Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Получена линейка (фото)химически структурированных ксенопротезов на основе децеллюляризированных бычьих перикардов. Коллективом исполнителей была разработана методика децеллюляризации бычьих перикардов в растворе 1 М NaOH и 0,85 M Na2SO4 в качестве стабилизирующей добавки. Результаты децеллюляризации соответствовали требованиям, предъявляемым к ксенопротезам. Далее на основе доступной научно-технической информации и проведенных экспериментальных исследований были подобраны и оптимизированы варианты методик структурирования децеллюляризированных бычьих перикардов с использованием сшивающих агентов различной природы: диизоцианат, эпоксисоединение, карбодиимид, генипин, рибофлавин. Фотоструктурирование ткани перикарда с участием рибофлавина осложнено недостаточной оптической прозрачностью в области поглощения фотоинициатора. Для оценки сшивающего потенциала рибофлавина были использованы оптически прозрачные пленки, полученные путем гомогенизации и диспергирования децеллюляризированной ткани в 3% уксусной кислоте с последующей воздушной сушкой. 2. Проведены исследования цитотоксичности ксенопротезов. Установлены уровни цитотоксичности ксенопротезов при помощи набора методов, включая измерение МТТ-редуктазной и лактатдегидрогеназной активности клеток и морфологической оценки выживаемости с использованием прижизненой окраски живых и поврежденных клеток. Во всех случаях при контактном взаимодействии клеток с поверхностью образцов не было выявлено морфологических отклонений от нормы, как и признаков лизиса клеточного содержимого по высвобождению лактатдегидрогеназы в культуральную среду. Измерение цитотоксичности растворимых компонентов ксенопротезов (вытяжек) МТТ-анализом свидетельствовало об отсутствии цитотоксического эффекта от образцов, структурированных карбодиимидом и эпоксисоединением. При использовании в качестве сшивающих агентов генепина, диизоцианата и рибофлавина уровень цитотоксичности находился в диапазоне умеренных значений. 3. Исследована протеолитическая устойчивость ксенопротезов in vitro в растворах коллагеназы и папаина. Протеолитическую деградацию оценивали гравиметрически по потере массы образцов в результате ферментативного гидролиза. Ферментативный гидролиз проводили in vitro в растворах коллагеназы A из Clostridium histolyticum и папаина (Кариазима). Коллагеназная устойчивость была наибольшей при использовании эпоксисоединения и наименьшей – с генипином. Устойчивость к папаину коррелировала с устойчивостью к коллагеназе, за исключением образцов, структурированных карбодиимдом, что можно объяснить формированием пептидной связи, не нарушающей субстратной специфичности. Таким образом, использование сшивающих агентов различной природы позволяет варьировать протеолитическую устойчивость ксенопротезов, тем самым, при необходимости, продлевая или укорачивая их срок службы. 4. Проведены механические испытания на одноосное растяжение ксенопротезов. Из результатов механичесих испытаний следует, что использование разных сшивающих агентов позволяет управлять биомеханическими свойствами децеллюляризированных ксенопротезов. Причем децеллюляризированные бычьи перикарды, структурированные карбодиимидом и генипином, проявили наименьшую анизотропию механических свойств. Образец, структурированный рибофлавином, продемонстрировал недостаточные прочностные характеристики для поставленных в рамках проекта задач, поэтому на данном этапе был исключен из линейки ксенопротезов. 5. Изучены локальные механические характеристик и микроструктурная организация ксенопротезов с использованием зондовых методов. Локальные механические характеристики образцов определены методов наноиндентирования. Показано, что средняя величина модуля Юнга поверхности образцов возрастает (p < 0,05) после структурирования диизоцианатом, карбодиимидом и генипином, в особенности под действием диизоцианата. Однако изменение величины под действием эпоксисоединения было незначительным (p = 0,75). С помощью атомно-силовой микроскопии установлено, что топология и толщина коллагеновых фибрилл, а также их упорядоченность меняется в зависимости от типа сшивающего агента. Толщина фибрилл неструктурированного перикарда составляет 90-130 нм. Также обнаружены фибриллы толщиной 20 нм, заякоренные на поверхности образцов, которые ввиду особенностей измерения сложно визуализировать. Диизоцианат сформировал из них глобулярные структуры на поверхности образцов с образованием компактной организации. Эпокисоединение сформировало губчатую структуру, генипин незначительно повлиял на микроструктурную организацию образца, однако увеличил толщину фибрилл до 120-160 нм.