Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году коллектив исследователей ФГБНУ "Медико-генетического научного центра" совместно с врачами-психиатрами ПКБ №1 им. Алексеева получил грант РНФ № 18-15-00437 "Роль рибосомных генов в этиологии и патогенезе шизофрении. Прогностическое значение свойств комплекса рибосомных генов больного в ответе на терапию шизофрении". В задачи первого года исследований входило формирование выборок: больных шизофренией с использованием клинического, психометрического, патопсихологического методов исследования пациентов, принятых в психиатрической практике, и здоровых людей для последующего анализа генетических маркеров в клетках крови; написание компьютерной программы для создания базы данных выборки больных; формирование коллекции образцов ДНК и РНК, выделенных из крови больных шизофренией и здоровых доноров; создание коллекции культивируемых фибробластов кожи больных шизофренией и здорового контроля с охарактеризованным комплексом рибосомных генов; анализ молекулярно-генетических характеристик комплекса рибосомных генов пациентов с диагнозом "шизофрения" по сравнению со здоровым контролем. Поставленные задачи этапа 2018 г полностью выполнены. Получены результаты, необходимые для последующего обоснования концепции роли комплекса рибосомных генов человека в этиологии и патогенезе шизофрении. В процессе выполнения гранта собрана коллекция 669 образцов ДНК и 669 образцов РНК, выделенных из крови больных шизофренией и здоровых доноров. Выборка была сформирована из группы больных шизофренией (с диагнозом F21.3 - малопрогредиентной шизофренией протекающая с аффективно-бредовыми фазами и суицидальными тенденциями; F20.0 - параноидной шизофренией с синдромом Кандинского-Клерамбо на высоте приступа; F20.2 - кататонической шизофренией; F25.1 шизоаффективного расстройства с депрессивно-бредовой симптоматикой на высоте приступа) с благоприятным прогнозом до лечения (N=200) и после проведенного курса терапии (N=200); группы пациентов, больных шизофренией с длительностью заболевания более 5 лет (N = 164); группы контроля (N = 105) - психически и соматически здоровых доноров, не состоящих в родстве с исследуемыми пациентами, не имеющих семейной отягощенности шизофренией. За истекший период обследовано 469 испытуемых – как здоровых лиц, так и пациентов с различным типом течения шизофрении, которые на момент исследования находились на стационарном лечении в ПКБ №1 им. Алексеева. Все пациенты, больные шизофренией, максимально охарактеризованы с точки зрения заболевания и терапии. Применялись клинический, психометрический, патопсихологический методы исследования пациентов, принятые в психиатрической практике. Достоверность диагноза подтверждалась использованием при отборе пациентов в изучаемые группы диагностических критериев Международной классификации болезней десятого пересмотра (МКБ-10), проекта диагностических указаний Международной классификации болезней одиннадцатого пересмотра (МКБ-11) и Пятой редакции Диагностического и статистического руководства по психическим расстройствам (DSM-V). В исследование не включены больные с органическими заболеваниями головного мозга, признаками злоупотребления ПАВ. Все обследованные больные подписали информированное добровольное согласие. Процедура обследования пациентов, включенных в исследование, включает: характеристики течения болезни; характеристики влияния лекарственной терапии на динамику приступа и общее течение болезни; группы симптомов, установленные в МКБ-10 и МКБ-11 для диагностики шизофрении; группы симптомов для диагностики шизофрении, а также сопутствующие им симптомы, установленные в DSM-V; клинические габариты (дименсии) тяжести психотических симптомов (Clinical-Related Dimensions of Psychosis Symptom Severity); шкалу дифференцированной оценки симптомов; оценку выраженности клинических признаков; показатели валидизированных международных психометрических шкал (PANSS, SAS, NGS-A и др.). Обследование проходило в условиях острых отделений психиатрического стационара, где больные находились по поводу обострения психотических расстройств. В процессе выполнения 1-го этапа работы по гранту была создана база данных для хранения всей полученной клинической и молекулярно-биологической информации и для анализа всей совокупности данных. База данных учитывает возможность расширения и изменения параметров исследования. База данных и графический интерфейс к ней названа авторами DSD (Data Structure Designer). Основой клиентской части является графический интерфейс пользователя для отображения данных и составления запросов к серверной части. Серверная часть обеспечивается системой управления базами данных (СУБД), доступ к которой осуществляется через язык запросов (обычно SQL). Графический интерфейс реализован на языке Java на основе разработанной авторами библиотеки "VCL-подобные компоненты для программирования графического