Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В соответствии с планом на 2018 год, были выполнены следующие работы и получены научные результаты: 1. Проведение широкогеномного бисульфитного секвенирования 50 образцов ТН РМЖ и 50 образцов LumB РМЖ (образцы core-биопсии). Широкогеномное бисульфитное секвенирование выполнено для 100 образцов биоптатов рака молочной железы (РМЖ), полученных до начала неоадъювантной химиотерапии. Выборку составили 50 образцов тройного негативного РМЖ (ТН РМЖ) и 50 образцов люминального В (LumB) иммуногистохимического подтипа. Широкогеномное бисульфитное секвенирование образцов ДНК, полученных из биоптатов опухолей молочной железы, выполняли в строгом соответствии с разработанной и опубликованной нами ранее [Tanas et al., 2017] технологией XmaI-RRBS (reduced representation bisulfite sequencing – бисульфитное секвенирование ограниченных выборок геномных локусов). Единообразие методики обеспечило нам в дальнейшем возможность сопоставления результатов выполняемого проекта с ранее полученными результатами и включения новых образцов в общую пополняемую коллекцию лаборатории с целью уточнения формируемого эпигенетического классификатора подтипов РМЖ. Таким образом, пополнена самая крупная в мире коллекция данных RRBS аннотированных образцов РМЖ, созданная в лаборатории, выполняющей исследования по проекту. В настоящее время в нашем распоряжении имеются собственные результаты широкогеномного бисульфитного секвенирования более 200 образцов РМЖ, клеточных линий РМЖ и нормальных тканей молочной железы. Другими коллективами созданы массивы данных о метилировании ДНК в широкогеномном масштабе на коллекциях образцов РМЖ, в том числе, превышающих по объему изучаемую нами, однако наиболее распространенный способ получения данных на сегодняшний день в мире – гибридизация на чипах с определением состояния метилирования заранее заложенных в дизайн чипа CpG-динуклеотидов – принципиально отличается от нашего подхода характером получаемой информации. Применяемый нами способ широкогеномного бисульфитного секвенирования ДНК XmaI-RRBS нацелен на определение состояния метилирования в пределах каждого исследуемого промоторного CpG-островка нескольких последовательно расположенных CpG-динуклеотидов, что не только позволяет более детально изучать паттерны метилирования промоторов генов, но и получать, минуя этап дополнительного секвенирования, непрерывные карты метилирования CpG-островков для всей выборки образцов, что крайне важно при разработке диагностических тест-систем на основе ограниченного количества маркеров метилирования ДНК. 2. Формирование на основе полученных результатов эпигенетического классификатора подтипов РМЖ. Определение дифференциально метилированных участков генома, различающих молекулярные подтипы РМЖ. Несмотря на то, что в рамках выполняемого проекта основное внимание уделяется характеристике образцов ТН РМЖ и LumB РМЖ, результаты широкогеномного бисульфитного секвенирования по образцам этих иммуногистохимических подтипов получены тем же методом, что и ранее охарактеризованная в лаборатории когорта образцов РМЖ, гетерогенная по ИГХ-подтипам. Это позволило нам объединить оба набора данных и осуществить иерархическую кластеризацию расширенной выборки для уточнения эпигенетического классификатора подтипов РМЖ на основе широкогеномного секвенирования бисульфит-модифицированной ДНК, что привело к получению принципиально новых результатов. В наших более ранних работах, а также в работах других авторов, использовавших иные методы широкогеномного анализа ДНК [Davalos et al., 2017; Cancer Genome Atlas Network, 2012], на основе методов иерархической кластеризации удавалось идентифицировать некоторое количество (от 5 до 12) эпигенотипов РМЖ, лишь один из которых всегда коррелировал с ИГХ-подтипом опухолей (а именно, с ТН РМЖ), другие же не имели специфического отношения к конкретным ИГХ-подтипам. В рамках настоящего проекта, как будет показано ниже, 5 из 6 опухолевых метилотипов оказались обогащёнными образцами конкретных ИГХ-подтипов, и лишь один из высокометилированных метилотипов (названный нами «гиперметилированный смешанный») включил в себя образцы опухолей всех ИГХ-подтипов. В