КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 15-15-00072
НазваниеРоль врожденного и приобретенного иммунитета в патогенезе «новой» инфекции, вызываемой Borrelia miyamotoi
РуководительПлатонов Александр Евгеньевич, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г Москва
Период выполнения при поддержке РНФ | 2018 г. - 2019 г. |
Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-231 - Инфекционные заболевания
Ключевые словаборрелии Borrelia miyamotoi, «новое» инфекционное заболевание, клинические проявления, патогенез, бактериемия, специфические антитела, система комплемента, лейкоциты, генерализованные воспалительные реакции, дисфункции и поражения органов, осложнения и последствия заболевания, своевременная диагностика, терапия
Код ГРНТИ76.29.50
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Проект 2018 является логическим продолжением Проекта 2015, поддержанного РНФ, - первого пилотного исследования «новой» инфекции, иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ), вызываемого Borrelia miyamotoi (ИКБ-БМ). В проекте 2018 будет продолжена эпидемиологическая линия исследований – выявление клинических случаев ИКБ-БМ и доказательство широкой географической распространенности инфекции B. miyamotoi в России и мире. Без убедительных свидетельств актуальности «новой» инфекции для здравоохранения неясна важность фундаментальных исследований ее патогенеза. В проекте 2018 будет продолжена клиническая линия исследований – без детального анализа клинических проявлений достаточно большого числа случаев ИКБ-БМ не существует объекта изучения, ведь патогенез – это механизм возникновения и развития болезни, ее конкретных особенностей, выявляемых в клинических исследованиях. Будет продолжена линия на совершенствование лабораторной диагностики ИКБ-БМ – ведь без надежной диагностики всех, возможно и необычных, случаев ИКБ-БМ в исследуемой группе больных опять же исчезает предмет изучения. Кроме того, именно внедрение создаваемых в ходе Проектов 2015 и 2018 лабораторно-диагностических методов в практику здравоохранения обеспечивает возможность практического использования результатов проекта в экономике и социальной сфере. Будет продолжена линия на выделение штаммов B. miyamotoi, что позволит закрепить наше мировое лидерство в этой области и увеличит спектр разнообразных штаммов, которые можно использовать в исследованиях ин витро и ин виво. На основе данных полногеномного секвенирования будет продолжена линия на анализ генома штаммов B. miyamotoi, которые уже выделены или будут выделены в 2018-2019 гг. – ведь генотип микроорганизма в существенной степени определяет его фенотип, то есть вклад в патогенез заболевания «со стороны патогена». Будет продолжена линия на разработку и развитие информативных методов экспресс-генотипирования, применение которых позволит в большинстве выявляемых случаев ИКБ-БМ провести сопоставление клинико-патогенетических особенностей заболевания с генетическими особенностями вызвавшего заболевание изолята B. miyamotoi. С применением этих методов, на основе созданной в ходе Проекта 2015 и пополняемой в ходе Проекта 2018 коллекции образцов от больных ИКБ-БМ, от клещей-переносчиков и резервуарных хозяев, будет изучено многообразие геновариантов B. miyamotoi, встречающихся в России и, возможно, за рубежом. В результате будут выявлены «ядро» популяции B. miyamotoi, ответственное за наиболее типичные клинико-патогенетические особенности ИКБ-БМ, и редкие «исключения» (outliers), которые, предположительно, могут вызывать более тяжелые формы инфекции.
ИКБ-БМ – генерализованная инфекция и в разгаре заболевания регистрируется, по данным Проекта 2015, достаточно высокая концентрация спирохет в крови. Поэтому естественно, что в Проекте 2018 будет интенсифицированы и расширены исследования взаимодействия B. miyamotoi с клетками крови человека – лейкоцитами, эритроцитами и, впервые, с тромбоцитами, а также с гуморальными системами иммунитета – с системой комплемента и специфическими антителами к B. miyamotoi, вырабатываемыми в ходе заболевания. Это взаимодействие будет изучаться в двух аспектах: 1) какие бактерицидные механизмы и в какой степени задействованы в ходе инфекции и как реализуется механизм уничтожения боррелий, в конечном счете приводящий к элиминации B. miyamotoi из организма и выздоровлению; 2) какие нарушения функций клеточного и гуморального иммунитета могут возникать в результате взаимодействия с боррелиями. Эти нарушения могут выражаться как в инактивации и/или потреблении клеток крови и компонентов комплемента, так и в патологической гиперактивации, в свою очередь, ведущей к повреждению клеток крови, эндотелия сосудов, внутренних органов. Предположительно, действие B. miyamotoi может быть как прямым - путем непосредственного контакта с клетками или секреции биологически активных молекул, так и опосредованным - осуществляемым, например, по цепочке – активация лейкоцитов и тромбоцитов – активация или повреждение клеток эндотелия – нарушение микроциркуляции крови – дисфункции органов, или по более простой цепочке - активация лейкоцитов – выброс провоспалительных молекул – развитие лихорадочного синдрома – дальнейшие нарушения, как следствие лихорадки.
Наконец, для изучения патогенеза инфекции B. miyamotoi будут продолжены и расширены начатые в ходе Проекта 2015 исследования последствий заражения лабораторных животных клиническими штаммами B. miyamotoi. Будут рассмотрены вопросы, имеющие отношение и к патогенезу клинических заболеваний ИКБ-БМ, которые не всегда возможно исследовать на человеке. Например: 1) что происходит во время инкубационного периода (пациенты в этот момент недоступны); 2) какова длительность рецидивирующей спирохетемии и как она разрешается «в естественных условиях», без лечения (по этическим соображениям пациентам назначается антибиотикотерапия после постановки диагноза ИКБ-БМ); 3) где укрываются от иммунных систем организма спирохеты между приступами лихорадки (биопсия органов пациента не требуется по лечебным показаниям и, следовательно, невозможна); 4) идентичны или генетически различны боррелии во время последовательных приступов лихорадки (при стационарном лечении больных ИКБ-БМ до повторных приступов дело не доходит) и т.д.