интерфейса на Java ", номер регистрации в ФИПС - № 2018616053. Ядро разрабатываемой СУБД также было зарегистрировано: Объектно-реляционная СУБД "DataStructDesigner", ФИПС : № 2018617956. И структура базы, и данные могут храниться на жестком диске в виде XML или двоичных файлов, а также на удаленном сервере в виде снимков (дампов) баз данных. Для хранения данных на удаленном сервере был разработан проект "Файловый сервер на основе MySQL". Он позволяет оперировать с файлами и каталогами на удаленном сервере, на котором установлена СУБД MySQL. Программа "Файловый сервер на основе MySQL" также была зарегистрирована в ФИПС - № 2018615158. Для проведения молекулярно-генетического анализа рибосомных генов (рДНК) больных шизофренией из каждого образца лейкоцитов крови всей обследованной выборки выделена клеточная ДНК и клеточная РНК. Создана коллекция 669 образцов ДНК и 669 образцов РНК, выделенных из крови больных шизофренией и здоровых доноров. Сформирована коллекция культивируемых фибробластов кожи больных шизофренией (N = 30) и здорового контроля с охарактеризованным комплексом рибосомных генов. Синтез белка, центральное событие в эукариотической клетке, зависит от скорости трансляции белка и от количества рибосом в клетке. Рибосома состоит из двух субъединиц, большой и малой, содержит около 80 рибосомных белков и 4 рибосомных РНК: 5S, 5.8S, 18S, 28S рРНК, кодируемых генами рибосомных РНК, также называемыми рибосомными ДНК (рДНК) или рибосомными повторами. Количество копий рДНК на геном в среднем составляет 400 копий, рибосомные повторы расположены тандемно на коротких плечах 13, 14, 15, 21, 22 хромосом и формируют ядрышкообразующие районы. Биогенез рибосом определяет уровень синеза белка в клетках, влияет на клеточную пролиферацию и функционирование клетки. Количество копий рибосомных генов, уровень их метилирования и уровень повреждения рДНК определяют эффективность биогенеза рибосом, что влияет на уровень биосинтеза белка в организме и является одной из характеристик адаптационных возможностей человека. Любая мутация, приводящая к патологии, реализуется в организме на фоне заданного уровня синтеза белка, который определяется, в том числе, и количеством рибосомных генов. На основании проведенного молекулярно-генетического анализа рибосомных генов больных шизофренией получены новые данные относительно количества копий рДНК, уровня метилирования рДНК, уровня повреждения рДНК, общего количества 18S рРНК и количества транскрипта 45S рРНК у больных шизофренией относительно здорового контроля. Для определения числа копий рДНК в геноме человека сначала подобрали метод анализа. Установили, что метод нерадиоактивной количественной гибридизации обладает значительными преимуществами перед методом количественной полимеразной цепной реакции, поскольку более эффективно определяет количество высококопийных поврежденных последовательностей рДНК в геноме. Показали, что геном пациентов с диагнозом "шизофрения" содержит достоверно увеличенное число копий рДНК по сравнению со здоровым контролем независимо от формы шизофрении и приема лекарственных препаратов. Разработали метод определения содержания метилированных копий рДНК. Показали, что геномы больных шизофренией, независимо от наличия терапии, содержат больший процент метилированных копий рДНК в геноме, чем геномы психически здоровых доноров. В геномах больных шизофренией повышено, как абсолютное, так и относительное количество метилированных копий рибосомных генов. Гиперметилированные копии рДНК всегда сильно перестроены, в отличие от малометилированных копий. По-видимому, метилированию подвергаются прежде всего перестроенные копии, чтобы блокировать транскрипцию этих копий с целью предотвращения нарушения в биогенезе рибосом. Разработали методы определения уровня повреждения рДНК. Показали, что рибосомные повторы у больных шизофренией содержат большее число повреждений по сравнению с контрольной группой, особенно в области 28S рДНК. Выборки больных шизофренией достоверно отличаются от выборки здоровых доноров по содержанию маркера окисления 8-oxodG по сравнению с контролем. Уровень окисления рДНК в геноме человека выше, чем уровень окисления уникального гена B2M, как в контрольной когорте, так и в когортах больных. Уровень окисления рДНК у больных шизофренией достоверно выше, чем у психически здоровых людей. Этот факт подтверждает более высокий уровень окислительного стресса в организме больных шизофренией, который неоднократно был описан другими авторами. Показано, что клетки крови больных шизофренией содержат повышенное количество зрелой 18S рДНК и повышенное количество фрагмента внешнего транскрибируемого спейсера (ETS), что указывает на более активный биогенез рибосом. Таким образом, в результате выполнения первого этапа проекта, получены новые данные о роли рибосомных повторов в патогенезе шизофрении. Сформированы уникальные коллекции 669 образцов