевых элементов регуляции фотосинтетической активности цианобактерий. Данный белок является фоточувствительным и при высокой интенсивности синего света переходит в активную форму, которая способна взаимодействовать с антенными комплексами, эффективно преобразуя энергию электронного возбуждения. Механизм фотоактивации, последовательность конформационных перестроек в каротиноиде и в белковой матрице при переходе в активное состояние и интерфейсы, обеспечивающие взаимодействие ОСР с антенной и другими белками, пока остаются объектами научных дискуссий. Для изучения этих реакций в рамках данного проекта нами был предложен ряд экспериментов, разделяющих сложный многокомпонентный процесс на отдельные стадии. Во-первых, благодаря наличию хромофора для исследования фотоцикла ОСР могут быть использованы оптические методы, однако, для правильной интерпретации наблюдений необходимо понимать какие факторы влияют на оптические свойства каротиноида. Связывание гидрофобной молекулы каротиноида водорастворимым белком приводит к изменению локального окружения, что сопровождается изменением спектра поглощения каротиноида. В результате фотоактивации в конечном итоге образуется так называемая красная активная форма ОСР, в которой положение каротиноида значительно отличается от начального. Красная форма является нестабильной, поэтому белок возвращается в исходную оранжевую форму. Важную роль данном процессе играют остатки тирозина-201 и триптофана-288, образующие водородные связи с кето-группой каротиноида, стабилизирующие компактную неактивную форму белка. Поскольку образование водородной связи влияет на состояние триптофана его оптический сигнал также может быть использован для изучения фоциклических переходов в ОСР, параллельно с регистрацией поглощения каротиноида. Для решения этих задач нами были получены мутантные формы ОСР, лишенные всех триптофанов за исключением 288го, а также были проведены исследования макро и микропараметров, влияющих на поглощение каротиноида в ОСР-подобных белках. В результате анализа и теоретического описания спектров комбинационного рассеяния и поглощения различных форм ОСР нами было установлено как конформация и параметры белкового окружения влияют на оптический ответ каротиноида, и предложено объяснение каким образом конформация должна меняться при фотоактивации ОСР. Используя данный подход нам удалось объяснить ряд особенностей фиолетовых форм гомологов С-домена ОСР, в которых водородные связи также стабилизируют взаимодействия каротиноида с белковой матрицей, но поглощение системы сильно смещено в красную область. Результаты исследования опубликованы в журнале Physical Chemistry Chemical Physics (PCCP) и являются необходимым фундаментом для описания кинетики релаксации возбужденных состояний каротиноида в составе ОСР из которых образуется фотопродукт, эволюционирующий в красное активное состояние. Во-вторых, для описания свойств (в том числе структурной организации) интермедиатов фотоцикла ОСР нам необходимо научиться стабилизировать или выделять такие состояния в эксперименте. Для этих целей нами были сконструированы и получены несколько мутантов ОСР, имитирующих различные типы красной формы ОСР – «компактную» неактивную и «рыхлую» активную. Структурные характеристики активной формы ОСР и мутанта с аналогичными свойствами были изучены с помощью методов Малоуглового рассеяния рентгена и нейтронов (SAXS и SANS) и квазиэластического рассеяния нейтронов (QENS). Установлено, что при фотоактивации и переходе в физиологически активное состояние ОСР меняет свою форму, становясь более вытянутым за счет нарушения белок-белковых контактов между С и N-доменами, оставаясь димером при высоких концентрациях белка. При этом подвижность аминокислотных остатков ОСР в красной активной форме увеличивается примерно на 20 %. Основные результаты исследования опубликованы в виде двух последовательных статей в журнале Journal of Physical Chemistry B. В-третьих, работы последних лет открыли множество гомологов ОСР и его фрагментов, функциональная роль которых пока остается неизвестной. Фиолетовые формы гомологов С-домена ОСР представляют особый интерес из-за уникальных функциональных особенностей. Нами было показано что гомолог С-домена ОСР из Анабены (CTDH) настолько эффективно связывает кантаксантин и эхиненон, что способен забирать их из мембран, а также некоторых водорастворимых каротиноиных белков. Так, например, нами было установлено, что Апо-форма CTDH не взаимодействует с оранжевой формой полноразмерного ОСР, однако при фотоактивации последнего и образовании «рыхлой» красной формы ОСР инициируется перенос каротиноида в CTDH. Поскольку мы наблюдали такие реакции для белков из одного организма мы предполагаем, что эти процессы могут происходить в клетках цианобактерий и, предположительно, играть роль в регуляции фотосинтетической активности. Результаты работы опубликованы в журнале FEBS Letters, обложку которого украсила наша иллюстрация. Открытые реакции переноса каротиноидов представляют особый интерес по многим причинам. Во-первых, мы научились управлять направлением переноса каротиноида и использовать белки для высокоэффективной доставки каротиноидов в клетки млекопитающих. А во-вторых, мы использовали данный подход для получения уникального препарата холо-CTDH в котором обычный кантаксантин связан с изотопномеченым (С13/N15) белком. Данный препарат необходим нам для изучения структуры CTDH с помощью метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Ряд ЯМР экспериментов выявил характерные отличия мономерной Апо-формы CTDH и димера CTDH, что позволит нам установить участки белок-белковых взаимодействий в димере, а также белок-хромофорные контакты. Это позволит установить структуру фиолетового белка CTDH в растворе.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Поскольку цианобактерии играют важнейшую роль в формировании крупнейших биоценозов, а также рассматриваются как перспективные биотехнологические штаммы, понимание механизмов регуляции фотосинтетических процессов является важной задачей для устойчивого развития. В рамках проекта, совместно с нашими немецкими коллегами, мы изучаем основы фотозащитных реакций цианобактерий. Ключевым регуляторным элементом этих реакций является оранжевый каротиноидный белок (orange carotenoid protein, OCP) который в зависимости от интенсивности солнечного света может находиться в двух состояниях оранжевом неактивном и красном активном. Активация ОСР в ответ на поглощение кванта света молекулой каротиноида в его составе запускает каскад конформационных изменений как в структуре самого каротиноида, так и в структуре белка, что в конечном итоге приводит к обнажению ряда белковых сайтов, отвечающих за взаимодействие с антенными комплексами. Это взаимодействие приводит к инактивации энергии электронного возбуждения пигментов антенны за счет переноса энергии на молекулу каротиноида с последующей диссипацией в тепло. В результате эффективность фотосинтетических реакций снижается и, соответственно снижается и вероятность появления активных форм кислорода, которые могут образовываться при функционировании фотосистемы 2 в условиях стресса. Однако для восстановления фотосинтетической активности необходимо отсоединить ОСР от антенны и для этого в структуре активной красной формы предусмотрен сайт взаимодействия с еще одним белком – FRP, который значительно ускоряет переход ОСР в неактивную оранжевую форму. Соотношение констант скоростей переходов между состояниями ОСР определяет возможность адаптации цианобактерии к изменяющимся условиям освещения и, соответственно, определяют эффективность получения биомассы. Многие особенности вышеперечисленных реакций были установлены в рамках данного проекта. Для изучения фотоцикла ОСР нам потребовалось разбить этот процесс на элементарные акты, происходящие в диаппазоне времен от 100 фс до 100 с. С помощью методов молекулярной биологии и современных биохимических подходов были получены мутанты ОСР представляющие различные стадии фотоцикла. В рамках работ 3 года проекта нами был получен мутант ОСР способный к фотоактивации, но при этом неспособный к взаимодействию с FRP и взаимодействующий с антенной с низкой эффективностью. Это стало возможным за счет введения дополнительной пары цистеинов, образующих ковалентную связь в окислительных условиях, ограничивающих подвижность структурных элементов ОСР. В частности, для образования активной красной формы ОСР необходимо пространственное удаление N-домена белка