Научная новизна исследования базируется на том простом факте, что в опубликованной литературе полностью отсутствуют ответы на те вопросы, которые ставятся в плане Проекта 2018. Более того, зарубежные исследователи не выявили и не имеют доступа к такому количеству больных ИКБ-БМ, как наш коллектив, не имеют в руках клинических штаммов B. miyamotoi, не приступили к исследованиям патогенеза инфекции на лабораторных животных. Поэтому результаты, которые планируется получить к началу 2020 г., вероятно, не будут иметь аналогов. Принципиально важно и обеспечивает новизну то, что при инфекции B. miyamotoi нами выявлены признаки и начато изучение «иммунного избегания» - интереснейшего патогенетического механизма, по мнению многих специалистов ответственного за рецидивирующее течение боррелиозных клещевых возвратных лихорадок, относящихся к наиболее массовым инфекционным заболеваниям в тропической зоне. Рецидивы инфекции B. miyamotoi документированы как у больных ИКБ-БМ, так и у зараженных B. miyamotoi экспериментальных животных (полевок). Выявлены гены, экспрессия которых может переключаться в ходе «иммунного избегания», создана ПЦР-методика, позволяющая идентифицировать экспрессируемый вариант этих генов и т.д. Таким образом, создана основа для продуктивного изучения функционирования механизма «иммунного избегания» и все вышеназванные линии исследований будут объединены в контексте исследования механизма «иммунного избегания».
Ожидаемые результаты
В случае успешного выполнения Проекта 2018 будет получена существенная информация, о том, кто, где и как болеет ИКБ-БМ, какие патогенетические механизмы включаются при начале и развитии заболевания, как клиника и патогенез заболевания связана с генетическими характеристиками патогена, какие защитные системы организма действуют на различных этапах инфекционного процесса и от чего зависит их эффективность или неэффективность, чем обусловлены лихорадочный синдром и нарушение функций ряда органов при инфекции B. miyamotoi. Ожидаемые результаты должны соответствовать мировому уровню по новизне и значимости. По состоянию на день подачи заявки, ни один из результатов, которые предполагается достичь, не был получен кем-либо еще, и в этом смысле поставленные задачи и ожидаемые результаты абсолютно новы. С научной точки зрения, в сопоставлении с уровнем понимания патогенеза инфекции B. miyamotoi на настоящий день, отраженном в финальном отчете по Проекту 2015 и, отчасти, в разделе 4.1, ожидаемые результаты представляют собой существенный шаг вперед и в этом смысле значимы.
Результаты проекта, несомненно, будут использованы в экономике и социальной сфере (медицине). На них должно базироваться улучшение качества медицинской помощи больным и переболевшим иксодовыми клещевыми боррелиозами, вызванными B. miyamotoi. В частности, планируется провести клинические испытания планарного белкового иммуночипа для выявления IgM и IgG антител к специфическим антигенам B. miyamotoi. Не только для исследования боррелиозов, но и для разработки новых подходов к борьбе с инфекционными заболеваниями в целом будут полезными: новая технология культивирования спирохет из крови больных; впервые примененная технология «гибридного» полногеномного секвенирования и соответствующий биоинформационный алгоритм для сборки геномов боррелий и других видов бактерий, имеющих много плазмид, и другие впервые разработанные или оптимизированные научные методики, использованные в проекте.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Данный проект (Проект 2018) является естественным и логичным продолжением проекта, выполнявшегося в 2015-2917 гг. (Проект 2015), отчет по которому доступен на сайте РНФ.
План работы на 2018 г. состоял из 10 взаимосвязанных разделов (результаты по пятому разделу обсуждаются перед четвертым).
1. Собраны и проанализированы на основе индивидуальных данных по 2750 заболевшим эпидемиологические особенности иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) в 2011-2017 гг. в Архангельской, Кемеровской, Курганской, Ростовской и Смоленской областях, Алтайском и Приморском крае. Доля ИКБ в безэритемной форме среди всех случаев ИКБ варьировала от 30% до 45%. Серологическое изучение 208 образцов от 104 пациентов с клещевыми инфекциями в Республике Башкирия выявило 12 острых заболеваний ИКБ, вызванного B. miyamotoi (ИКБ-БМ) и три случая инфекции B. miyamotoi, перенесенной ранее; среди 84 пациентов в Вологодской области обнаружено 12 острых ИКБ-БМ, 2 человека перенесли инфекцию B. miyamotoi ранее. В результате серологического изучения 110 образцов от 51 пациента с клещевой инфекцией в 2017 г. в Новосибирской области выявлено 17 случаев острого ИКБ-БМ; у двух больных обнаружены анамнестические IgG антитела к B. miyamotoi. Новосибирские коллеги подтвердили с помощью ПЦР диагноз ИКБ-БМ у 14 из 17 больных и дополнительно обнаружили еще 3 серонегативных случаев ИКБ-БМ. Серологическое изучение 282 лиц после присасывания клеща в Нидерландах и 202 лиц - в Швеции выявило 17 и 11 острых заболеваний ИКБ-БМ, а также 7 и 9 случаев инфекции B. miyamotoi, перенесенных ранее, соответственно.
Итак, практически во всех регионах Евразии, исследованных в 2018 г. и в ходе Проекта 2015, выявляются многочисленные острые случаи ИКБ-БМ и анамнестические антитела, свидетельствующие об инфекции, перенесенной ранее.
2. В результате углубленного исследования образцов крови, собранных в Екатеринбурге, в 2017 г. лабораторно подтверждены 51 случай инфекции B. miyamotoi и диагностированы 32 случая болезни Лайма, в 2018 г. 25 случаев ИКБ-БМ и шесть - болезни Лайма. В Красноярске лабораторно подтверждены семь случаев ИКБ-БМ. Результаты лабораторной диагностики и данные расширенного клинико-эпидемиологического исследования внесены в соответствующие базы данных, ведущиеся с 2009 г., в том числе в рамках Проекта-2015. Окончательный анализ этих баз будет проведен после завершения набора материала в 2019 г.