ДНК и 669 образцов РНК, выделенных из крови больных шизофренией и здоровых доноров; культивируемых фибробластов кожи больных шизофренией (N = 30) и здорового контроля с охарактеризованным комплексом рибосомных генов. Написана новая компьютерная программа - база данных для хранения всей полученной клинической и молекулярно-биологической информации, зарегистрировано 3 программы в ЦИТИС; получено 3 запатентованных в ФИПСе Свидетельства о регистрации программ. Полученные результаты изложены в 2-х статьях, одна из которых опубликована в рецензируемом журнале, индексируемом в WoS, SCOPUS, PubMed, относящемся к Q1 (IF=4.151), представлены на конференции и опубликованы в виде тезисов. Полученные результаты соответствуют поставленным задачам, подтверждают актуальность темы проекта и целесообразность проведения дальнейших исследований. Совместный анализ количества четырех умеренных повторов генома – рибосомного, теломерного, сателлита III и мтДНК у больных шизофренией позволит выявить генетический маркер, определяющий риск развития шизофрении, выявить ключевые звенья патогенеза, включая интенсивность энергетического, белкового обмена, роль окислительного стресса, повреждения генома. Кроме того, планируемые исследования направлены на выявление генетических маркеров, предопределяющих высокую или низкую эффективность проводимой терапии, что позволит корректировать схемы лечения и определять прогноз заболевания. 1. Интервью Елены Малиновской литературно-художественному новостному порталу "Византийский ковчег " "Ученые - тоже люди..." - http://vizkov.com/articles/life/interview/elena_malinovskaya_uchenye_tozhe_lyudi_/?sphrase_id=10169 2. Интервью Георгия Костюка порталу Neuronovosti.Ru, посвященному новостям нейронаук и нейротехнологий "Нейронауке без клиницистов не разобраться в шизофрении" - https://zen.yandex.ru/media/neuronovosti.ru/neironauke-bez-klinicistov-ne-razobratsia-v-shizofrenii-5afb1299c3321b2347a25381

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В проекте РНФ № 18-15-00437 «Роль рибосомных генов в этиологии и патогенезе шизофрении» коллектив авторов впервые исследовал одновременно вариацию содержания в геноме лейкоцитов крови психически здоровых и больных шизофренией людей четырех высокоповторяющихся последовательностей генома человека – тандемного рибосомного повтора (рДНК), тандемного повтора прицентромерного гетерохроматина 1q12 сателлита III (f-Sat III), тандемного теломерного повтора (TR) и митоходриальной ДНК (мтДНК). В задачи проекта входило определение числа копий митохондриальной ДНК, теломерного повтора и повтора саттелита III на выборке больных шизофренией и здоровых доноров, анализ локализация повтора сателлита III (1q12) в интерфазном ядре и экспрессии генов, характеризующих уровень апоптоза лимфоцитов крови у пациентов с диагнозом «шизофрения» и в контрольной выборке; анализ корреляций полученных показателей с клинической формой и типом течения шизофрении и с ответом больного на проводимую терапию. Все исследования, запланированные на второй год выполнения проекта, выполнены в полном объеме. Получены новые, ранее не опубликованные, данные об изменении числа копий тандемных повторов генома у больных шизофренией по сравнению с контролем, об изменении уровня апоптоза в клетках крови больных шизофренией в зависимости от длительности течения заболевания и проводимой терапии. В 2019 году коллекция ДНК и РНК расширилась за счет добавления 168 образцов ДНК и РНК больных после курса терапии в стационаре, 149 пациентов с верифицированным стационарным обследованием диагнозом шизофрения с длительностью заболевания более 5 лет и 36 контрольных образцов психически и соматически здоровых людей. Таким образом, в процессе выполнения гранта нами собрана коллекция 822 образцов ДНК и 822 образцов РНК, выделенных из крови больных шизофренией и здоровых доноров. Уникальность коллекции обусловлена тем, что все пациенты, больные шизофренией, максимально охарактеризованы с точки зрения заболевания и терапии. В процессе выполнения работ по гранту возникла необходимость упорядочить весь накапливающийся при исследовании материал: клинические, биохимические и молекулярно-биологические характеристики больных шизофренией. Была создана «База данных клинико-биохимических параметров и молекулярно-биологических характеристик больных шизофренией», получено свидетельство ФИПС № 2019620504. Усовершенствование метода нерадиоактивной гибридизации для количественного определения высокоповторяющихся последовательностей в геноме потребовало создания программы для обработки результатов анализа нуклеиновых кислот методом нерадиоактивной количественной гибридизации. Для обработки результатов эксперимента написана «Программа вычисления интегральной интенсивности области ДНК на фильтрах (Images)», получено свидетельство ФИПС № 2019617147. Кроме того, в процессе работы потребовалось применение компьютерной