результате нами определено по три метилотипа РМЖ в каждом из двух главных суперкластеров (умеренно метилированном и гиперметилированном по промоторным CpG-островкам генов): умеренно метилированный ТН РМЖ, умеренно метилированный LumB, умеренно метилированный HER2+, гиперметилированный HER2+, гиперметилированный люминальный и гиперметилированный смешанный. Определены дифференциально метилированные участки генома, различающие молекулярные подтипы РМЖ. 3. Определение паттернов метилирования ДНК, маркирующих опухоли с разным ответом на НАХТ. Эта задача решалась на основе результатов широкогеномного анализа метилирования геномов ТН РМЖ и LumB, проведенного в рамках выполнения первой задачи этапа 2018 года. Определение паттернов метилирования ДНК, маркирующих опухоли с разным ответом на НАХТ, проводили методом иерархической кластеризации. Поскольку в задачи проекта входит не только формирование систем диагностических эпигенетических маркеров, но и выявление основных метаболических путей и биологических процессов, нарушения которых посредством аномального метилирования ДНК характерны для конкретных подтипов РМЖ, из всех дифференциально метилированных CpG-динуклеотидов, маркирующих опухоли с разным ответом на НАХТ, мы отобрали те, которые расположены в промоторных CpG-островках генов и статус метилирования которых потенциально может отражать транскрипционную активность соответствующих генов. Поведенный таким образом анализ выявил 169 гиперметилированных промоторов генов, маркирующих тройные негативные опухоли, чувствительные к НАХТ и 119 – маркирующих нечувствительные опухоли (после НАХТ обнаруживаются резидуальные опухоли). В выборке опухолей люминального В подтипа количество таких дифференциально метилированных генов составило соответственно 47 и 152. На основе составленных списков дифференциально метилированных генов нами определен состав списка кандидатов маркеров метилирования ДНК для формирования панели из ограниченного числа маркеров (см. задачу 5). 4. Выявление основных метаболических путей и биологических процессов, нарушения которых посредством аномального метилирования ДНК характерны для конкретных подтипов РМЖ. Для характеристики основных молекулярных функций и биологических процессов, нарушения которых могут отличать опухоли, принадлежащие двум «суперметилотипам» РМЖ, гиперметилированному и умеренно метилированному по промоторным CpG-островкам генов, были выбраны 1000 наиболее высокоэнтропийных CpG-динуклеотидов. Поскольку смысл технологии широкогеномного секвенирования заключается в определении состояния метилирования нескольких последовательных CpG-динуклеотидов в пределах одного CpG-островка, оказалось, что выбранные 1000 CpG-динуклеотидов принадлежат промоторам 162 генов (в среднем не менее 6 последовательных CpG-динуклеотидов на один промотор). Все эти промоторы показали повышенные уровни метилирования в группе гиперметилированных опухолей по сравнению с умеренно метилированными. Функции соответствующих генов включают в себя регуляцию транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II, регуляцию ангиогенеза, апоптоза, органного морфогенеза, тканевой и клеточной дифференцировки. Особое внимание обращает на себя обилие факторов, вовлеченных в нейрогенез. Перепредставлены гены, белки которых задействованы в транспорте ионов калия. Обращает на себя внимание метилированное состояние в гиперметилированном суперкластере промоторов генов метаболических ферментов и их регуляторов, что подразумевает значительные метаболические различия между эпигеномноми подтипами РМЖ. Эти различия могут в значительной степени определять чувствительность опухолей к химиотерапии, а сопутствующие эндофенотипы (паттерны метилирования) могут оказаться удобными маркерами эффективности терапии. 