3. В рамках задачи по совершенствованию лабораторных возможностей диагностики ИКБ-БМ, расширенный вариант иммуночипа «нового поколения» для выявления антител к 22 антигенам B. miyamotoi и/или B. burgdorferi sensu lato был создан и испытан, используя 337 образцов сыворотки крови от 122 российских больных с ИКБ-БМ, подтвержденным ПЦР, и контрольные группы: 132 образца от 71 голландского пациента с культурально подтвержденной болезнью Лайма; 180, 101 и 100 образцов сыворотки от российских, шведских и норвежских здоровых доноров, соответственно. Заключение «антитела к B. miyamotoi в образце присутствуют» определяется по следующему алгоритму: «наличие антител к GlpQ И (наличие антител, как минимум, к одному их вариабельных основных белков наружной мембраны (Variable major proteins – Vmps) ИЛИ флагеллину (Fla = p41))». При использовании этого правила достигается 99%-100% специфичность и чувствительность от 60 до 80% как для IgM, так и IgG антительного ответа на инфекцию B. miyamotoi.
В РФ 03-06-2018 зарегистрировано разработанное и испытанное нами медицинское изделие «Набор реагентов для диагностики in vitro АмплиСенс® Borrelia miyamotoi-FL», производства ЦНИИ Эпидемиологии. С практической стороны это означает, что теперь в лечебных учреждениях диагноз «ИКБ, вызванный B. miyamotoi» может официально ставиться на основании результатов, полученных с помощью этого набора.
5. Были высеяны в среду MKP-FS по разработанной ранее методике (см. Проект 2015) образцы крови от всех больных с ПЦР-подтвержденным ИКБ-БМ в Екатеринбурге и в Красноярске. В Екатеринбурге удалось высеять и закрепить в культуре шесть новых клинических штаммов B. miyamotoi. В Красноярске было посеяно 6 образцов от больных с ИКБ-БМ; устойчивого роста B. miyamotoi не было получено.
4. Изучается геном этих шести штаммов, а также двух штаммов B. miyamotoi, выделенных нашими соавторами в Голландии от клещей Ixodes ricinus (впервые). Собраны и аннотированы хромосомы, показано, что российские штаммы принадлежат к «азиатскому», а голландские – к «европейскому» генотипу, определены аллели локусов, используемых для мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) и последовательности экспрессируемых генов белков Vmps, разделяемых на два семейства – Variable small proteins (Vsp) и Variable large proteins (Vlp), которое в свою очередь разделяется на три подсемейства – Vlp-Delta, Vlp-Gamma и Vlp-Alpha (Vlp-D, Vlp-G и Vlp-A).
Полный геном одного из штаммов (Izh-4), выделенных в 2016 г. был секвенирован на «референтной» платформе PacBio. Сопоставление результатов, полученных на платформах MinION и PacBio, позволило установить «финальный» плазмидный профиль штамма Izh-4, состоящий из 12 линейных и 3 кольцевых плазмид, для идентификации которых была разработана уникальная методика на основе выявления генов белков, участвующих в репликации плазмид (паралогов PFam32, PFam49, PFam50 и PFam57-62).
6. Набор реагентов для выявления экспрессируемых генов Vmp методом ПЦР в реальном времени дополнен праймерами и пробами для выявления экспрессируемых генов Vlp-A. Экспрессия Vlp-A обнаружена в 10% образцов ДНК B. miyamotoi из крови больных ИКБ-БМ и в 13% образцов ДНК B. miyamotoi из иксодовых клещей. Расширенные исследования согласно пункту плана 7 не выявили необходимость оптимизации разработанной нами схемы МЛСТ.
7. Из 113 образцов ДНК B. miyamotoi из крови больных ИКБ-БМ и 110 образцов ДНК B. miyamotoi из иксодовых клещей экспрессия Vlp-D выявлена в 60% и 37%, Vsp в 43% и 25%, Vlp-G в 7% и 8%, Vlp-A в 4% и 6%, соответственно. Только 10% образцов из крови больных и 26% образцов клещей были отрицательны в мультиплексной ПЦР, выявляющей экспрессированные Vmp. В ряде образцов обнаружена экспрессия двух типов Vmp. Так, 20% образцов из крови больных, но только 1% образцов из клещей содержат свидетельства «двойной экспрессии» Vlp-D и Vsp (p = 0.000002). Другие комбинации ко-экспрессирующихся генов встречаются в единичных случаях. МЛСТ позволяет дифференцировать 11 сиквенс-типов (СТ) B. miyamotoi, переносимых клещами I. persulcatus, а также отдельные СТ, присущие штаммам B. miyamotoi, переносимым клещами видов I. ricinus, I. scapularis или I. pacificus. Наиболее распространен в России СТ-1, обнаруженный у штаммов Izh-16 и Yek-1, а также у 50% и 22% ДНК-изолятов B. miyamotoi из крови и клещей, соответственно.
8. К косвенным признакам реализации механизма «иммунного избегания» можно отнести выявление в крови больного ИКБ-БМ ДНК двух или более экспрессируемых генов Vmp (встречается у 23% изученных больных, см. п. 7). При этом прочие генетические характеристики изолятов полностью идентичны, то есть речь не идет о заражении двумя разными штаммами, но именно о последствиях замены у части бактерий, присутствующих в крови, экспрессированного на плазмиде lp41 гена Vmp. Характерно, что в клещах-переносчиках присутствие ДНК двух или более экспрессируемых генов Vmp крайне редко и, судя по всему, не нужно для персистенции боррелий в клеще.
Другой косвенный признак - выявление продукции антител к разным антигенным вариантам Vmp – Vlp и Vsp (встречается приблизительно у 25% изученных больных). С учетом данных об экспрессии Vmp можно предположить, что антитела вырабатываются не только к геноварианту Vmp, экспрессирующемуся в крови, взятой в момент госпитализации, но и к иному варианту, присутствовавшему на догоспитальной стадии, но затем элиминированному. При заражении полевок этот эффект нагляднее – у некоторых животных обнаруживаются антитела к варианту Vmp, который не экспрессировался штаммом в момент заражения.