программы для анализа локализации саттелита III в интерфазных ядрах лимфоцитов. Была создана «Программа определения локализации и взаимного расположения участков хромосом в интерфазных ядрах эукариотических клеток (Ellipse)», получено свидетельство ФИПС № 2019661442. Уникальность исследования заключается в том, что мы впервые смогли надежно определить содержание трех тандемных повторов в геноме и митохондриальной ДНК в большом количестве образцов. Вариабельность тандемных повторов генома человека мало исследована. Это связано с малой применимостью методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) к анализу тандемных повторов. Кроме того, метод ПЦР чувствителен к повреждению ДНК-матрицы. Больные шизофренией испытывают окислительный стресс, в результате чего ДНК клеток повреждается (причем исследуемый фрагмент и ген-стандарт могут повреждаться в различной степени), и результаты анализа копийности повторов методом ПЦР занижены. Разрабатываемый авторами метод нерадиоктивной количественной дот-гибридизации (NQH) позволяет определять содержание тандемных повторов в поврежденных образцах ДНК. Сравнение метода NQH с методом ПЦР показывает хорошую сходимость результатов для выборок здоровых молодых людей и культивируемых клеток, в то время как для выборок старых клеток и пожилых людей, людей, больных шизофренией, метод ПЦР дает заниженные результаты по сравнению с методом NQH. В центре внимания в данном проекте находятся рибосомные повторы человека. Рибосомные гены образуют в ядре клетки особую структуру – ядрышко и выполняют в клетке основную функцию – биогенез рибосом. От количества рибосомных генов в конечном итого зависит количество рибосом и уровень синтеза белка, особенно в условиях стрессорных воздействий. Однако в последние годы многие авторы обнаруживают неканонические функции рибосомных повторов и ядрышка. Одна из предполагаемых функций – стабилизация хроматина в целом и, особенно, стабилизация гетерохроматина. Нестабильность гетерохроматина приводит к высокому уровню повреждений ДНК и нарушению функционирования клетки. Показано, что низкое число копий рДНК приводит к сдвигу равновесия гетерохроматин-эухроматин в сторону эухроматина и уменьшает устойчивость клеток к действию повреждающих ДНК факторов. Мы проанализировали зависимости содержания в геноме лейкоцитов человека трех повторов (мтДНК, теломерного и сателлита III) от количества копий рибосомных повторов. Исследование вариации числа копий рДНК в рамках данного проекта на большой выборке (822 образца ДНК) показало, что геномы больных шизофренией содержат больше копий рДНК, чем геномы психически здоровых людей. Большое количество копий рДНК негативно сказывается на функционировании генома по ряду причин. 1). Большое число копий рДНК коррелирует с высоким уровнем биогенеза рибосом и с несбалансированным высоким уровнем синтеза белка. Синтез белка – энергоемкий процесс, потребляющий до 80% всех запасов АТФ клетки. Количество АТФ может не хватать на остальные процессы жизнедеятельности. На митохондрии клетки ложится очень большая нагрузка. Полагают, что высокий уровень биогенеза рибосом является причиной ускоренного старения. Чтобы обеспечить клетку нужной энергией, небходимо синтезировать больше митохондрий. Однако в клетках леченых больных шизофренией уровень мтДНК сравним с уровнем в контроле. В клетках нелеченых больных уровень мтДНК выше, но часть мтДНК повреждена. Параметр, показывающий количество мтДНК на одну копии рДНК в клетке, для выборки больных шизофренией достоверно ниже, чем для контроля. Таким образом, клеткам больных шизофренией, по-видимому, не хватает энергии вследствие несбалансированного биогенеза рибосом. Одно из направлений восстановления баланса – это снижение количества активно транскрибируемых копий рДНК, например, за счет дополнительного метилирования копий рДНК (это задача третьего года проекта РНФ). В рамках проекта мы также проверили гипотезу о наличии отрицательной корреляции между копийностью рДНК и мтДНК, сформулированную на основании данных биоинформатики ранее [Gibbons et al., 2014]. Для всех изученных выборок мы обнаружили слабую положительную корреляцию между числом копий мтДНК и рДНК. Такая корреляция нам кажется более реальной: высокий уровень биогенеза рибосом требует больше энергии, т.е. больше митохондрий. 