5. Определение состава списка кандидатов маркеров метилирования ДНК для формирования панели из ограниченного числа маркеров. Определен состав списка кандидатов маркеров метилирования ДНК для формирования панели из ограниченного числа маркеров: ABCA3, BNC1, CDO1, CLEC14A, DLEU2, DOK1, DPYS, GFRA1, GMDS (3’-UTR CpG-островок), GRIK1, INTS4L1, IRF4, LAMA3, OXT, PLCD1, PRKCB, PRR5, PSKH2, RABL6, SEPT9, SNAP25, TLX3, TMEM132C, TMEM132D, TTC34, VGLL4, MYO15B, SFRP2, PTGER2, PTGIS, KRTCAP3, TERT и CpG-островок 33-го экзона гена ITGB4 (всего 33 CpG-островка). В сформированном списке 11 из 33 маркеров (ABCA3, DPYS, PRKCB, TMEM132C, TMEM132D, TTC34, VGLL4, CLEC14A, MYO15B, SFRP2 и TERT) потенциально маркируют чувствительность к НАХТ опухолей обоих изучаемых в рамках проекта ИГХ-подтипов. Проведенное обоснованное определение состава списка кандидатов маркеров метилирования ДНК для формирования панели из ограниченного числа маркеров представляет собой основной задел для проведения исследований в 2019 году.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В соответствии с планом на 2019 год, были выполнены следующие работы и получены научные результаты: Проведена характеристика выявленных на предыдущем этапе выполнения проекта потенциальных маркеров метилирования ДНК, различающих опухоли молочной железы, чувствительные и нечувствительные к неоадъювантной (предоперационной) химиотерапии, в выборках из 100 образцов тройного негативного (ТН) и 100 образцов LumB иммуногистохимических подтипов рака молочной железы (РМЖ). Характеристику маркеров проводили методами метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Для обоснованного включения в дизайнируемые ПЦР-продукты CpG-динуклеотидов, показавших наибольший дискриминативный потенциал по результатам широкогеномного анализа метилирования метилирования методом XmaI-RRBS, проведенного на предыдущем этапе выполнения проекта, разработали способ визуализации полученных значений уровней метилирования CpG-динуклеотидов в выборках образцов ТН и LumB РМЖ, отдельно – для групп опухолей, чувствительных и нечувствительных к примененным схемам неоадъювантной химиотерапии (НАХТ). Способ визуализации реализован в виде пользовательского трека геномного браузера UCSC Genome Browser, что позволяет проводить визуальное сопоставление позиций CpG-динуклеотидов и характера их метилирования в исследуемой выборке с любыми аннотациями структурных и функциональных свойств участков генома, доступных в UCSC Genome Browser, в том числе с расположением сайтов узнавания чувствительных к метилированию эндонуклеаз рестрикции, которое особенно важно учитывать в ходе дизайна праймеров для МЧ-ПЦР. Разработанный пользовательский трек доступен по ссылке: http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg19&position=chr5%3A1290842-1295748&hubUrl=https://tools.epigenetic.ru/files/ucsc-tracks/rrbs_bc.nact/hub.txt Характеристика кандидатных маркеров метилирования ДНК проведена методами МЧ-ПЦР с учетом разработанных коллективом требований к дизайну МЧ-ПЦР: включение положительного внутреннего контроля эффективности ПЦР и контроля полноты гидролиза геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой рестрикции. Дизайн праймеров проводили с помощью программного обеспечения MPprimer. Работа программы применительно к задачам выполняемого проекта требует значительных вычислительных мощностей. Для обеспечения выполнения работы в разумные сроки мы внедрили многопоточную обработку, позволяющую эффективно (с ускорением в десятки раз по сравнению с оригинальным подходом) проводить вычисления на современных многоядерных процессорах. Формирование панели маркеров метилирования ДНК, различающей группы с наличием или отсутствием ответа на НАХТ, с использованием минимального количества признаков при сохранении качества классификации проведено с учетом характеристик чувствительности и специфичности маркеров, полученных экспериментально методом МЧ-ПЦР. Также, ограничение спектра маркеров для формирования классификатора на основе выявленных эпигеномных нарушений проведено с использованием метода Random Forest, позволяющего определить диагностическую ценность маркеров. Оба статистических метода, использованные для выбора маркеров, показали схожие результаты. Количество маркеров метилирования ДНК, отобранных таким образом для формирования тест-систем для прогноза эффективности НАХТ, применяемой к ТН РМЖ, составило 9, к LumB РМЖ – 12. Универсальным маркером, показавшим высокие значения диагностической точности в обеих группах - ТН и LumB РМЖ – признан ABCA3, который будет включен в тест-системы для прогноза эффективности