Наконец, опыты на полевках (см. п. 10) прямо доказывают возможность переключения экспрессии Vmp. С помощью ПЦР-методик обнаружены случаи переключения Vlp-D -> Vsp, Vsp -> Vlp-D, Vlp-G -> Vsp, Vlp-G -> Vlp-D, и даже двойное переключение Vlp-D -> Vsp -> Vlp-G. Новый геновариант появляется в среднем на 8-13 день после заражения, что часто совпадает с первым или вторым пиком спирохетемии.
9. Показано, что ко-инкубация с B. miyamotoi не меняет характеристики спонтанной или активированной АДФ агрегации тромбоцитов или активации тромбоцитов в цельной крови, оцениваемые по экспрессии гликопротеина Ib, интегрина αIIbβ3, P-селектина альфа-гранул, и по морфологии тромбоцитов. Образование сгустка в свободной от тромбоцитов плазме крови здоровых доноров (тромбодинамический тест) не отличалось в контрольных (без взаимодействия с B. miyamotoi) или экспериментальных условиях по таким параметрам, как скорость роста и плотность сгустка, если тест проводился в присутствии ингибитора контактного пути свертывания. В отсутствии ингибитора после пре-инкубации с B. miyamotoi сгусток образовывался быстрее и был плотнее. Предположительно, B. miyamotoi способствует активации контактного пути свертывания, что может быть лабораторным коррелятом сокращения АЧТВ и микроциркуляторных нарушений, наблюдаемых приблизительно в половине клинических заболеваний ИКБ-БМ.
10. После подкожного заражения полевок Myodes rutilus или M. glareoulus (21 животное) клиническим штаммом Izh-4, экспрессирующим Vlp-D, максимальный уровень спирохетемии (в среднем 1000000 спирохет на мл) регистрировался на 8-й день. В среднем к 16 дню боррелии исчезают из крови, в которой у 100% полевок обнаруживаются антитела к Vlp-D, а у 24% полевок - и антитела к Vsp. Через три месяца после первичного заражения животным была введена доза либо того же самого штамма Izh-4 (пять полевок), либо штамма Izh-14 (пять полевок), экспрессирующего иной тип Vmp, а именно Vlp-G. В течение 15 дней последующего наблюдения B. miyamotoi не обнаруживалась в крови ни у одной полевки. Наконец, были изучены полевки M. rutilus, спонтанно заразившиеся в природных условиях B. burgdorferi sensu lato (5 животных) или Anaplasma phagocytophilum (5 животных) и хронически инфицированные на момент лабораторного заражения штаммом Izh-4 или штаммом Izh-14. Зараженность анаплазмой или возбудителями болезни Лайма значимо не влияла на уровень и длительность спирохетемии B. miyamotoi. Таким образом, полевки Myodes могут быть использованы в качестве лабораторной модели инфекции B. miyamotoi и, возможно, участвуют в циркуляции возбудителя в природных очагах. Однако сравнительно короткий период спирохетемии указывает на то, что холодное время года возбудитель, вероятно, перезимовывает в клещах, находящихся в состоянии диапаузы.
Все запланированные в отчетном году исследования выполнены и результаты достигнуты.
Публикации
1. Hoornstra D, Koetsveld J, Sprong H, Платонов АЕ, Hovius JW Borrelia miyamotoi disease in an immunocompetent patient, Western Europe Emerging Infectious Diseases, Vol. 24, No. 9 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3201/eid2409.180806
2. Koetsveld J, Manger A, Hoornstra D, Draga RO, Oei A, Колясникова НМ, Топоркова МГ, Сарксян ДС, Wagemakers A, Платонов АЕ, Hovius JW In vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Borrelia miyamotoi Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Volume 62 Issue 7 pii: e00419-18 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1128/AAC.00419-18
3. Koetsveld J, Колясникова НМ, Wagemakers A, Стуколова ОА, Hoornstra D, Сарксян ДС, Топоркова МГ, Henningsson A.J, Hvidsten D, Ang W, Dessau R, Платонов АЕ, Hovius JW Serodiagnosis of Borrelia miyamotoi disease by measuring antibodies against GlpQ and variable major proteins Clinical Microbiology and Infection, 24(12):1338.e1-1338 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.cmi.2018.03.009
4. Карань Л.С., Макенов М.Т., Колясникова Н.М., Стуколова О.А., Топоркова М.Г., Оленькова О.М. Dynamics of Spirochetemia and Early PCR Detection of Borrelia miyamotoi Emerging Infectious Diseases, Volume 24, Issue 5, P. 860-867 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3201/eid2405.170829
5. Карань Л.С., Макенов М.Т. ,Колясникова Н.М., Топоркова М.Г., Оленькова О.М. Динамика спирохетемии и эффективность ПЦР для ранней диагностики B. miyamotoi боррелиоза "Молекулярная диагностика 2018" (Минск 27-28 сентября 2018 г.) Сборник трудов. Минск. СтройМедиаПроект. 2018, с. 435-437 (год публикации - 2018)
6. Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Стуколова О.А., Карань Л.С., Платонов А.Е. Эпидемиологические и клинические аспекты безэритемных форм иксодовых клещевых боррелиозов в России Альманах "МедиАль", Том 22, № 2. С. 60-61 (год публикации - 2018)
7. Кулешов К.В., Margos G., Платонов А.Е. Идентификации и классификация спектра плазмид в геноме бактерий рода Borrelia "Молекулярная диагностика 2018" (Минск 27-28 сентября 2018 г.) Сборник трудов. Минск. СтройМедиаПроект. 2018, С.432-433 (год публикации - 2018)
8. Кулешов К.В., Гоптарь И.А., Margos G., Koetsveld J., Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Платонов А.Е., Шипулин Г.А. Секвенирование третьего поколения в расшифровке генома Borrelia miyamotoi. "Молекулярная диагностика 2018" (Минск 27-28 сентября 2018 г.) Сборник трудов. Минск. СтройМедиаПроект. 2018., С. 429-431 (год публикации - 2018)