2) Большое количество копий рДНК в геномах больных шизофренией коррелирует с низким количеством фрагмента повтора сателлита III (f-SatIII). Большинство геномов больных содержат мало f-SatIII на фоне большого количество копий рДНК. Показатель, равный отношению f-SatIII/число копий рДНК, для больных намного ниже, чем для здоровых людей. Вместе с тем в клетках больных мы обнаружили более активную транскрипции сателлитного повтора. Эта транскрипция является следствием хронического стресса, который испытывает организм больного. Данные о низком отношении f-SatIII/число копий рДНК подтверждают гипотезу о стабилизации гетерохроматина в случае большого количества в клетке рибосомных повторов. Большой размер повтора рДНК блокирует амплификацию сателлитных повторов, которая возникает благодаря переходу гетерохроматина в эухроматин. Возможно, именно этим можно объяснить аномально низкое содержание сателлита III в геномах больных. Большой размер кластеров рДНК также может создавать пространственные затруднения перемещения объемных фрагментов 1q12 в ядре в ответ на стресс или пролиферативные стимулы. Перемещение сателлита 1q12 в центр ядра и его сближение с ядрышком в ответ на стресс или пролиферативные стимулы неоднократно описывали ранее. Если размер сателлита очень большой, то он не сможет локализоваться в нужном районе ядра и занять правильную позицию по отношению к ядрышку и нормальный ответ на стресс или пролиферативный стимул не состоится. Такие клетки погибают, и популяция обогащается клетками с низким уровнем сателлита, которые успешно могут ответить на воздействие. 3) Признаком того, что большое количество копий рДНК в геноме человека ускоряет старение, являются данные о соотношении количества теломерного повтора и рДНК. Мы подтвердили данные других авторов о снижении количества теломерного повтора в клетках больных шизофренией. Максимальный уровень теломерного повтора мы фиксировали в образцах ДНК больных с низким количеством копий рДНК (ниже среднего). Также была обнаружена отрицательная корреляция между количеством копий рДНК и содержанием теломерного повтора в контрольной выборке. Наиболее информативным для характеристики про- и антиапоптотических процессов, происходящих в клетках, является соотношение уровней транскрипционной активности генов BCL2/ВАХ. Для больных шизофренией в остром периоде уровень коэффициента BCL2/ВАХ – на (10-20)% ниже контрольных значений, что свидетельствует о преобладании процесса апоптоза в клетках крови, и, вероятно, является реакцией на высокий уровень повреждений ДНК клеток крови. После проведенного успешного курса терапии больных шизофренией мы наблюдали приближение показателя BCL2/ВАХ к контрольным значениям. Достоверное повышение коэффициента BCL2/ВАХ ~ в 2 раза наблюдается у больных шизофренией с длительностью заболевания более 5 лет. При этом происходит увеличение числа клеток с поврежденной ДНК, не элиминирующихся из циркуляции из-за снижения уровня апоптоза. Полученные результаты по исследованию корреляции наличия двунитевых разрывов и уровня транскрипционной активности проапоптотического гена подтверждают наши данные о более активном процессе апоптоза у пациентов с острым психозом и о сниженном уровне апоптоза у больных шизофренией с длительностью заболевания более 5 лет. Таким образом, в результате выполнения первого этапа проекта, получены новые данные о роли комплекса тандемных повторов генома в патогенезе шизофрении. Сформированы уникальные коллекции 822 образцов ДНК и 822 образцов РНК, выделенных из крови больных шизофренией и здоровых доноров Написана база данных и две компьютерные программы; получено 3 запатентованных в ФИПСе Свидетельства о регистрации программ и базы данных. Полученные результаты изложены в 2-х опубликованных статьях, индексируемых в WoS, SCOPUS, PubMed (все опубликованы в Q1 по SJR). Одна статья принята в печать в журнал «Медицинская генетика», рецензируемый в РИНЦ (письмо из издательства прилагается). По итогам 44-его Конгресса FEBS, прошедшего в Кракове, Польша, выпущен сборник трудов конгресса как особый выпуск журнала FEBS Open Bio (рецензируется в WOS, IF = 1.959, Q2 по SJR). В этот сборник вошли 2 работы, в которых докладывались результаты проекта. Результаты доложены на международных конференциях, опубликовано 6 тезисов. Результаты Проекта за отчетный период были представлены на 6 российских и зарубежных международных конференциях, конгрессах и симпозиумах. В том числе: на трех отечественных научных мероприятиях и на трех зарубежных научных мероприятиях. Было сделан один устный и семь стендовых докладов. Полученные результаты соответствуют поставленным задачам, подтверждают актуальность темы проекта и целесообразность проведения дальнейших исследований. Планируемые исследования направлены на выявление генетических маркеров, предопределяющих высокую или низкую эффективность проводимой терапии, что позволит корректировать схемы лечения и определять прогноз заболевания.