НАХТ для обоих типов РМЖ. По результатам нашего исследования, аномальное метилирование промотора гена ABCA3 достоверно чаще наблюдается в группе ТН РМЖ с хорошим ответом на НАХТ (92% образцов против 59% образцов в группе ТН РМЖ с плохим ответом на НАХТ, р=0.02). В группе LumB РМЖ с хорошим ответом на НАХТ аномальное метилирование ABCA3 наблюдалось в 72% опухолей против 39% образцов с плохим ответом на НАХТ, р=0.0016. ABCA3 принадлежит к семейству АТФ-связывающих кассетных белков (ABC-транспортеров). Это большая группа трансмембранных белков, функцией которых является транспорт веществ через биологические мембраны. Известно, что транспортер ABCA3, с одной стороны, способен активно выводить из клетки химиопрепараты, с другой – нарушение его экспрессии в опухолях молочной железы статистически достоверно чаще наблюдается в РМЖ с метастазами в лимфоузлы и является независимым значимым маркером риска рецидивирования опухоли (Schimanski S. et al., 2010). В нашем исследовании лучший ответ на НАХТ показали опухоли с метилированным промотором гена ABCA3, то есть с потенциально инактивированным геном, что согласуется с литературными данными о роли белка ABCA3. В то же время, нам не удалось найти опубликованных работ о роли ABCA3 в формировании устойчивости РМЖ к неоадъювантной химиотерапии. Наиболее подробно изучен вопрос о его роли в формировании устойчивости к химиотерапии при остром миелолейкозе. Было показано, что из всех АВС-транспортеров, сверхэкспрессирующихся при ОМЛ, именно АВСА3 в наибольшей степени определяет устойчивость к химиотерапии (Steinbach D. et al., 2006). Для панели прогноза чувствительности к НАХТ опухолей LumB-подтипа выбраны следующие 12 маркеров: KRTCAP3, PTGIS, BNC1, TMEM132C, VGLL4, PLCD1, OXT, IRF4, GRIK1, CLEC14A, MYO15B, ABCA3. KRTCAP3 (ген кератиноцит-ассоциированного белка 3) показал в группе LumB значительно более высокую частоту метилирования среди образцов опухолей с плохим ответом на НАХТ – 83% против 29% среди образцов опухолей с хорошим ответом на НАХТ. KRTCAP3 входит в экспрессионную сигнатуру нормального эпителия молочной железы (Finak G. et al., 2006). По данным портала The Human Protein Atlas выживаемость больных РМЖ снижена в группе с пониженной экспрессией KRTCAP3 в опухолях. В недавно опубликованном исследовании (Bownes R. J. et al., 2019) KRTCAP3 позиционируется как один из 10 наиболее информативных генов, экспрессия которых маркирует ответ опухолей молочной железы на НАХТ по схеме FEC. PTGIS (простагландин-I2-(простациклин)-синтаза также входит в экспрессионную сигнатуру нормального эпителия молочной железы (Finak G. et al., 2006). Marotta L. L. C. et al. (2011) предположили, что ингибирование простагландинового пути (в том числе фермента PTGIS) может повысить эффективность лечения РМЖ за счёт снижения количества стволовых раковых клеток. Это предположение согласуется с нашим наблюдением повышенной частоты возможной инактивации PTGIS в опухолях с хорошим ответом на НАХТ (88% против 56% образцов опухолей с плохим ответом) за счет аномального метилирования его промотора. Базонуклин (BNC1) модулирует TGF-β1-индуцируемую дедифференцировку клеток эпителия молочной железы. Feuerborn A. et al. (2015) показали, что RNAi-опосредованная супрессия BNC1 приводит к усилению межклеточной адгезии и значительно снижает TGF-β1-зависимую дезинтеграцию клеточного слоя и диффузию клеток. В нашем исследовании в группе опухолей с хорошим ответом на НАХТ аномальное метилирование BNC1 наблюдалось достоверно чаще, чем в группе с плохим ответом (82% против 41%, р=0,003). Для панели прогноза чувствительности к НАХТ опухолей тройного негативного подтипа выбраны следующие 9 маркеров: PTGER2, GMDS, INTS4L1, MYO15B, CDO1, LAMA3, GFRA1, DLEU2, ABCA3. PTGER2 (простаглндин-Е-рецептор-2) в 2019 году описан Ryan D. et al. как маркер ЭР-негативного базального фенотипа опухолей молочной железы, при которых наблюдается высокая безметастатическая и общая выживаемость пациенток. В нашем исследовании неметилированное состояние промотора PTGER2, потенциально ассоциированное с его высокой экспрессией, характерно для опухолей тройного негативного подтипа с хорошим ответом на НАХТ (11% против 60% в