9. Кулешов К.В., Гоптарь И.А., Margos G., Koetsveld J., Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Платонов А.Е., Шипулин Г.А. Аннотация геномов и основные закономерности геномной организации российских изолятов B. miyamotoi "Молекулярная диагностика 2018" (Минск 27-28 сентября 2018 г.) Сборник трудов. Минск. СтройМедиаПроект. 2018., С. 431-432 (год публикации - 2018)
10. Кулешов К.В., Гоптарь И.А., Маркелов М.Л., Колясникова Н.М., Koetsveld J., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Hovius J.W., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Полногеномное секвенирование шести клинических штаммов Borrelia miyamotoi, изолированных на территории России Журнал инфекционной патологии, Т. 23, №1-4. С. 24, 66. (год публикации - 2018)
11. Титков А.В., Миронов К.О., Платонов А.Е., Кулешов К.В., Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Стуколова О.А., Бондаренко Е.И., Ковалев С.Ю., Шипулин Г.А. Анализ антигенного разнообразия Bоrreliа miyamotoi – «нового» возбудителя иксодовых клещевых боррелиозов Журнал инфекционной патологии, Т. 23. № 1-4. С. 43, 83 (год публикации - 2018)
12. Якименко В.В., Платонов А.Е., Рар В.А., Колясникова Н.М., Тикунова Н.В. К проблеме межвидовых взаимоотношений близкородственных патогенных микроорганизмов на примере Borrelia miyamotoi и B.burgdorferi sensu lato Журнал инфекционной патологии, Т. 23. № 1-4. С. 46, 47, 84. (год публикации - 2018)
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Работы в 2019 проводились согласно плану, состоящему из 10-ти разделов.
1. Серологическими методами с использованием разработанного нами планарного белкового микрочипа исследована большая коллекция сывороток (более 3350 образцов), предоставленная нашими коллегами из Нидерландов.
Показано, что IgM и IgG антитела к B. miyamotoi встречаются у 1.4% и 1.2% голландских доноров, соответственно. В большинстве случаев эти антитела указывают на ранее перенесенную инфекцию, но возможны и бессимптомные случаи острой инфекции B. miyamotoi в момент забора крови.
Среди лиц с диагнозом «болезнь Лайма» у 5.4% обнаружены IgM антитела к B. miyamotoi, у 2.8% - обнаружены IgG антитела. Детальный анализ этих данных показывает, что 3.4% пациентов имели острую (ко)инфекцию B. miyamotoi и B. burgdorferi sl, еще 1.1% - анамнестические антитела к B. miyamotoi. Среди лиц, почувствовавших себя больными после присасывания иксодового клеща в Нидерландах, но не имевших мигрирующей эритемы (признак болезни Лайма), 18% пациентов можно поставить диагноз "острый иксодовый клещевой боррелиоз, вызванный B. miyamotoi" (ИКБ-БМ).
2. При исследовании 160 проб от 73 лиц с подозрением на клещевые инфекции в Новосибирске в 2018 г. серологически выявлено 28 случаев ИКБ-БМ, 20 из них подтверждены ПЦР. У 4 лиц обнаружены анамнестические IgG антитела, указывающие на ранее перенесенную инфекцию B. miyamotoi. При исследовании 103 проб от 67 больных из Челябинска четыре случая ИКБ-БМ подтверждены ПЦР и еще 4 случая – серологически.
3. В состав текущего (улучшенного) варианта планарного белкового иммуночипа для выявления антител к антигенам боррелий дополнительно включены еще три варианта Vmp (Variable major proteins) из семейства Vsp (Variable small protein), белок BBK32 («фибронектин-связывающий белок»), белок p39 (BmpA – «основной мембранный белок А») и белок CbiA («связывающий и ингибирующий комплемент белок»). В результате иммуночип включает 12 антигенов B. miyamotoi и 14 B. burgdorferi sensu lato. При использовании этого иммуночипа сохраняется 99%-100% специфичность, а чувствительность достигает 70-90% как для IgM, так и IgG антительного ответа на инфекцию B. miyamotoi.
4. В 2019 завершена потребовавшая больших усилий «референсная» сборка полного генома штамма Izh-4, состоящего из хромосомы, 12 линейных и трех кольцевых плазмид, на основе результатов, полученных с помощью оптимизированной технологии «коротких прочтений» (на платформе Illumina) и двух технологий «длинных прочтений» (Pacific Bioscience single-molecule real-time technology and Oxford Nanopore technology). Результаты депонированы в GenBank и NCBI Sequence Read Archive. При детальном анализе последовательностей «архивных плазмид» найден ген пятого варианта Vmp, Vlp-Beta. (Ранее считалось, что B. miyamotoi имеет только гены семейства Variable small proteins (Vsp) и гены семейства Variable large proteins (Vlp) в трёх антигенных вариантах (подсемействах) Vlp-Delta (VlpD), Vlp-Gamma (VlpG) и Vlp-alpha (VlpA)).
Шесть Екатеринбургских и один Красноярский штамм секвенированы на платформе Illumina и на платформе MinION (Oxford Nanopore technology). На основе первичных данных секвенирования на платформе Illumina, предоставленных голландскими коллегами, собраны и проанализированы геномы (хромосома и три плазмиды, включая «плазмиду вирулентности» lp41) двух штаммов B. miyamotoi, выделенных нашими соавторами в Нидерландах. Собранные и аннотированные нуклеотидные последовательности выложены в GenBank.
5. Выделена чистая культура B. miyamotoi от больного ИКБ-БМ в Красноярске (впервые в этой половине Земного шара). Пять штаммов, выделенных в 2018 гг. в Екатеринбурге, и штамм, выделенный в Красноярске в 2019, депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов, г. Оболенск.