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В проекте РНФ № 18-15-00437 «Роль рибосомных генов в этиологии и патогенезе шизофрении» коллектив авторов впервые исследовал одновременно вариацию содержания в геноме лейкоцитов крови психически здоровых и больных шизофренией людей четырех высокоповторяющихся последовательностей генома человека – тандемного рибосомного повтора (рДНК), тандемного повтора прицентромерного гетерохроматина 1q12 сателлита III (f-Sat III), тандемного теломерного повтора (TR) и митоходриальной ДНК (мтДНК). В задачи третьего года выполнения проекта входило исследовать на культивируемых клетках в экспериментах in vitro влияния лекарственных препаратов и новых синтезированных соединений на характеристики комплекса рибосомных генов, теломерного повтора, повтора сателлита III (f-SatIII) и митохондриальной ДНК, а также интерпретация полученных данных. Все исследования, запланированные на третий год выполнения проекта, выполнены в полном объеме. Получены новые данные, имеющие признаки мирового приоритета, позволяющие предложить механизм, обуславливающий вариацию числа копий тандемного повтора f-SatIII в клетках больных шизофренией. В 2020 году, за третий год выполнения проекта опубликовано 4 статьи, 2 из которых - в изданиях, относящихся к первому квартилю; еще две статьи приняты в печать и готовятся к изданию в декабре 2020 – январе 2021 гг. За третий год выполнения проекта получено 2 свидетельства регистрации интеллектуальной деятельности Государственного образца (зарегистрированы в ФИПС программы): (1) получено Свидетельство ФИПС № 2020619093 «Circle Labels», программа написана для обработки экспериментальных данных, полученных с помощью метода световой и флуоресцентной микроскопии и позволяет вычислить площадь ядра, площадь окрашенных зон, количество окрашенных зон, координаты центра ядра; (2) получено Свидетельство ФИПС № 2020663606 «Моделирование расположения участков хромосом в интерфазных ядрах клеток» - разработан алгоритм реконструкции 2D изображения, полученного методом FISH в 3D, чтобы получить реальную информацию о локализации фрагментов генома в ядре. При выполнении проекта мы впервые обнаружили нестабильность содержания сателлитного прицентромерного повтора f-SatIII в клетках одной и той же клеточной популяции. В этом отношении сателлитный повтор похож на теломерный повтор, размер которого варьирует в зависимости от возраста клеточной популяции и наличия в популяции окислительного стресса. Было показано, что одна и та же клеточная популяция значительно гетерогенна по содержанию сателлитного повтора в клетках. Мы исследовали механизм, обуславливающий вариацию числа копий тандемного повтора f-SatIII в клетках больных шизофренией, поскольку понимание фундаментальных основ организации и изменния числа тандемных повторов может способствовать оптимизации подходов к лечению больных шизофренией. Мы заметили закономерность: в центре ядра облученных лимфоцитах или стимулированных лимфоцитов намного чаще встречаются метки с малой площадью, чем на периферии ядра. Аналогичный ответ мы наблюдали для ядер лимфоцитов больных шизофренией: к центру ядра преимущественно перемещаются локусы с малым размером локуса 1q12. В серии экспериментов мы подтвердили, что объемные локусы 1q12 в силу пространственных причин не способны к перемещению в пространстве ядра в ответ на различные стимулы (окислительный стресс или стимуляция пролиферации) и остаются на периферии ядра. Проведенные эксперименты на мононуклеарах крови и культивируемых стволовых клетках подтвердили, что в условиях эндогенного (приступ шизофрении) или экзогенного (действие радиации или пероксида водорода) индуктора окислительного стресса два объемных тандемных повтора двигаются навстречу и локализуются в области сферического кольца радиусом от 0,55 до 0,65 (радиус ядра принят за единицу). Такие изменения в локализации двух повторов отражают изменения в пространственной структуре хроматина, которые, по-видимому, необходимы для изменения профиля экспрессии всего генома для нормального ответа на окислительный стресс. Описали возможный механизм, который обуславливает снижение количества копий сателлитного повтора в составе ДНК больных шизофренией. Клетки с низким количеством повтора (малый размер домена 1q12) способны к пролиферации и к развитию адаптивного ответа на стресс. Оба процесса требуют перемещения 1q12 в ядре и его сближения с ядрышком, которое увеличивается в ответ на стресс или пролиферативный стимул. Адаптивный ответ повышает устойчивость клеток к стрессу. Таким образом, клетки с малым содержанием f-SatIII имеют большой пролиферативный потенциал и устойчивы к генотоксичному стрессу. В некоторых клетках происходит переход гетерохроматина сателлита III в эухроматин и активируется транскрипция сателлита. Этот процесс приводит к увеличению содержания f-SatIII в ДНК клетки, и эти клетки пополняют фракцию клеток с большим размером повтора f-SatIII. Клетки с большим содержанием f-SatIII накапливаются в популяции при естественном и репликативном старении и при действии малых доз радиации. Клетки не способны к пролиферации, а при более интенсивном воздействии гибнут, так как не способны к адаптивному ответу. Выделенные из крови лимфоциты больных шизофренией имеют признаки активации, характерные для контрольных лимфоцитов, которые облучили малыми дозами рентгеновского излучения. В ядрах наблюдали транслокацию доменов 1q12 малого размера в