от С-домена. При этом в полученном мутанте практически в 10 раз увеличилась скорость релаксации красной формы, которая образуется при перемещении каротиноида в N-домен. Таким образом нам удалось разделить функциональную активность белка и фотоактивацию. Результаты эксперимента опубликованы нами в журнале BBA – Bioenergetics (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272820300244?via%3Dihub). Данный способ модификации ОСР представляет особый интерес для изучения механизма фотоактивации ОСР поскольку позволяет ускорить регенерацию оранжевой формы и сосредоточиться на начальных быстрых стадиях фотоцикла. В оранжевой неактивной форме ОСР кето-каротинид образует водородные связи с остатками тирозина-201 и триптофана-288, переход в активную форму приводит к разрыву этих связей, однако скорость этого процесса была неизвестна. Для изучения этой реакции мы использовали сигнал флуоресценции триптофана-288 как индикатор наличия или отсутствия водородной связи, однако, реализация этого эксперимента потребовала удаления 4х других триптофанов, не участвующих в связывании каротиноида. Используя линию оптической задержки для управления возбуждением каротиноида и зондирования триптофана-288 нам удалось проследить разрывом водородной связи и определить характерное время необходимое для образования первого продукта фотоактивации ОСР, которое составило порядка 23 пс. Результаты эксперимента позволяют впервые связать фотоцикл ОСР с динамикой возбужденных состояний каротиноида и однозначно показывают, что ни S1, ни ICT не могут участвовать в образовании фотопродукта из-за их короткого времени жизни. Соответственно, единственным возможным предшественником первого интермедиата фотоцикла ОСР может являться S*. Результаты эксперимента опубликованы нами в журнале Scientific Reports (https://www.nature.com/articles/s41598-020-68463-8) и фактически являются первым доказательством участия состояния S* в активации ОСР. Для изучения роли S* нами был получен мутант ОСР с увеличенным в 5 раз выходом состояния S*. Структура данного мутанта была исследована с помощью рентгеноструктурного анализа, а динамика возбуждённых состояний с помощью абсорбционной спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния с фемтосекундным временным разрешением. Наиболее значимые взаимодействия каротиноида и белка реализуются за счет водородных связей в С-домене ОСР, а структурные гомологи этого домена (CTDH) представлены в геноме различных цианобактерий. Однако роль этих белков неизвестна. Нами впервые было показано что изолированный С-домен ОСР способен связывать каротиноиды и передавать их в N-домен ОСР и полноразмерный ОСР. Далее в рамках данного проекта нами было показано что ряд природных гомологов С-домена (CTDH) обладают большим сродством к каротиноиду по сравнению с красной формой ОСР, соответственно фотоактивация ОСР может быть использована для насыщения CTDH каротиноидом. В рамках работ 3 года нами были изучены взаимодействия CTDH связывающих различные каротиноиды с мембранами липосом и клеток. Первая работа в этом направлении была опубликована нами в сентябре 2020 года в журнале Antioxidants (https://www.mdpi.com/2076-3921/9/9/869). Мы установили, что CTDH связывающий эхиненон способен доставлять этот каротиноид в липосомы и клетки с эффективностью до 70%. При этом каротиноид оказывает влияние на редокс состояние клетки и (в некоторых концентрациях) способен защищать клетки от окислительного стресса. Таким образом разработанный нами подход позволяет изучать влияние каротиноидов на клеточные процессы на модельных системах. Исследование структуры CTDH проведено нами при помощи методов ядерного магнитного резонанса в ходе работ 3 года проекта нами завершено отнесение химических сдвигов мономера CTDH (https://link.springer.com/article/10.1007/s12104-020-09976-1), которые необходимы для установления взаимодействия каротиноида с белком и белок-белковых взаимодействий, отвечающих за образование холо-формы белка и перенос каротиноида между белками и мембранами. Результаты данного проекта открывают путь к использованию молекулярных механизмов функционирования каротиноидных белков для адресной доставки каротиноидов в клетки и создания биосенсоров для функционального имиджинга.