6. Проводимое в 2020 г. типирование образцов ДНК B. miyamotoi методом мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) подтвердило вывод 2019 г.: разработанная нами схема МЛСТ функциональна, информативна и пока не требует модификаций.
Дополнительно к уже созданным в 2017-2018 гг. ПЦР-методикам выявления экспрессируемых генов Vmp были разработаны, испытаны и практически применены методики амплификации и секвенирования «длинных фрагментов» генов Vmp, кодирующих более 80% белковой последовательности, что позволило повысить достоверность и информативность описания многообразия вариантов B. miyamotoi, встречающихся в природе. В частности, у европейских штаммов и небольшой части российских изолятов были выявлены существенные мутации, потребовавшие использования дополнительных праймеров и зондов. Обнаружение в геноме VlpB (см. п. 4), потребовало включения в типирующую схему праймеров и к этому варианту. На настоящий момент экспресс-типирование проводится с помощью четырех смесей для мультиплексной ПЦР-РРВ. В первую смесь включен прямой праймер, комплементарный «азиатским/американским» вариантам бактериального промотора и обратные праймеры и зонды, специфические по отношению к Vsp, VlpD и VlpG. Вторая смесь включает тот же прямой праймер, и обратные праймеры и зонды, специфические по отношению к VlpA и VlpB. 3-я и 4-я смесь отличаются от 1-й и 2-й смеси, соответственно, только тем, что они содержат прямой праймер, комплементарный «европейскому» варианту бактериального промотора. Во всех смесях присутствуют контрольные праймеры и зонд, специфические для гена GlpQ B. miyamotoi.
Критически важно, что с помощью этих методик окончательно подтверждено наличие явления «иммунного избегания» при экспериментальном заражении полевок B. miyamotoi (см. п. 8 и 10)
7. Продолжено изучение многообразия вариантов B. miyamotoi, встречающихся в природе, используя для этого все доступные образцы ДНК B. miyamotoi, в частности, от больных ИКБ-БМ из Новосибирска, Челябинска и Красноярска, а также образцы из клещей I. ricinus, предоставленных чешскими, голландскими, бельгийскими и английскими коллегами, что позволило достовернее рассмотреть связи определенных геновариантов B. miyamotoi с приспособлением к организму определенного хозяина и с клиническими проявлениями ИКБ-БМ, вызываемого данным геновариантом.
9. Проведено исследование влияния B. miyamotoi на образование сгустка крови в модели, когда цельная кровь прокачивается через искусственный микрокапилляр, имитирующий естественный. Показано, что при добавлении B. miyamotoi более чем в два раза увеличивается площадь, занимаемая тромбами, а также увеличивается доля «сверхактивированных» тромбоцитов. На поверхность микрокапилляра оседает в два раза больше гранулоцитов, при этом они более подвижны и реже имеют признаки апоптоза по сравнению с гранулоцитами в контрольных условиях (без боррелий).
Методом проточной цитофлуорометрии показано, что добавление боррелий приводит к активации нейтрофилов (регистрируемой по экспрессии CD11).
При использовании спектрофотометрического метода регистрации подтверждено влияние B. miyamotoi на скорость «внутреннего» (контактно активируемого) пути свертывания в свободной от тромбоцитов плазме.
10. Проведено подкожное заражение полевок Myodes rutilus и беспородных белых мышей низкими дозами штамма Izh-14 (от 100000 до 1000 живых спирохет), имитирующее условия заражения в природе. Показано, что максимальная концентрация боррелий в крови (порядка 100000 на мл) достигается на 9-16 день после заражения дозой 100000 и достигается на 14-23 день после заражении дозой 1000 (порядка 1000 на мл). К 37 дню боррелии элиминируются из крови, хотя ДНК B. miyamotoi была обнаружена в мозгу и печени одной полевки через 60 дней после заражения.
В рамках энтомологических экспериментов было осуществлено прокормление личинок клещей I. persulcatus, I. pavlovskyi и I. apronophorus на мышах, зараженных B. miyamotoi; показано, что от 50% до 100% личинок становятся инфицированными. Образовавшиеся из этих личинок нимфы оказываются зараженными в 25-70% случаев, то есть, показана трансстадиальная передача возбудителя.
8. Ключевой проблемой патогенеза инфекции B. miyamotoi является реальное (экспрессируемое) многообразие Vmp и потенциальное (присутствующее в геноме, на плазмидах) многообразие «молчащих» генов Vmp, на которые может быть переключена экспрессия Vmp в ходе реализации механизма «иммунного избегания». В клинических условиях (см. п. 2 и 7) у 25% больных ИКБ-БМ обнаруживается ДНК двух или более экспрессируемых генов Vmp в крови. Более того, около 50% больных производят антитела к антигенному варианту Vmp, который отсутствовал в крови в момент выявления ДНК B. miyamotoi. Это косвенные признаки наличия «иммунного избегания».
В опытах на грызунах (см. п. 10) показано, что в крови животных, которым ввели штамм, экспрессирующий VlpG, на 6-20 день после заражения обнаруживаются популяции спирохет, экспрессирующих Vsp или VlpD (с различными аминокислотными последовательностями) и даже VlpB. При этом грызуны продуцируют антитела не только к VlpG, но и, в большинстве случаев, к антигенам VlpD и/или Vsp, и/или VlpA. Это прямое доказательство наличия «иммунного избегания» (Файл 1.6, рис. 12).
Именно механизм «иммунного избегания», реализуемый B. miyamotoi в процессе колонизации организма человека, приводит к тому, что B. miyamotoi, как и другие боррелии группы возвратных лихорадок, в отсутствии антибиотикотерапии способны вызывать несколько рецидивов лихорадки, разделенных 1-2 неделями относительно хорошего самочувствия больного.
На момент сдачи отчета в 2019 г. вышли четыре публикации в международных журналах, индексируемых в базах данных Web of Science Core Collection или Scopus, и 11 публикаций, индексируемых только в РИНЦ. Таким образом, обязательства по количеству публикаций в 2018-2019 гг. перевыполнены. Сделано 15 докладов, из них 7 устных докладов на международных научных мероприятиях.