центральные области ядра, при этом ядрышки занимали большую площадь и сближались с областью 1q12. Можно предположить, что в организме больных окислительный стресс хронически стимулирует адаптивный ответ, направленный на активацию репарационных, антиокислительных и антиапоптотических систем. У части больных шизофренией мы описали адаптивный ответ, который позволяет выживать клеткам с поврежденной ДНК. Для больных шизофренией мы также фиксировали значительное увеличение уровня гибели клеток. По-видимому, в организме больных процесс селекции клеток крови по содержанию повтора f-SatIII значительно ускорен по сравнению с контролем. Дополнительным фактором, направленным на отбор клеток только с низким количеством f-SatIII, является большой размер ядрышка, которое содержит больше рДНК, чем ядрышко контрольных клеток. Известно, что рибосомный повтор в составе ядрышка стабилизирует гетерохроматиновые участки в ядре. Большое содержание рДНК в геноме сдвигает баланс гетерохроматин-эухроматин в сторону гетерохроматина. Было также показано, что изменение содержания рДНК в геноме приводит к значительным конформационным перестройкам в ядре, что сопровождается изменением профиля экспрессии многих генов, которые пространственно расположены на значительном расстоянии от ядрышка. Низкое содержание f-SatIII в ДНК лейкоцитов крови больных шизофренией, которое мы впервые обнаружили при выполнении проекта, можно объяснить тремя причинами: (1) Большие размеры кластеров рДНК стабилизируют гетерохроматин 1q12, снижая интенсивность процесса транскрипции сателлита, который способствует увеличению количества f-SatIII. (2) Хронический окислительный стресс индуцирует адаптивный ответ только в клетках с низким содержанием f-SatIII. (3) Клетки с высоким содержанием f-SatIII, в которых адаптивный ответ блокирован, менее устойчивы к повреждающему воздействию и гибнут. Чтобы подтвердить предложенный нами механизм, который потенциально может обуславливать вариацию содержания сателлитного повтора в клетках человека, а также найти практическое применение обнаруженным новым фактам, мы провели дополнительные исследования и сравнили уровни маркеров окислительного стресса в выделенных лимфоцитах больных шизофренией с содержанием двух тандемных повторов (рибосомного и сателлитного f-SatIII). Проведенные исследования на выборке больных шизофренией и студентов при экзаменационном стрессе позволили предположить, что в самом начале патологического процесса в клетках крови больных шизофренией происходили те же изменения, что и у студентов при стрессе – стресс индуцировал транскрипцию сателлита III, что привело к увеличению числа клеток крови с большим содержанием повтора. В организме больных шизофренией к моменту госпитализации стресс принимает хронический характер и все клетки с большим содержанием повтора f-SatIII элиминируются из кровотока. Кроме того, высокий уровень окислительного стресса может блокировать транскрипцию сателлита III в клетках. Поэтому мы фиксируем низкое содержание повтора сателлита III в ДНК большинства больных шизофренией. Для исследования влияния антипсихотиков и новых синтезированных соединений на копийность высокоповторяющихся последовательностей генома в культивируемых фибробластах кожи больных шизофренией и здорового контроля, были выбраны соединения, которые применялись для купирования психоза и стабилизации психического состояния у больных шизофренией: галоперидол; рисперидон; трифтазин; вальпроевая кислота; оланзапин, а также два соединения, влияющие на уровень метилирования рДНК - димерные бис-бензимидазолы (DBP2 и DBP3); а также три соединения, которые обладают способностью связывать активные формы кислорода на фоне низкой токсичности – 2 производных фуллерена С-70 и CeO2, которое существует в водных растворах в форме наночастиц. Все соединения были исследованы на токсичность в МТТ-тесте и выбрана нетоксичная концентрация для этих соединений. Мы не обнаружили достоверной разницы между контрольными клетками и клетками, обработанными антипсихотиками или исследуемыми соединениями, по содержанию копий рибосомного повтора. Число копий рДНК не зависело от времени культивирования и присутствия в растворе антипсихотиков или соединений. Таким образом, мы еще раз подтвердили стабильность содержания рДНК в геноме человека. В отличие от рДНК, содержание сателлитного повтора f-SatIII в ДНК культивируемых клеток не стабильно. При длительном культивировании (4 суток) в присутствии антипсихотиков или соединений содержание повтора значительно изменяется. Штаммы с исходно низкими уровнями повтора (ниже 15 пг/нг ДНК) при культивировании с антипсихотиками повышают содержание повтора. Штаммы с высокими уровнями повтора, напротив, снижают содержание повтора. Изменения пропорциональны исходному количеству повтора f-SatIII в штамме. Относительно высокое число копий рибосомного повтора в геноме штаммов фибробластов больных