группе образцов с плохим ответом на НАХТ). Для гена цистеиндегидрогеназы 1-го типа (CDO1) ранее уже была показана высокая (60%) частота аномального метилирования, сопровождающегося потерей экспрессии, при раке молочной железы (Jeschke J. et al., 2013). Аномальное метилирование CDO1 коррелировало с прогрессией заболевания и неблагоприятным исходом. Восстановление функции фермента в клетках РМЖ приводило к подавлению их роста и жизнеспособности, а также к повышению чувствительности к антрациклинам. Обработка клеток с аномальным метилированием CDO1 деметилирующим агентом 5-азацитидином приводила к восстановлению экспрессии гена и повышению чувствительности к антрациклинам. В нашей выборке образцов РМЖ тройного негативного подтипа аномальное метилирование CDO1 также достоверно чаще наблюдается в опухолях с плохим ответом на НАХТ (57% против 9% в группе опухолей с хорошим ответом на НАХТ). Таким образом, несмотря на непредвзятый отбор (на основании результатов широкогеномного анализа метилирования ДНК) маркеров чувствительности РМЖ к НАХТ, проведенный нами в рамках настоящего исследования, анализ литературных данных показал, что для целого ряда маркеров из нашего набора другими авторами также выявлены ассоциации с особенностями фенотипа опухоли и/или её чувствительности к химиотерапии, причем направления изменений экспрессии маркерных белков в ранее проведенных исследованиях совпадают с направлениями, которые можно предполагать, исходя из выявленных нами аномалий метилирования промоторов соответствующих генов. Это наблюдение позволяет ожидать, что формируемые нами системы маркеров аномального метилирования ДНК для определения потенциальной чувствительности опухолей молочной железы к НАХТ покажут высокую диагностическую ценность в клинических испытаниях, поскольку они не только базируются на наиболее информативных маркерах, непредвзято выявленных в разведочной выборке значительного размера, но и ассоциированы с биологическими функциями, нарушения которых приводят к изменению ответа опухолей на химиотерапию. Параллельно проведена разработка метода количественной многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени (МЧ-кПЦР) и, по мере готовности собственно метода, частоты метилирования некоторых кандидатных маркеров в исследуемых выборках образцов определялись уже с использованием этого подхода. Дизайн и отработка условий тест-системы мультиплексной МЧ-кПЦР проведены с использованием модифицированного коллективом комплекта программного обеспечения MPprimer. Осуществление МЧ-кПЦР предполагает, кроме использования комплектов праймеров, комплектов соответствующих целевым участкам генома TaqMan-зондов для проведения ПЦР в формате детекции сигналов в реальном времени. Программа Pimer3, используемая в алгоритме MPprimer, в принципе позволяет дизайнировать TaqMan-зонды, однако такая опция не включена в базовый алгоритм MPprimer. Нами внедрена такая опция и добавлена проверка возможностей образования димеров праймеров с учетом последовательностей дизайнируемых зондов. В многолокусных ПЦР, особенно в формате с использованием TaqMan-зондов, значительно повышается вероятность образования димеров олигонуклеотидов, что отрицательно сказывается на эффективности и специфичности амплификации. Для уменьшения вероятности образования димеров целесообразно использовать короткие последовательности TaqMan-зондов. Кроме того, короткие зонды минимизируют расстояние между репортером и квенчером, что должно положительно сказываться уменьшением фоновой флуоресценции. Однако более короткие зонды имеют более низкие температуры плавления, что приводит к невозможности дизайна коротких зондов, адекватных температурному режиму разрабатываемых нами систем. Решение задачи дизайна коротких зондов с повышенной фактической температурой плавления мы реализовали за счет LNA-модификации 3-6 оснований в составе зондов. LNA (locked nucleic acid) представляют собой рибонуклеотиды, в которых остатки рибозы модифицированы дополнительной связью между кислородом в 2'-положении и углеродом в 4'-положении сахара. LNA-нуклеотиды в составе олигонуклеотидов сохраняют способность к Уотсон-Криковским взаимодействиям, причем температура плавления