Все запланированные на 2019 г. (и суммарно на 2018-2019 гг.) научно-исследовательские работы выполнены и ожидаемые результаты достигнуты.
Публикации
1. Koetsveld J., Платонов А.Е., Кулешов К.В., Wagemakers A., Hoornstra D., Ang W., и др. Borrelia miyamotoi infection leads to cross-reactive antibodies to the C6 peptide in mice and men. Clinical Microbiology and Infection, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.07.026
2. Кулешов К.В., Hoornstra D., Sprong H., Платонов А.Е., Hovius J.W. Draft Whole Genome Sequence of Two Western European Borrelia miyamotoi Isolates Microbiology Resource Announcements, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1128/MRA.01314-19
3. Кулешов Константин В., Gabriele Margos, Volker Fingerle, Joris Koetsveld, Ирина А. Гоптар, Михаил Л. Маркелов, Надежда М. Колясникова, Денис С. Сарксян, Нина П. Кирдяшкина, Герман А. Шипулин, Joppe W. Hovius, Александр Е. Платонов Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.21203/rs.2.16381/v2
4. Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Платонов А.Е. Клинические и лабораторные аспекты острого боррелиоза, вызванного Borrelia miyamotoi Материалы научно-практических конференций в рамках VI Российского конгресса лабораторной медицины (РКЛМ 2020). Изд. У Никитских ворот. Москва, С. 28-29 (год публикации - 2020)
5. Кулешов К.В., Margos G., Колясникова Н.М., Fingerle V., Koetsveld J., Шипулин Г., Hovius J.W.R., Платонов А.Е. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi strains. 29th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 13-16 April 2019. Amsterdam, The Netherlands. Материалы конгресса. Электронный ресурс., P0491 (год публикации - 2019)
6. Кулешов К.В., Миронов К.О., Титков А.В., Hoornstra D., Novakova M., Janecek J., Smajs D., Sprong H., Hovius J., Платонов А.Е. VMP-типирование изолятов нового патогена Borrelia miyamotoi, циркулирующих в странах Западной и Центральной Европы Молекулярная диагностика и биобезопасность - 2020. Сборник материалов. Под редакцией: В.Г. Акимкина, М.Г. Твороговой. Издательство ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Москва, C. 71 (год публикации - 2020)
7. Миронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В., Колясникова Н.М., Hovius J. W. R., Платонов А.Е. The genetic and antigenic diversity of the emerging tick-borne pathogen Borrelia miyamotoi. 29th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 13-16 April 2019. Amsterdam, The Netherlands. Материалы конгресса. Электронный ресурс., P1500 (год публикации - 2019)
8. Миронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В., Колясникова Н.М., Шипулин Г.А., Hovius J., Платонов А.Е. Антигенное и генетическое разнообразие нового клещевого патогена Borrelia miyamotoi. Инфекционные болезни в современном мире: эволюция, текущие и будущие угрозы. Материалы XI Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Москва, 1-3 апреля 2019 г.- Инфекционные болезни., С. 132-133 (год публикации - 2019)
9. Миронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В., Колясникова Н.М., Якименко В.В., Платонов А.Е. Методика детекции экспрессирующихся вариабельных главных поверхностных белков Borrelia miyamotoi, принадлежащих семейству variable large proteins (VLP) подсемейств alpha и beta Молекулярная диагностика и биобезопасность - 2020. Сборник материалов. Под редакцией: В.Г. Акимкина, М.Г. Твороговой. Издательство ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Москва, С. 73 (год публикации - 2020)
10. Миронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В., Платонов А.Е. Изучение многообразия поверхностных главных вариабельных белков (variable major proteins, VMP) нового патогена Borrelia miyamotoi Молекулярная диагностика и биобезопасность - 2020. Сборник материалов. Под редакцией: В.Г. Акимкина, М.Г. Твороговой. Издательство ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Москва, C. 74 (год публикации - 2020)
11. Платонов А.Е., Стуколова О.А., Миронов К.О., Колясникова Н.М., Кулешов К.В., Якименко В.В., Филькова А.А., Сарксян Д.С., Платонова О.В., Koetsveld J., Hovius J. An overview of multiple studies on the emerging tick-borne pathogen Borrelia miyamotoi in Russia: 2009-2019. International Symposium on Tick-Borne Pathogens and Disease. Book of absracts. Vienna. Robidruck Publ., С. 27 (год публикации - 2019)
12. Платонов А.Е., Стуколова О.А., Миронов К.О., Колясникова Н.М., Платонова О.В. Исследования нового возбудителя клещевых инфекций Borrelia miyamotoi в России. Инфекционные болезни в современном мире: эволюция, текущие и будущие угрозы. Материалы XI Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Москва, 1-3 апреля 2019 г.- Инфекционные болезни., С. 160 (год публикации - 2019)
13. Платонов А.Е., Стуколова О.А., Миронов К.О., Колясникова Н.М., Платонова О.В., Koetsveld J., Hovius J.W.R. A comprehensive overview of multiple studies on the emerging tick-borne pathogen Borrelia miyamotoi in Russia. 29th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 13-16 April 2019. Amsterdam, The Netherlands. Материалы конгресса. Электронный ресурс., O0573 (год публикации - 2019)
14. Платонов А.Е., Якименко В.В., Миронов К.О., Стуколова О.А., Титков А.В., Колясникова Н.М., Платонова О.В. Иммунное избегание» - один из механизмов патогенеза бактериальных инфекций (на примере иксодового клещевого боррелиоза, вызываемого Borrelia miyamotoi) Инфекционные болезни в современном мире: эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика. Сборник трудов XII Ежегодного Всероссийского интернет-конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Под ред. В.И. Покровского. Москва, C. 181 (год публикации - 2020)
15. Свешникова А.Н. , Филькова А.А., Титков А.В., Hovius J.W.R., Платонов А.Е. Interaction of the tick-borne pathogen Borrelia miyamotoi with the human blood coagulation system. 29th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 13-16 April 2019. Amsterdam, The Netherlands. Материалы конгресса. Электронный ресурс., P0514 (год публикации - 2019)