шизофренией коррелирует с относительно низким содержанием f-SatIII и более высоким уровнем изменения содержания этого повтора в присутствии антипсихотиков или исследуемых соединений. Действие антипсихотиков или исследуемых соединений на транскрипционную активность генов рДНК, сателлита III, а также генов BAX, BCL2 и Р53 зависит от природы штамма и не имеет универсального характера. Однако, через 24 часа после добавления к клеткам антипсихотиков или исследуемых соединений мы фиксировали положительную высоко достоверную корреляцию между двумя транскриптами сателлитной ДНК (транскриптом РНК SATIII(1) и транскриптом РНК SATIII(9)). Транскрипция сателлитных повторов происходит синхронно. По-видимому, имеется общий механизм, который инициирует транскрипцию некодирующих РНК с сателлита III, локализованного в прицентромерном участке на первой и на девятой хромосомах. В экспериментах на нейронах показали, что вальпроевая кислота не влияет на общее количество копий рДНК и уровень повреждения рДНК, но повышает количество рРНК и 45S рРНК, а также РНК генов Bdnf и Ngf, в присутствии вальпроевой кислоты значительно возрастало число отростков нейронов и контактов между ними. Показали с использованием флуоресцентной микроскопии, что ядрышки фибробластов больных шизофренией содержат повышенный уровень 5- метил-дезоксицитозина, что подтверждает универсальный характер эпигенетической регуляции в геноме разных клеток человека. Эксперименты, проведенные на клетках разного типа, подтверждают, что окислительный стресс при шизофрении носит системный характер. По-видимому, в мозге больного могут протекать те же процессы, что и в клетках крови. Мы обнаружили значительную вариабельность в содержании повтора f-SatIII в ДНК клеток 8-ми различных участков мозга одного умершего больного шизофренией. Содержание f-SatIII варьировало от 5 пг/нг (left hemisphere – postcentral gyrus) до 32 пг/нг ДНК (striatum – caudate nucleus) на фоне стабильного содержания рибосомного повтора. Этот факт может указывать на различный уровень окислительного стресса в различных участках мозга при жизни больного SZ. Возможно, низкое содержание f-SatIII в ДНК в сочетании с низким уровнем окисления ДНК свидетельствует об отсутствии стресса в популяции клеток. Это состояние характерно для клеток молодого организма в отсутствие стресса. Популяция клеток с высоким содержанием f-SatIII в ДНК, по-видимому, испытывает умеренный стресс, который индуцирует транскрипцию ДНК SATIII и увеличение числа копий повтора f-SatIII в субпопуляции клеток. При этом стресс недостаточно интенсивный, чтобы индуцировать гибель клеток с большим размером гетерохроматина 1q12. Накопление таких клеток в популяции может нарушать функционирование ткани мозга, поскольку клетки с большими блоками гетерохроматина не могут изменять пространственную конфигурацию хроматина в ответ на различные стимулы. Низкое содержание f-SatIII в ДНК в сочетании с высоким уровнем окисления ДНК указывает на высокий уровень повреждения ДНК и на высокий уровень гибели клеток данной популяции. Участки мозга с такими свойствами клеток, по-видимому, потеряли часть клеток и функционируют неправильно. Таким образом, в ходе выполнения проекта мы показали, что окислительный стресс является наиболее вероятной причиной низкого содержания сателлитного повтора в составе ДНК клеток крови. Нам представляется актуальным дальнейшее исследование вариации числа копий тандемных повторов генома человека в клетках больных SZ. Например, более подробный анализ содержания четырех маркеров – рДНК (стабильный признак) и f-SatIII, теломерный повтор, уровень 8-oxodG (нестабильные признаки) в образцах ДНК, выделенной из множества различных участков мозга психически здоровых и больных людей, может дать ценную информацию об уровне окислительного стресса и о нарушении функционирования различных участков мозга при шизофрении, что позволит еще более приблизиться к пониманию биохимических причин развития шизофрении. Полученные в ходе выполнения проекта результаты соответствуют поставленным задачам, подтверждают актуальность темы проекта и целесообразность проведения дальнейших исследований. В 2020 году в интернет-издании «Коммерсантъ наука» вышла статья под названием «Сколько человеку нужно рибосом для долгой жизни», где был подробно описан метод определения количества копий рибосомных генов, а также рассказано о совместной работе членов коллектива с врачами-психиатрами из психиатрической клинической больницы №1 им. Н. А. Алексеева по исследованию роли рибосомных генов в причинах и механизмах развития шизофрении (https://www.kommersant.ru/doc/4215243). Помимо этого в этом году члены коллектива приняли участие в мероприятии «Дни без турникетов» в рамках фестиваля науки Nauka 0+. По этому поводу на портале youtube.com был выложен ролик о посещении участников фестиваля лаборатории и о проведенных лекциях (https://youtu.be/qyXIWzYoGvM).