модифицированных таким образом олигонуклеотидов (в нашем случае - TaqMan-зондов) значительно повышается. Для успешного внедрения метода МЧ-кПЦР разработаны протоколы лабораторного анализа и in silico анализа полученных результатов. При разработке лабораторного протокола прежде всего принимали во внимание высокий CG-состав анализируемых участков генома, мультиплексный формат реакции, ограниченный объём биологического материала, доступного для исследования (биоптаты опухолей молочной железы). Для определения минимального приемлемого количества входной ДНК использовали серию двукратных разведений от 100 до 0,05 нг. Эксперименты показали возможность использования 6 нг входной ДНК без ущерба для качества анализа. Разработанная на этапе 2019 года технология мультиплексной МЧ-кПЦР (на базе количественной ПЦР в реальном времени) с использованием для детекции продуктов ПЦР нескольких TaqMan-зондов с различными флуорофорами-репортерами имеет самостоятельное научное и практическое значение, поскольку её внедрение впервые позволит получать достоверные, точные результаты измерения состояния метилирования участков CpG-островков в больших выборках клинического материала в целях научных и диагностических исследований. Разработанная технология мультиплексной МЧ-кПЦР позволяет детектировать пороговый цикл кинетической кривой каждого продукта ПЦР с образца, обработанного метилчувствительным ферментом, и интактного, что, в сочетании с данными для ПЦР-продукта положительного контроля позволяет проводить более точную оценку количества негидролизованной матрицы, а также проводить оценку статуса метилирования целевых локусов независимо друг от друга. Проведение ПЦР в формате реал-тайм обеспечивает защиту от кросс-контаминации продуктами ПЦР, что особенно важно при работе с образцами, полученными из парафиновых блоков (подразумевает увеличение количества циклов ПЦР по причине низкой концентрации ДНК). Описанные ранее в литературе подходы к МЧ-кПЦР (Krygier et al., 2016, Gijselinck et al., 2016, Amenya et al., 2016) страдают недостаточностью внутренних контролей МЧ-ПЦР, а также не позволяют мультиплексировать несколько целевых локусов в одной пробирке при использовании TaqMan-зондов. В мире продолжаются попытки создания систем многолокусной МЧ-кПЦР со свойствами, аналогичными нашей разработке, однако до сих пор они не очень успешны (Blais J. et al., 2019). В недавно опубликованном протоколе МЧ-кПЦР (Beikircher G. et al., 2018) по-прежнему предлагается использовать для детекции кинетики реакции интеркалирующие красители, что не позволяет мультиплексировать анализируемые локусы в одной пробирке, а контроли полноты гидролиза и эффективности МЧ-ПЦР проводятся в отдельных пробирках, что создает опасность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов МЧ-ПЦР. Успешно проведенная нами в 2019 году разработка пилотных диагностических тест-систем на основе маркеров метилирования ДНК в формате мультиплексной МЧ-кПЦР обеспечивает логичный переход к выполнению задач 2020 года. Все задачи второго года проекта полностью выполнены. Результаты опубликованы в виде статьи "Genome-wide methylotyping resolves breast cancer epigenetic heterogeneity and suggests novel therapeutic perspectives" в журнале Epigenomics (IF= 4.404; WoS Q1), двух статей в отечественных журналах (РИНЦ), двух тезисов докладов с индивидуальными DOI в журнале Annals of Oncology (IF= 14.196; WoS Q1). На этапе рецензирования в редакции журнала Scientific Reports находится подготовленная в 2019 году рукопись статьи "DNA methylation markers panel can improve prediction of response to neoadjuvant chemotherapy in luminal B breast cancer". Результаты были также представлены в формате устных и стендовых докладов (всего 7), из них три - на зарубежных конференциях. В научно-популярной форме информация о выполнении проекта в 2019 году была представлена на пресс-конференции в ТАСС 14 января 2019 г., на сайтах РНФ, газеты «Московский комсомолец», Медицинского информационного агентства, «Медвестник»; ссылки: https://www.mk.ru/moscow/2019/01/22/moskovskie-vrachi-nauchilis-predskazyvat-effektivnost-khimioterapii-pri-rake-molochnoy-zhelezy.html https://medbook.ru/news/35282 https://medvestnik.ru/content/news/Uchenye-MGNC-razrabotali-epigenomnuu-klassifikaciu-raka-molochnoi-jelezy.html http://www.rscf.ru/ru/node/uchenye-mgnts-razrabotali-epigenomnuyu-klassifikatsiyu-raka-molochnoy-zhelezy?sphrase_id=33315