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Проведены всесторонние исследования микроструктурной реорганизации децеллюляризированных бычьих перикардов в результате химического структурирования различными сшивающими агентами (диизоцианатом, эпоксисоединением, карбодиимидом или генипином). Образцы представляли собой бесклеточные губки коллагеновой природы с включениями эластических волокон. В результате химического структурирования происходила структурная реорганизация, утолщение и параллелизация хода коллагеновых септ, наиболее выраженная в карбодиимидной и генипиновой группах. В группах эпоскисоединения, карбодиимида и генипина выявлена тенденция к удлинению пор, причем в карбодиимидной группе средний размер пор уменьшился вдвое, а в диизоцианатной – увеличился. Методом сканирующей электронной микроскопии выявлены существенные топологические различия между образцами. Структурирование диизоцианатом и карбодиимидом привело к формированию шероховатостей, эпоксисоединение увеличило порозность структуры, генипин привел к утолщению фибрилл с параллелизацией хода. Известно, что порозность структуры определяет тенденцию к рецеллюляризации, приток кислорода и отток метаболитов. Архитектоника влияет на склонность материала к кальцификации. Таким образом, установленные структурные различия могут служить инструментом персонализации для целей реконструктивной хирургии. 2. Проанализирован метаболический статус мезенхимных стромальных клеток, культивированных на поверхности различных модификаций ксеноперикардов. Проведенное FLIM исследование показало, что времена жизни флуоресценции свободной и связанной формы НАДН клеток, посаженных на разные образцы, статистически не отличались. Однако происходило достоверное снижение вклада связанной формы НАДН и свободной формы ФАД при культивировании на структурированных образцах. На интактных образцах наблюдалась обратная тенденция. Данные могут свидетельствовать об интенсификации окислительного фосфорилирования и запуске биосинтетических процессов вследствие структурирования. Данное свойство ксеноперикардов может быть использовано для предтрансплантационной адаптации МСК к гипоксическим условиям, сопряженным с хирургическим вмешательством. 3. Исследовано термическое поведение образцов. Измерение температуры сваривания, термогравиметрический и дифференциальный термический анализ выявили структурные изменения в результате химического структурирования. Наименьший эффект наблюдали при использовании эпоксисоединения, наибольший – в генепиновой группе. 4. Проведены исследования влияния химической модификации ксеноперикардов на тканевую реакцию и биорезорбцию при имплантации лабораторным животным (мышам). Разработан протокол определения кинетики их биодеградации in vivo с использованием флуоресцентных методов диагностики. Признаки токсического действия материала скаффолдов на паренхиму почек в виде дистрофии или некроза обнаружены не были. Интактный образец подвергался наибольшей степени резорбции за счет макрофагальных элементов, что приводило к формированию относительно толстой капсулы и фиброзных септ с кровеносными сосудами. Из структурированных образцов наилучшие интеграционные свойства проявили ксеноперикардиальные матриксы, структурированные эпоксисоединением и карбодиимидом. Однако, структурирование карбодиимидом с формированием пептидной связи не предотвращало биодеградации образцов. Также разработан протокол визуализации процесса ремоделирования ксенотрансплантатов с использованием методов регистрации сигнала автофлуоресценции и генерации второй гармоники. Анализ выявил различия в структурных изменениях образцов после подкожной имплантации мышам. В частности, установлено, что структурирование затрудняет ремоделирование ткани. Данные времени жизни автофлуоресценции отображали изменения физико-химических свойств микроокружения имплантатов. 5. Разработаны тканеинженерные конструкции для хирургической терапии ректовагинальных свищей на основе структурированных децеллюляризированных бычьих перикардов и фибринового гидрогеля с тубулоподобными структурами, сформированными МСК жировой ткани человека, дифференцированными в эндотелиальном направлении. Для формирования гидрогеля использовали ПЭГилированный фибриноген. Иммуноцитохимический анализ и витальное окрашивание выявили высокую жизнеспособность клеток в совокупности с эндотелиальной дифференцировкой и образованием тубулоподобных структур. 6. Разработан подход к направленной модификации децеллюляризированных бычьих перикардов с использованием технологий экстракции в сверхкритическом диоксиде углерода с целью оптимизации биомеханических свойств трансплантатов и достижения характеристик, сопоставимых с нативными тканями. Установлено снижение модуля Юнга при одноосном растяжении в группах эпоксисоединения и генипина, а при наноиндентировании – во всех группах. Сканирующая электронная микроскопия продемонстрировала сохранение структурной целостности образцов, за исключением диизоцианатной группы. Также наблюдалось сохранение сигнала ГВГ, уровня цитотоксичности и коллагеназной устойчивости.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Установлены закономерности интеграции гибридных ксенопротезов и протекания репаративных процессов после тканеинженерной терапии полностенных свищей в ректовагинальных перегородках кроликов. Нами были протестированы децеллюляризированные бычьи перикарды, структурированные генипином, с нанесенным слоем инкапсулированных в фибриновый гидрогель мезенхимных стромальных клеток, индуцированных в ангиогенном направлении. Имплантация конструкций в дефект ректовагинальной перегородки кроликов привела к полной резорбции перикарда спустя 30 дней и способствовала заживлению ректовагинальных перегородок за счет субституции с формированием рубцовой ткани. В реконструированных путем иссечения свища с ушиванием раны образцах наблюдалось резко выраженное воспаление с формированием абсцессов. 