16. Стуколова О.А., Hoornstra D., Долгова А.С., Koetsveld J., Колясникова Н.М., Платонова О.В., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Шипулин Г.А., Hovius J., Платонов А.Е. The development, validation and application of plane protein microarray for the detection of anibodies against multiple antigens of Borrelia miyamotoi and B. burgdorferi. 29th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 13-16 April 2019. Amsterdam, The Netherlands. Материалы конгресса. Электронный ресурс., P1499 (год публикации - 2019)
17. Стуколова О.А., Koetsveld J., Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Карань Л.С., Долгова А.С., Маркелов М.Л., Hovius J., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Antibody response in Borrelia miyamotoi infection studied by protein microarray. International Journal of Infectious Diseases, 79 (S1), С.18 (год публикации - 2019) https://doi.org/10/1016/j.ijid.2018.11.059
18. Стуколова О.А., Ursinus J., Hoornstra D., Долгова А.С., Платонова О.В., Кулешов К.В., Koetsveld J., Платонов А.Е. Изучение спектра антител к Borrelia burgdorferi sensu lato и Borrelia miyamotoi с помощью белкового микрочипа при эритемной форме болезни Лайма Молекулярная диагностика и биобезопасность - 2020. Сборник материалов. Под редакцией: В.Г. Акимкина, М.Г. Твороговой. Издательство ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Москва, C. 88 (год публикации - 2020)
19. Филькова А.А., Титков А.В., Свешникова А.Н., Hovius J., Платонов А.Е. The tick-borne pathogen Borrelia miyamotoi does not affect platelet activation, aggregation or functioning in vitro. 29th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 13-16 April 2019. Amsterdam, The Netherlands. Материалы конгресса. Электронный ресурс., P0520 (год публикации - 2019)
20. Филькова А.А., Титков А.В., Свешникова А.Н., Платонов А.Е. Взаимодействие патогенных боррелий Borrelia miyamotoi с системой свертывания крови человека. Инфекционные болезни в современном мире: эволюция, текущие и будущие угрозы. Материалы XI Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Москва, 1-3 апреля 2019 г.- Инфекционные болезни., С. 214 (год публикации - 2019)
21. Филькова А.А., Титков А.В., Свешникова А.Н., Платонов А.Е. Borrelia miyamotoi влияет на формирование гетероагрегатов тромбоцитов и нейтрофилов in vitro и образование тромбов ex vivo Инфекционные болезни в современном мире: эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика. Сборник трудов XII Ежегодного Всероссийского интернет-конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Под ред. В.И. Покровского. Москва, С. 238 (год публикации - 2020)
22. Черных В.И., Миноранская Н.С., Титков А.В., Платонов А.Е., Усков А.Н. Клиническое течение иксодового клещевого боррелиоза, вызванного Borrelia myiamotoi, в Красноярском крае Журнал инфектологии, Т. 12, № 2 (S1), С. 134-135. (год публикации - 2020)
23. Якименко В.В., Колясникова Н.М., Стуколова О.А., Рар В.А., Титков А.В., Koetsveld J., Hovius J., Платонов А.Е. Spirochaetemia and antibody response in voles experimentally infected with the emerging tick-borne pathogen Borrelia miyamotoi. 29th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 13-16 April 2019. Amsterdam, The Netherlands. Материалы конгресса. Электронный ресурс., O1069 (год публикации - 2019)
24. Якименко В.В., Колясникова Н.М., Стуколова О.А., Рар В.А., Титков А.В., Платонова О.В., Платонов А.Е. Динамика спирохетемии и продукции антител при экспериментальном заражении полевок спирохетами Borrelia miyamotoi - возбудителями иксодового клещевого боррелиоза. Инфекционные болезни в современном мире: эволюция, текущие и будущие угрозы. Материалы XI Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Москва, 1-3 апреля 2019 г.- Инфекционные болезни., C. 236 (год публикации - 2019)
Возможность практического использования результатов
Как и предполагалось в Заявке на грант, результаты проекта, несомненно, будут использованы в экономике и социальной сфере (медицине). На них должно базироваться улучшение качества медицинской помощи больным и переболевшим иксодовыми клещевыми боррелиозами, вызванными B. miyamotoi.
В частности, набор реагентов для ПЦР-диагностики клинических случаев инфекции B. miyamotoi и выявления ДНК B. miyamotoi в клещах и позвоночных хозяевах в окружающей среде зарегистрирован в 2018 по плану данного проекта РНФ. В этом есть и экономический аспект, поскольку данный набор реагентов производится и продается ЦНИИ эпидемиологии (https://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/?sid=2373 ) под торговой маркой «АмплиСенс®». Его использование улучшает качество диагностических услуг в лечебных учреждениях РФ и расширяет возможности эпизоотологического надзора, проводимого учреждениями Роспотребнадзора. После финализации антигенного состава планарного белкового иммуночипа для выявления IgM и IgG антител к специфическим антигенам B. miyamotoi планируется провести его клинические испытания.
После убедительного доказательства существования нового этиологического агента инфекционных заболеваний и соответствующей нозологической формы уже ставится вопрос о разработке стандартов лечения ИКБ-БМ и внесения этой инфекции в перечень учитываемых Роспотребнадзором заболеваний («Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях», Форма № 2).
Не только для исследования боррелиозов, но и для разработки новых подходов к борьбе с инфекционными заболеваниями в целом будут полезными: новая технология культивирования спирохет из крови больных; впервые примененная технология «гибридного» полногеномного секвенирования и соответствующий биоинформационный алгоритм для сборки геномов боррелий и других видов бактерий, имеющих много плазмид; методики генотипирования боррелий, и другие впервые разработанные или оптимизированные научные методики, использованные в проекте.