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В соответствии с планом на 2020 год, были выполнены следующие работы и получены научные результаты: В 2020 году на выборке 200 образцов core-биопсии (по 100 ТН РМЖ и LumB РМЖ) с известным ответом на НАХТ проведена работа по определению параметров диагностической ценности разработанных тест-систем многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени (МЧ-кПЦР). Тест-системы были сформированы на основе выявленных на предыдущем этапе выполнения проекта потенциальных маркеров метилирования ДНК, различающих опухоли молочной железы, чувствительные и нечувствительные к неоадъювантной (предоперационной) химиотерапии. Анализ образцов ДНК проводили тест-системами многолокусной (пятицветной) МЧ-кПЦР в реальном времени с зондами, в которых в качестве репортеров выступали флуорофоры FAM, HEX, ROX, Cy5 и Cy5.5. Таким образом, в каждой тест-системе определялись кинетические кривые амплификации пяти локусов генома: трех исследуемых (участки CpG-островков генов, выбранные в качестве маркеров метилирования на предыдущем этапе работы) и двух контрольных - внутреннего контроля (PC - положительный (Positive Control) и контроля полноты гидролиза (DC - Digestion Control). Локусы для положительного контроля выбрали из участков генома, не содержащих сайтов узнавания используемой рестриктазы. Контроли полноты гидролиза выбирали из участков генома, содержащих каждый по 3 сайта узнавания рестриктазы и неметилированных как в норме, так и в опухолях. С использованием разработанной технологии и специально созданной лабораторной информационной системы анализа результатов МЧ-кПЦР, обеспечивающей адекватный, безошибочный и своевременный обсчет большого количества результатов, измерены количественные показатели метилирования кандидатных маркеров чувствительности опухолей к неоадъювантной химиотерапии, проведено определение параметров диагностической ценности тест-систем маркеров метилирования ДНК с точки зрения предсказания эффективности НАХТ рака молочной железы тройного негативного и LumB подтипов. Диагностическая ценность разработанных тест-систем мультиплексной МЧ-кПЦР в отношении определения принадлежности образца к группе с наличием или отсутствием ответа на НАХТ (величина AUC–area under curve) охарактеризована с помощью ROC–анализа и, кроме AUC, включает показатели чувствительности и специфичности, предсказательной ценности положительных (PPV) и отрицательных результатов (NPV). Результаты для каждой из групп опухолей (ТН РМЖ и LumB РМЖ) представлены в табличном и графическом виде. Наилучшие показатели диагностической ценности среди индивидуальных маркеров, с точки зрения предсказания чувствительности к НАХТ опухолей тройного негативного подтипа, показали маркеры метилирования генов TMEM132D, ABCA3, DPYS, MYO15B, GMDS, CDO1, SFRP2, DLEU2, IRF4, TMEM132C, VGLL4 (значения AUC в порядке убывания от 0,72 до 0,6). Для группы LumB РМЖ наиболее информативным оказались маркеры метилирования генов LTBR, VGLL4, DPYS, CLEC14A и TTC34 (AUC в порядке убывания от 0,69 до 0,56). Полученные показатели диагностической ценности единичных маркеров нельзя считать достаточными для их применения в клинической практике. Повышение диагностической ценности достигается объединением информативных маркеров в системы (панели). Объединение изучаемых маркеров в системы позволяет повысить показатель AUC для предсказания чувствительности к НАХТ опухолей тройного негативного подтипа до 0,83 (панель генов TMEM132D и MYO15B, с чувствительностью и специфичностью выше 0,75), а для группы LumB РМЖ – до 0,76 (панель генов TTC34, LTBR, CLEC14A, с чувствительностью 0,7 и специфичностью 0,79). На этапе исследований прошлого года, выполненных не количественным методом МЧ-кПЦР, а качественным методом анализа МЧ-ПЦР, универсальным маркером, показавшим высокие значения диагностической ценности в обеих группах - ТН и LumB РМЖ – был признан ABCA3, который был включен в тест-системы для прогноза