2. Проведены механические испытания на одноосное растяжение до разрыва эксплантатов ректовагинальных перегородок кроликов после формирования свищей и последующей тканеинженерной терапии или реконструкции путем иссечения свища с ушиванием раны. Определены модуль Юнга, значение максимального напряжения разрыва и растяжение при разрыве образцов. Установлено, что в результате реконструкции ректовагинальных перегородок существенно возрастает напряжение разрыва и растяжение при разрыве, что связано с формированием рубцовой ткани. При этом значение модуля Юнга сохраняется, независимо от способа реконструкции. 3. Проанализирован метаболический статус мезенхимных стромальных клеток, в том числе индуцированных в остеогенном направлении, культивированных на ксеноперикардиальных пластинах, после подкожной имплантации мышам. Были использованы ксеноперикардиальные пластины, структурированные с использованием линейки химических сшивателей: диизоцианата, эпоксисоединения, карбодиимида и генипина. Установлено, что через 6 недель после имплантации образцы, структурированные гинипином, полностью биодеградировали. Время-разрешенная флуоресцентная микроскопия (FLIM) показала увеличение флуоресценции свободной формы НАДН на имплантированных образцах всех типов при увеличении длительности имплантации, как в дифференцированных, так и в недифференцированных клетках. Изменения, вероятно, связаны с перемещением образцов с клетками в гипоксические условия и переходом на гликолитический метаболизм. Наибольший вклад флуоресценции свободной формы НАДН был у недифференцированных клеток, растущих на перикардиальных пластинах, структурированных карбодиимидом и эпоксисоединением. Данное свойство ксеноперикардов может быть использовано для приспособления имплантируемых клеток к гипоксическим условиям, сопряженным с хирургическим вмешательством. Отмечено увеличение вклада флуоресценции связанной формы ФАД клеток на всех образцах при увеличении срока имплантации, что может быть обусловлено запуском биосинтетических процессов. Характер изменений был одинаковым для дифференцированных и недифференцированных клеток. 4. Проанализирована структура ксеноперикардиальных пластин после подкожной имплантации лабораторным мышам методом оптической когерентной томографии. Установлены перестройки архитектуры коллагена, индуцированные структурирующими агентами. Уровень сигнала был несколько ниже с мезенхимными стромальными клетками, индуцированными в остеогенном направлении. При исследовании образцов через 3 и 6 недель после имплантации было обнаружено, что количество пор в структуре всех образцов уменьшается. Также уменьшается интенсивность сигнала, увеличивается гетерогенность, а его затухание происходит быстрее. Результаты ОКТ согласуются с данными гистологических исследований, полученными в ходе выполнения задач 2019 года. В частности, усиление затухания сигнала и его гетерогенность могут свидетельствовать о возникновении очагов кальциноза. Установлен схожий с результатами гистологических исследований характер распределения пор и перестройки архитектуры коллагена, индуцированные структурирующими агентами. 5. Установлено, что обработка химически структурированных децеллюляризированных ксеноперикардов сверхкритическим диоксидом углерода наряду с уменьшением жёсткости способствует улучшенной интеграции в ткани при гетеротопической имплантации крысам. В ответ на имплантацию образцов формировалась сходная тканевая реакция между интактными и обработанными образцами, без качественных различий в составе воспалительного инфильтрата, формирования грануляций и их последующего созревания. Однако на сроке 12 недель был выявлен более низкий уровень кальцификации имплантатов, обработанных в среде скСО2. 6. Проведены всесторонние исследования влияния протоколов децеллюляризации с применением экстракции в среде сверхкритического СО2 на свойства аортального клапана барана. Показано, что с использованием гибридного протокола децеллюляризации корня аорты овцы, включающего этапы прекондиционирования в растворе детергентов и сверхкритическую флюидную экстракцию (T=37 ⁰C, P=25 МПа, t=3 ч), возможно достичь удовлетворительной децеллюляризации, которая значительно превосходит результат сверхкритической флюидной экстракции с использованием в качестве сорастворителя этанола. Модуль Юнга створок аортального клапана при этом увеличивается менее значительно по сравнению с протоколом, включающим щелочную предобработку. Полученные препараты обладали низкой цитотоксичностью и успешно интегрировались в ткани при гетеротипической имплантации крысам. Таким образом, в результате выполнения проекта нами изучены особенности интеграции гибридных ксенопротезов на основе децеллюляризированного бычьего перикарда. С их применением получены результаты, свидетельствующие о безопасности и эффективности хирургического лечения ректовагинальных свищей, на основе которых подготовлена заявка в локальный этический комитет Сеченовского Университета для запуска клинического исследования. Также разработан метод персонализации ксеноперикардиальных пластин и корней аорты, предназначенных для целей реконструктивной хирургии, на основе сверхкритической флюидной экстракции.