эффективности НАХТ для обоих типов РМЖ. По результатам количественного анализа метилирования, проведенного в 2020 году для расширенной выборки образцов биоптатов, удовлетворительные диагностические показатели сохранились для этого маркера только для группы тройных негативных опухолей (AUC=0,69, чувствительность 0,8, специфичность 0,6). Транспортер ABCA3, с одной стороны, способен активно выводить из клетки химиопрепараты, с другой – нарушение его экспрессии в опухолях молочной железы статистически достоверно чаще наблюдается в РМЖ с метастазами в лимфоузлы и является независимым значимым маркером риска рецидивирования опухоли. В то же время, нам не удалось найти опубликованных работ о роли ABCA3 в формировании устойчивости РМЖ к неоадъювантной химиотерапии. По результатам исследования методом МЧ-кПЦР универсальность потенциала предсказания эффекта НАХТ для обеих групп опухолей – ТН и LumB РМЖ – показана только для маркеров метилирования VGLL4 и DPYS, что может отражать их универсальную роль в обеспечении реализации программируемой клеточной гибели, независимо от типа опухоли и характера химиотерапии. В 2020 году было также проведено ретроспективное исследование операционных образцов пациенток, для которых ранее были получены данные о метилировании в образцах core-биопсии до лечения, для определения отношения статуса метилирования маркеров до и после лечения. Исследование проведено с использованием тест-систем МЧ-кПЦР, идентичных используемым при выполнении задачи по анализу образцов core-биопсии РМЖ от тех же пациенток, для обеспечения общего формата получаемых данных. Результаты проанализированы в единой лабораторной информационной системе. Полученные результаты говорят о кардинальном изменении профилей количественного метилирования по всем примененным тест-системам МЧ-кПЦР, что предполагает невозможность использования архивных коллекций операционного материала опухолей в исследованиях по разработке предиктивных маркеров метилирования ДНК, направленных на определение потенциальной чувствительности опухолей к НАХТ на основе анализа биопсийного материала, полученного до лечения. Однако такой предварительный вывод имеет серьезные ограничения. Следует учитывать, что в состав панелей метилирования, примененных в нашем исследовании, вошли в основном гены, которые, несмотря на непредвзятый отбор (на основании результатов широкогеномного анализа метилирования ДНК), ассоциированы с особенностями фенотипа опухоли и/или её чувствительности к химиотерапии (анализ литературы и баз данных - отчет прошлого года). Можно предполагать, что в опухолях эволюция клонов в процессе НАХТ приводит к значительному изменению наблюдаемых показателей метилирования промоторов таких генов, играющих важную роль в формировании фенотипа опухоли, поэтому переносить полученное нами наблюдение на весь эпигенетический ландшафт опухолей и делать более широкие выводы о динамике метилирования промоторов генов в результате НАХТ преждевременно. Информацию для обобщающих выводов о динамике эпигенетического ландшафта в процессе НАХТ может предоставить исследование, проведенное не на единичных маркерах, а методами широкогеномного анализа метилирования ДНК. Широкогеномные исследования ДНК до и после неоадъювантной химиотерапии РМЖ в мире начали проводить совсем недавно (например, «Genome-wide DNA methylation signatures to predict pathologic complete response from combined neoadjuvant chemotherapy with bevacizumab in breast cancer», PLoS One, 2020), причем не на опухолевых образцах, а на образцах крови пациенток. Вероятно, мы располагаем уникальной коллекцией образцов биоптатов молочной железы, полученных до НАХТ, и операционных образцов опухолей тех же пациенток после лечения. Исследование этой коллекции методом широкогеномного бисульфитного секвенирования может стать одной из задач заявки на продление настоящего проекта. Весь объем работ, запланированный на 2020 год, полностью выполнен. Полученные научные и технические результаты позволили достичь заявленной конечной практической цели реализации проекта - создания лабораторного диагностического инструмента для персонализации назначения неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы.